PLoS ONE: Evaluering af Cancer Stem Cell Markers CD133, CD44, CD24: Foreningen med AKT Isoformer og Stråling Resistance i Colon Cancer Cells

Abstrakt

De celleoverfladeproteiner CD133, CD24 og CD44 er formodede markører for kræft stamceller populationer i tyktarmskræft, der er forbundet med aggressive typer kræft og dårlig prognose. Det er vigtigt at forstå, hvordan disse markører kan forudsige behandlingsresultater, bestemmes af faktorer som radioresistance. Anvendelsesområdet for denne undersøgelse var at vurdere sammenhængen mellem EGFR, CD133, CD24, og CD44 (herunder isoformer) ekspressionsniveauer og stråling følsomhed, og desuden analysere indflydelsen af ​​Akt isoformer på ekspressionsmønstre for disse markører, for bedre at forstå den underliggende molekylære mekanismer i cellen. Tre coloncancer cellelinier blev anvendt, HT-29, DLD-1, og HCT116, sammen med DLD-1 isogene

AKT

knock-out cellelinjer. Alle tre cellelinjer (HT-29, HCT116 og DLD-1) udtrykte varierende mængder af CD133, CD24 og CD44 og top ti procent af CD133 og CD44-udtrykkende celler (CD133

høj /CD44

høj) var mere modstandsdygtige over for gammastråling end ti procent med lavest udtryk (CD133

lav /CD44

lav). Den AKT ekspression var lavere i den del af celler med lav CD133 /CD44. Udtømning af Akt1- eller AKT2 hjælp knock out celler viste for første gang, at CD133 ekspressionen var forbundet med Akt1 men ikke AKT2, mens CD44-ekspression var påvirket af tilstedeværelsen af ​​enten Akt1- eller AKT2. Der var flere gener i cellens vedhæftning vej, som havde signifikant højere udtryk i

AKT

2 KO celle-line i forhold til

AKT

en KO-celle-line; dog vigtige gener i epitelial til mesenkymale overgang sti (

CDH1

,

VIM, TWIST1, SNAI1, SNAI2, ZEB1, ZEB2, FN1, FOXC2

CDH2)

gjorde ikke være forskellige. Vores resultater viser, at CD133

høj /CD44

højt udtrykkende colon cancerceller er forbundet med AKT og øget resistens stråling, og at forskellige AKT isoformer har forskellige virkninger på ekspression af cancer stamcellemarkører, hvilket er en vigtig overvejelse når du målretter AKT i et klinisk miljø

Henvisning:. Sahlberg SH, Spiegelberg D, Glimelius B, Stenerlöw B, Nestor M (2014) Evaluering af Cancer Stem Cell Markers CD133, CD44, CD24: Foreningen med AKT Isoformer og Stråling Modstand i Colon Cancer Cells. PLoS ONE 9 (4): e94621. doi: 10,1371 /journal.pone.0094621

Redaktør: Andrew Yeudall, Virginia Commonwealth University, USA

Modtaget: September 15, 2013; Accepteret: 19 marts 2014; Udgivet 23. april, 2014

Copyright: © 2014 Sahlberg et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er finansieret af tilskud fra den svenske Cancer Society, www.cancerfonden.se. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kolorektal cancer er en af ​​de mest almindelige diagnosticerede maligniteter i verden. Adskillige studier har identificeret subpopulationer af colorektale cancerceller, der er mere resistente over for kræftbehandling såsom kemoterapeutika og bestråling [1], [2]. Vellykket behandling er afhængig af elimineringen af ​​disse meget resistente underpopulationer, og ikke blot det primære tumor masse. Disse celler betegnes ofte som cancer stamceller eller tumor-initierende celler, og flere celleoverflademarkører er blevet vist at blive udtrykt i disse cellepopulationer [3]. CD133, CD44 og CD24 er tre foreslåede stamcelle markører i kolorektal cancer, men demotiverende, adskiller fordelingen mellem patienter og tumorcellelinjer [4]. Det er derfor af stor interesse for at forstå deres funktion, og hvordan de biomarkører interagerer med hinanden.

CD24 er et celleoverfladeprotein, som er forankret på den udvendige side af plasmamembranen. Det menes at spille en væsentlig rolle i celledifferentiering og udtrykkes også i celler involveret i immunsystemet, såsom B-lymfocytter, hvor det positivt regulerer proliferationen af ​​aktiverede T-celler. CD24-ekspression er også beskrevet i centralnervesystemet [5]. Fordelingen i colorektal cancer er tvist, selvom tidligere studier har vist, at mellem 50 og 68% af patienter med kolorektale cancere udtrykte CD24 i høj grad [5], [6], og endvidere at CD24 positive subpopulationer fra coloncancercelle -lines besidder stamcelle-lignende egenskaber [7]. I modsætning hertil har tumorfremkaldende celler fra hoved-og-hals og brystcancer vist sig at være CD24 negative [8], [9].

CD133 (også kaldet Prominin-1) menes at være forbundet med tumorigenicitet og progression af sygdommen. Opreguleringen af ​​CD133 i colorektal cancer korrelerer stærkt med dårlig prognose og synkront levermetastaser [10], selv om den præcise rolle og funktion CD133 er ukendt.

CD44 spiller en rolle ved lettelse af celle til celle og celle-matrix interaktioner gennem dets affinitet til hyaluronsyre og er involveret i celle-adhæsion og samlingen af ​​vækstfaktorer på celleoverfladen. CD44 er kodet af et enkelt gen, herunder 20 exoner. Standardformularen (benævnt CD44s) består af exon 1-5 og 15-20. De variable exoner identificeres som v1-v10 hhv. Den differentielle udnyttelse af de 10 variant exoner genererer flere CD44 varianter (CD44v) med forskellige kombinationer af variant exon produkter. Forskellige isoformer af CD44 opstår ved indsætning af en eller flere af de variante exoner i den fælles backbone deles af alle former for CD44. Den rolle, som disse variante isoformer er ikke fuldt forstået, selvom nogle menes at mediere et kritisk trin i tyktarmskræft metastase [8], [11], [12]. CD44 kan co-immunpræcipiteret familien af ​​ErbB-receptor-tyrosinkinaser, såsom den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) og den interagerer også med HER2, HER3 og HER4 [8], [13]. EGFR menes at spille en vigtig rolle i reguleringen af ​​og vedligeholdelse af cancer stamceller, primært gennem nedstrøms signalering via Phospho-inositol 3-kinase (PI3K) /AKT-vejen [14], [15].

AKT er en serin /threoninkinase med tre forskellige isoformer, Akt1, AKT2 og Akt3, udtrykt fra tre separate gener og aktiveres af mange stimuli, såsom flere vækstfaktorreceptorer (for eksempel EGFR), B- og T-celle-receptorer. Det har en central rolle i mange cellulære funktioner, der er ansvarlige for proliferation, overlevelse, vækst, anti-apoptose, glucoseoptagelse, metabolisme, angiogenese og radioresistance [16]. AKT menes også at være involveret i epitelial til mesenkymale overgang (EMT) vej, som fører til øget motilitet, reduceret intercellulær adhæsion, tumor progression og malign transformation. EMT vej er derfor involveret i kræftcellen invasion og metastase [17]. Induktorer af EMT, såsom receptortyrosinkinase ligander eller transformerende vækstfaktor beta (TGFp), Wnt og Notch, udløser en kaskade af celle-signalering, der fører til undertrykkelse af celleadhæsion-protein E-cadherin. Processen involverer opregulering af direkte agerende transskriptionelle repressorer såsom Snail, Slug, Forkhead box C2 og Zeb1, Zeb2 samt Twist og E47, som indirekte undertrykke E-cadherin. Andre markører af EMT er N-cadherin, vimentin og fibronectin-1, som udtrykkes i mesenkymceller [18]. EMT har også vist sig at være involveret i cancer stamceller-celler, hvor colon cancerceller med en høj ekspression af CD133 /CD44 viste EMT efter langtidsdyrkning [18], [19].

er blevet foreslået AKT skal co-udtrykkes med CD133, give CD133 udtrykkende celle population med en højere modstandsdygtighed over for kemoterapeutika, men er ikke kendt detaljer om denne interaktion [20], [21]. CD44 menes at negativt korrelere med AKT [22]. Imidlertid har flere undersøgelser vist, at AKT er stedet phosphoryleret når stimulerende CD44 med ligand, hvilket medfører en celle-overlevelse virkning [23] – [25], og det er sandsynligt, at CD44-isoformer har en regulerende rolle at kunne både aktivere og undertrykke aktivering af AKT. Stråling selv har også vist sig at øge ekspressionen af ​​AKT, CD133, og reducere ekspressionen af ​​CD44 i kolorektale cancerceller [26]. Betydningen af ​​de forskellige AKT isoformer på CD133 eller CD44-ekspression er ikke tidligere blevet undersøgt.

Vi har for nylig vist, at både Akt1- og AKT2 er vigtige i respons på stråling [27]. Knocking-enten

AKT

1 eller

AKT

2 eller begge samtidigt, øget stråling følsomhed og DNA dobbelt streng genindtræde sats blev svækket i

AKT

1 /2 KO cellelinje. I den foreliggende undersøgelse har vi undersøgt de forskelle i ekspressionsmønstre for CD133, CD24, CD44 og EGFR i tre tyktarmskræft cellelinjer; HT-29, HCT116 og DLD-1. Vi har også analyseret stråling følsomhed tyktarmskræft celler sorteret for CD133

høj /CD44

høj og CD133

lav /CD44

lav udtryk, og yderligere undersøgt indflydelsen af ​​to AKT isoformer (Akt1 , AKT2) på CD133 og CD44-ekspression, herunder CD44 splejsningsvariant isoformer. Akt3 udtrykkes ikke i de undersøgte cellelinjer, og blev derfor udelukket. Desuden har vi valideret effekten af ​​AKT på genekspression i en storstilet transkriptom analyse af flere veje.

Materialer og metoder

Cell Culture

tyktarmskræft celle- linjer HT-29 og HCT116 blev erhvervet fra The American Tissue Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA), katalognumre ATCC CCI-221 og ATCC CCI-247, hhv. DLD-1 X-MAN isogene cellelinjer blev opnået fra Horizon Discovery Ltd med de forskellige AKT isoformer genetisk bankede-out, katalognummer HD-R00-001, HD-R00-002 og HD-R00-003. Cellerne blev dyrket i 75 cm

2 dyrkningskolber (Nunclon overflade, Roskilde, Danmark) i McCoys 5A-medium (Flow Irvine, UK) med 10% føtalt bovint serum (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA), 2 mM L-glutamin, 100 IU /ml penicillin og 10 ug /ml streptomycin (Biochrom kg, Berlin, Tyskland). Cellerne blev dyrket i en fugtig inkubator med 5% CO

2 ved 37 ° C og trypsiniseret med trypsin-EDTA, 0,25% trypsin, 0,02% EDTA (Biochrom Kg, Berlin, Tyskland).

Cell sortering med flowcytometri

i flowcytometrianalyse de cellelinjer blev høstet ved anvendelse af ikke-enzymatisk celledissocieringsopløsning (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) eller 0,25% trypsin, 0,02% EDTA, (Biochrom kg , Berlin, Tyskland). Efter resuspension af cellerne i celle-kulturmedier blev cellerne talt og vasket i PBS med 0,5% BSA og opsamlet ved centrifugering. Cellerne blev inkuberet i 10 til 30 minutter med de mærkede antistoffer, se tabel 1. Efter antistofmærkning cellerne blev vasket i PBS med 0,5% BSA før flowcytometrisk analyse blev udført på en Sorp BD LSRII (Becton Dickinson Biosciences, San Jose, USA). Døende og døde celler blev farvet med propidiumiodid og udelukket fra analysen. Dubletter og døde celler blev også udelukket ved gating med FSC og SSC. For celle-sortering for klongenicitetsassayet den FACSVantage SE DiVa eller FACSAriaIII Cell sorter (Becton Dickinson Biosciences, San Jose, USA) blev anvendt.

Cell-cycle Analyse

Cellerne blev fikseret med 70% ethanol, 30% PBS og opbevares i -20 ° C i mindst 24 timer. Celler blev centrifugeret i 10 minutter, 2000G i 4 ° C og vasket to gange med PBS før inkubation med 5 ug propidium iod /0,1% NP-40 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) i PBS sammen med 5 ug RNase (Sigma Aldrich , St. Louis, USA) i 30 minutter ved stuetemperatur. Analyse blev foretaget med flowcytometri (BD LSRII Biosciences).

Klonogen Assay

Sammenhængen mellem ekspression af CD133 og CD44 og stråling følsomhed blev evalueret ved at sortere og indsamle CD133

høj /CD44

høje og CD133

lave /CD44

lave udtrykker celler. Celletallet efter sortering blev bestemt med en celletæller (TC20 Automated celletæller, Biorad Life science, Hercules, CA, USA)), og en vis mængde celler var præ-udpladet i 25 cm

2 vævskulturkolber. Den følgende dag blev cellerne udsat for udefra påført stråling under anvendelse af en

137Cs kilde (Best Theratronics Gammacell 40 exactor, Springfield, USA). Efter en inkubationstid periode på 8-14 dage blev cellerne vasket i PBS og fikseret med 99,5% ethanol i 5-10 minutter. Kolonierne blev farvet med Mayers Hæmatoxylin (Histolab Products AB, Västra Frölunda, Sverige) i 20-30 min og derefter skyllet i vand. Kolonier med mere end 50 celler pr koloni blev talt, og udpladningseffektiviteten (PE = antal kolonier i ubehandlede celler /antal celler podet) og overlevelse fraktion (SF = antal kolonier i behandlede celler /antal celler podet × PE) blev beregnet og plottet.

statistiske analyser

flowcytometri analyser blev evalueret ved brug BD FACSDiva-software 7.0 (BD Biosciences). Den klonogene assay data blev behandlet med Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft, Redmond) og grafer blev plottet og analyseret med envejs ANOVA i GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, USA). Et signifikansniveau på 95% blev brugt. Denne analyse vurderet om overlevelse fraktioner af den udstrålede CD133 og CD44 sorterede celler var signifikant forskellige fra hinanden for hver strålingsdosis.

Western Blot

Celler blev dyrket i 3 cm Petriskåle i mindst tre fordoblingstider forudgående lysering eller tre adskilte celle-kulturer af DLD-1 blev sorteret ved flowcytometri (se ovenfor), og volumenet af lysepuffer blev indstillet til antallet af celler indsamlet i hvert hætteglas. Lysater blev fremstillet efter behandling ved at vaske cellerne med iskold PBS efterfulgt af tilsætning af 10 000 000 celler /ml lysepuffer indeholdende 1% Tween-20, 20 mM Tris (pH 8,0), 137 mMNaCl, 10% glycerol, 2 mM EDTA, 1 mM aktiverede natriumorthovanadat (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) og proteaseinhibitorcocktail (P8340, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) og inkubation på is i 30 minutter. Lysater blev centrifugeret i 10 min i 4 ° C. Supernatanten blev overført til nye rør, og pelleten blev kasseret. Proteinkoncentrationen af ​​lysatet blev bestemt ved BCA-proteinassay (Pierce). Lige store mængder protein blev sat på en Tris-acetat 3-8% SDS PAGE-gel (Life Technologies, Carlsbad, CA) og derefter overført til en nitrocellulosemembran (Millipore) ved våd-blotting. Nitrocellulosemembranen blev blokeret i 1 time i 5% BSA, PBS og derefter inkuberet med det primære antistof natten over ved 4 ° C. Antistof specifikt for CD133 /1 (W6B3C1) var fra Miltenyi biotech (Heidelberg, Tyskland) og CD44 (103.014) fra Biolegend (San Diego, CA, USA). Antistoffer mod FoxO3a (2497), phospho-FoxO (2599) og GSK-3beta (9315) og phospho-GSK3b (9323) var alle fra Cell Signaling Technology (Beverly, MS, USA). Akt1 (sc55523 og AKT2 (sc5270) var fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Antistof mod β-actin (A5441) var fra Sigma-Aldrich (St. Louis, USA). Efter vask i PBS med 1% Tween-20 blev membranen inkuberet med peberrodsperoxidase-mærket sekundært antistof (626.520 og 656.120) (Invitrogen, Camarillo, CA, USA) eller (405.405) (Biolegend, San Diego, CA, USA) i 1 time ved stuetemperatur. immunreaktive bånd blev visualiseret i et CCD-kamera (SuperCCD HR, Fujifilm, Japan) efter behandling med Immobilon elektro-kemiluminescerende opløsning (Millipore, Billerica, MA, USA) i 5 minutter.

Microarray Expression Analysis

To separate passager af DLD-1 parental,

AKT

en KO,

AKT

2 KO og

AKT

1/2 KO celler dyrket til 70% konfluens og RNA blev ekstraheret (RNeasy mini-prep, Qiagen, Valencia, CA, USA) RNA-koncentrationen blev målt med ND-1000 spektrofotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, dE) og RNA kvalitet blev vurderet ved anvendelse af Agilent 2100 Bioanalyzer systemet (Agilent Technologies Inc, Palo Alto, CA). 250 nanogram af totalt RNA fra hver prøve blev anvendt til at frembringe amplificeret og biotinyleret sense-streng cDNA fra hele udtrykte genom ifølge GeneChip WT PLUS Reagent Kit brugermanualen (P /N 703.174 Rev 1 Affymetrix Inc., Santa Clara, CA) . GeneChip HTA Arrays (GeneChip Humant Transkriptomet Array 2.0) blev hybridiseret i 16 timer i en 45 ° C inkubator, roteret ved 60 rpm. Ifølge GeneChip Expression Wash, Bejdse og Scan Manuel (PN 702.731 Rev 3, Affymetrix Inc., Santa Clara, Californien) arrays blev derefter vasket og farves ved hjælp af Fluidik Station 450 og endelig scannet ved hjælp af GeneChip Scanner 3000 7G.

Microarray data Analysis

den rå data blev normaliseret i den gratis software Expression Console leveret af Affymetrix (https://www.affymetrix.com) ved hjælp af robuste multi array gennemsnit (RMA) metode først foreslået af Li og Wong i 2001 [28], [29]. Efterfølgende analyse af genekspression data blev gennemført i den frit tilgængelige statistiske computing sprog R (https://www.r-project.org) ved hjælp af pakker fra BioConductor projektet (www.bioconductor.org). For at søge efter de differentielt udtrykte gener mellem forældrenes og

AKT

KO-grupper en empirisk Bayes modereret t-test blev derefter anvendt, ved hjælp af ‘limma pakke [30]. For at løse problemet med flere test, blev p-værdier justeres ved hjælp af metode Benjamini og Hochberg [31]. De normaliserede data blev yderligere vurderet ved anvendelse af ressourcer DAVID Bioinformatik 6,7 til sammen med Kyoto encyklopædi af gener og genomer (Kegg) pathway database (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html) til funktionelt klassificere og klynge generne relateret at epitel til mesenkymale overgang veje [32], [33].

Bekræftelse af

AKT

1 og

AKT

2 Knock-out med PCR

Total RNA blev isoleret fra DLD-1 parental,

AKT

en KO,

AKT

2 KO og

AKT

1/2 KO celler med RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia , CA, USA). cDNA blev syntetiseret ud fra 0,1 pg totalt RNA ved anvendelse RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit med tilfældig hexamer-primere (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) og PCR blev udført med Taq-DNA Polymarese (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) med primere mod Akt1 (fwd: AGGCTCCCCTCAACAACTTC, rev: CTCCTCCTCCTCCTGCTTCT) eller AKT2 (fwd: GGTGCCTCCTGCATGTCC, rev: CCTCTCGGTCTTCATCAGC)

Transfektion med siRNA mod Akt1 i DLD-1 Forældrekontrol Cells

cellerne var. transficeret med siAKT1 lyddæmper (Ambion af Life Technologies, Carlsbad, CA) med Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA) (forstand: 5 ‘GCGUGACCAUGAACGAUUtt og antisense: 5’AACUCGUUCAUGGUCACGCGG). De transficerede celler blev inkuberet i 37 ° C i en CO

2 inkubator i 48 timer, før analysere CD133, CD44 og CD24-ekspression på flowcytometri, se ovenfor.

Re-aktivering af Akt1- eller AKT2 i DLD-1

AKT

1/2 KO celler

DLD-1

AKT

1/2 KO celler dyrket til et sammenløb på 30-50% i antibiotika-fri McCoys celle medier (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) i 24 timer før transfektion. Cellerne blev transficeret med pcDNA3 myr HA Akt1 og pcDNA3 myr HA Akt2 plasmider venligt leveret af William Sellers (Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA) gennem Addgene (Cambridge, MA). Lipofectamine 2000 og OptiMEM var fra Life-teknologier (Carlsbad, CA). De transficerede celler blev inkuberet i 37 ° C i en CO

2 inkubator i 72 timer, før yderligere analyse af CD133, CD44 og CD24-ekspression ved flowcytometri, se ovenfor.

Resultater

CD133, CD44, CD24 og EGFR i Colon cancer Cell-linjer

CD133, CD44, CD24 og EGFR i tre tyktarmskræft cellelinjer blev analyseret med flowcytometri, se figur 1A. Der var en forskel i ekspressionen af ​​CD133, CD44, CD24 og EGFR mellem cellelinjer. CD44 blev vist som en population strækker sig fra lav til høj ekspression i alle tre cellelinier. Påvisningen af ​​CD24-ekspression var afhængig af anti-CD24-antistof. Den højeste ekspression af CD24 blev set i HT-29-celler med 95% positive celler ved anvendelse af CD24-antistof fra MACS), se figur 1B. CD133 blev udtrykt i størstedelen af ​​HCT116 og HT-29-celler, mens kun 14% af DLD-1-celler var positive for CD133. Alle tre cellelinier udtrykte EGFR. Omkring 80% af HT-29 og HCT116 hvor positiv for EGFR mens 40% var positive i DLD-1.

A) HT-29, HCT116 og DLD-1. Ekspressionsmønstrene i dotplots er fra en repræsentativ flowcytometer eksperiment. Gitteret viser margenen mellem høj og lav ekspression af proteinet defineret af isotypekontroller. B) Ekspressionen af ​​CD24 positive celler i flowcytometri afhænge af den anti-CD24-antistof. Tabellen viser procent af CD24 positive celler ved hjælp af tre forskellige CD24-antistoffer.

radiosensitivitet af CD133

høj /CD44

høj og CD133

lav /CD44

lav Udtrykke celler

Sammenhængen mellem ekspression af CD133, CD44 og stråling følsomhed blev evalueret ved at sortere og indsamle CD133

høje /CD44

høje og CD133

lav /CD44

lav udtrykkende celler , efterfulgt af udsættelse for udefra påført gammastråling, og yderligere analyseret med klonogene assays, se figur 2. En højere modstandsdygtighed over for stråling i CD133

høj /CD44

høj population sammenlignet med den CD133

lav /CD44

lav befolkningstæthed blev observeret for alle cellelinjer. Disse forskelle var statistisk signifikante ved alle strålingsdoser (2, 4 og 6 Gy) for DLD-1 celler, se Figur 2C, ved 4 og 6 Gy for HCT116 celler, og ved 4 Gy for HT-29-celler, se figur 2A og B, med en P-værdi på 0,05 (envejs ANOVA). Der var ingen eller en lille forskel i ekspressionen af ​​CD24 i CD133

høj /CD44

høj og CD133

lav /CD44

lav befolkningstæthed, undtagen i HCT116 hvor der var mindre positive CD24 celler i den CD133

lav /CD44

lav fraktion. Antallet af EGFR-positive celler i de sorterede fraktioner var næsten det dobbelte i CD133

høj /CD44

højt sammenlignet med CD133

lav /CD44

lav fraktion i HT-29 og DLD-1 celler, hvorimod i HCT116 var der kun en lille forskel i EGFR mellem fraktionerne. Strålingen følsomhed til usorterede celler er vist i figur S1.

klongenicitetsassayet af A) HT-29, B) HCT116 og C) DLD-1 celler. De øverste og nederste 10 procent af CD133 og CD44-udtrykkende celler blev sorteret ved flowcytometri (CD133

høj /CD44

høj eller CD133

lav /CD44

lav) og strålingen følsomhed blev analyseret ved anvendelse klonogene assays. Kontrollen af ​​de to fraktioner blev normaliseret, og sat til 100% overlevelse. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien af ​​mindst to separate forsøg med tredobbelte prøver. Der blev observeret en højere modstandsdygtighed over for stråling i CD133

høj /CD44

stor befolkning i forhold til CD133

lav /CD44

lav befolkningstæthed for alle cellelinjer. Disse forskelle var statistisk signifikante ved alle strålingsdoser (2, 4 og 6 Gy) for DLD-1 celler (figur 2C), ved 4 og 6 Gy for HCT116 celler, og ved 4 Gy for HT-29-celler (figur 2A og B ) med en P-værdi på 0,05 (envejs ANOVA). Procentdelen af ​​celler positive for EGFR, CD24 med BD Bioscience antistof eller CD24 med Miltenyi biotech /MACS blev analyseret med flowcytometri.

Angivelse af AKT i CD133

positiv /CD44

positiv og CD133

negativ /CDD44

negativ Befolkning i DLD-1

De forskellige populationer af CD133

positiv /CD44

positiv, CD133

negativ /CD44

positiv og CD133

negativ /CD44

negativt i DLD-1-celler blev sorteret, opsamlet og yderligere analyseret for ekspression af AKT med western blot, se fig 3A og B. ekspressionen af ​​total AKT var lavere i CD133

negativ /CD44

negativ befolkning i forhold til befolkningen positiv for CD44 og /eller CD133. Lignende mønster blev set for Akt1 og AKT2, se Figur 3B.

A) DLD-1 celler blev sorteret ved flowcytometri og forskellige populationer med CD44

positiv /CD133

negativ (Q1), CD44

positiv /CD133

positive (Q2), CD44

negativeCD133

negativ (Q3), blev indsamlet. B) De sorterede celler blev yderligere analyseret med western blot for total AKT, Akt1 eller AKT2 og betaactin udtryk.

Indflydelse af AKT Isoformer på Angivelse af CD24, CD133 og CD44

da AKT udtryk var anderledes i den sorterede CD133

positiv /CD44

positiveand CD133

negativ /CD44

negative populationer, påvirkning af AKT-isoformer blev evalueret ved hjælp af tyktarmskræft celle-line DLD-1 og

AKT

1,

AKT

2 og

AKT

1/2 isogene knock-out cellelinjer, se Figur 3AB, og bekræftelse af knock-outs i figur S2. Den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) af CD44-ekspression blev øget fra 100% i forældrenes til 150% i

AKT

en KO og

AKT

2 KO og 250% i

AKT

1/2 KO celle-linje, se figur 4A og B. Desuden CD133 ekspressionen blev reduceret, da Akt1 blev slået ud, set i

AKT

1 KO samt i

AKT

1/2 KO celle-line. Men enkelt knock-out af

AKT

2 som ses i

AKT

2 KO celle-line ikke reducere niveauet af CD133, se figur 4A. Den CD24-ekspression blev fuldstændig afskaffet i

AKT

1/2 KO men steg i det indre

AKT

1 eller

AKT

2 KO cellelinjer se figur 4C. Indflydelsen af ​​AKT-isoformer på ekspressionen af ​​CD24, CD133 og CD24 blev yderligere verificeres med siRNA mod Akt1 og genindførelse af Akt1- eller AKT2 i DLD-1

AKT

1/2 KO celle-line, se figur S3 og S4. Desuden har vi bekræftet, at der ikke var nogen forskel i cellen cyklus fordeling mellem de cellelinjer, se Figur 4D.

A) I de parentale celler, ca. 10% af cellerne var CD133 positive celler. Men i

AKT

1 og

AKT

1/2 knock-outs, de CD133 positive celler blev reduceret til 0,3 og 0,1% hhv. Dette blev ikke set i

AKT

2 knock-out celle-linje, hvor 33% af cellerne var positive for CD133. B) Den gennemsnitlige fluorescerende intensitet CD44 normaliseret til DLD-1 parental celle-line steg til 150% i

AKT

en KO, 160% i

AKT

2 KO og 300% i

AKT

1/2 KO celle-line. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen (SD) fra mindst to eksperimenter. C) Procenten af ​​CD24 positive celler analyseret med to forskellige CD24 antistoffer fra BD Biosciences og Miltenyi /MACS i flowcytometri. De standardafvigelser er fra gentagne forsøg. D) Cell-cycle distribution i DLD-1 forældre,

AKT

en KO,

AKT

2 KO og

AKT

1/2 KO celler.

Indflydelse af AKT Isoformer på ekspression af CD44 Variant Isoformer

de fleste (98-100%), af DLD-1, HCT116 og HT-29-celler var positive for CD44, detekteres med et antistof som registrerer alle varianter af CD44. Ekspressionsmønsteret for CD44 variant isoformer v3, v4 /5, v6, v7 og v7 /8 blev yderligere undersøgt i DLD-1 forældre- og

AKT

1/2 KO cellelinier se tabel 2. Kun små mængder (~1-6%) af celler var positive for CD44 variant isoformer (udtryk i enkelte, levende celler), og med ingen væsentlige ændringer i ekspressionsniveauerne mellem AKT dygtige og mangelfulde DLD-1 cellelinjer. I tilfælde af CD44v7, som havde en højere påviseligt niveau, blev udtrykket let reduceret i

AKT

1/2 KO celler i forhold til forældrenes.

Biokemiske analyser af DLD- 1

AKT

Knock Out Cell-linjer

Western blot analyse evalueres yderligere protein ekspressionen af ​​CD133 og CD44 samt Fox0 og GSK3p og deres indflydelse ved AKT isoformer. Udtrykket af CD44 var opreguleret i

AKT

en KO,

AKT

2 KO og

AKT

1/2 KO celle-linjer i forhold til forældrenes og CD133 udtryk blev reduceret i

AKT

en KO og

AKT

1/2 KO cellelinier, men ikke i

AKT

2 KO celle-linje som ses i strømmen cytometrianalyse.

AKT

1, A

KT

2 og

AKT

1/2 KO cellelinjer havde en reduceret ekspression af fosforyleret Fox01 og Fox03a samt en reduceret ekspression i samlede Fox03a i

AKT

1/2 KO celle-line. Men der var ingen forskel i angivelsen af ​​fosforyleret (S9) eller total GSK3p mellem

AKT

KO cellelinjer, se figur 5A.

A) Protein udtryk for CD44, CD133, phospho-FOXO, total FOX03a, phospho-GSK3p og total GSK3p fra Western blot-analyse. B) Gen-ekspression, opregulering (+), nedregulering (-) eller ikke ændret (NC), af CD44, CD24, CD133, FOX01, FOX03, FOX04, GSK3P og LYN i DLD-1

AKT

1 KO,

AKT

2 KO eller

AKT

1/2 KO celler sammenlignet med DLD-1 stamcellerne.

forskelle i genekspression i de DLD-1 AKT-isoformer knock-out cellelinjer

Genekspression analyse blev udført for yderligere at undersøge forskellene mellem den isogene

AKT

isoform knock-out cellelinjer se Figur 5B. Gener blev betragtet signifikant op- eller ned- reguleres med nøgletal ≥ 1,5 gange og med p 0,05. Den knock-out af

AKT

1 og

AKT

2 isoformer blev bekræftet i DLD-1 cellelinjer og genekspression af CD44 og CD133 bekræftede resultater fra flowcytometri og vestlige blot analyse. CD44 var opreguleret i

AKT

1,

AKT

2 og

AKT

1/2 KO celle-linjer i forhold til forældrenes celle-line og CD133 var op- reguleret i

AKT

2 KO men nedreguleret i

AKT

1 og

AKT

1/2 KO cellelinjer. Den CD24-ekspression var lavere i

AKT

1/2 KO celle-line i forhold til forældrenes dog; var der ingen forskel i

AKT

1 eller

AKT

2 KO cellelinjer. FOXO1 blev opreguleret i

AKT

en KO og

AKT

1/2 KO celle-line, mens FOXO3 kun blev opreguleret i single

AKT

en KO og

AKT

2 KO cellelinjer. Der var ingen forskel i FOXO4 udtrykket mellem celle-linjer. LYN blev opreguleret kun i

AKT

1/2 KO men der var ingen forskel i ekspressionen af ​​GSK3p mellem cellelinjer, se Figur 5B.

Evaluering af Forskelle i epiteliale til mesenchymale Transition, Notch, Wnt og Cell Adhæsion Pathways mellem

AKT

2 KO og

AKT

1 KO cellelinjer

En markør for epitelial til mesenkymale overgang (EMT ) er en reduktion af celleadhæsion. Der var flere gener i cellens vedhæftning pathway (

CLDN1, ITGB8, NEO1

og

PVRL3

), som havde signifikant højere udtryk i

AKT

2 KO celle-line sammenlignet til

AKT

en KO-celle-line. Endvidere induktion af EMT involverer Notch og Wnt og tyrosinkinasereceptorer.