PLoS ONE: Digital Påvisning af Multiple Mindretals Mutanter og Expression Niveauer af flere Tyktarmskræft gener ved hjælp af digital-PCR Koblet med Bead-Array

Abstrakt

For at samtidigt analysere mutationer og ekspressionsniveauer af flere gener på én afsløring platform, foreslog vi en metode kaldet “multiplex ligation-afhængig sonde forstærkning-digital forstærkning kombineret med hydrogel perle-array” (MLPA-DABA) og anvendt det til at diagnosticere kolorektal cancer (CRC). CRC celler og væv blev udtaget til at ekstrahere nukleinsyre, udføre MLPA med sekvensspecifikke prober, udføre digital emulsion polymerasekædereaktion (PCR), og frembringer en hydrogel bead array at immobilisere perlerne og danne en enkelt perle lag på arrayet. Efter hybridisering med fluorescerende prober, antallet af farvede perler, som afspejler den overflod af udtrykte gener og den mutation rate, blev talt til diagnosticering. Kun røde eller grønne perler opstod på chips i de blandede prøver, der angiver succes single-molekyle PCR. Når en én-kilde prøve blev analyseret ved anvendelse af blandede MLPA prober, perler af kun en farve indtraf, tyder den høje specificitet af fremgangsmåden ved analysen CRC mutation og genekspression. I genekspression analyse af en CRC væv fra en CRC patient, mutanten procentdel var 3,1%, og ekspressionsniveauerne af CRC-beslægtede gener var meget højere end for normalt væv. Den yderst følsomme MLPA-DABA lykkes i den relative kvantificering af mutationer og genekspressioner af eksfolierede celler i afføringsprøver fra CRC patienter på den samme chip platform. MLPA-DABA kombineret med hydrogel perle-array er en lovende metode i den ikke-invasiv diagnose af CRC

Henvisning:. Huang H, Li S, Sun L, Zhou G (2015) Digital Påvisning af flere Mindretals Mutanter og Expression Niveauer af flere Tyktarmskræft gener ved hjælp af digital-PCR Kombineret med perle-Array. PLoS ONE 10 (4): e0123420. doi: 10,1371 /journal.pone.0123420

Academic Redaktør: Ken Mills, Dronningens University Belfast, Storbritannien

Modtaget: 17. december, 2014 Accepteret: 23 februar 2015; Udgivet 16. april, 2015

Copyright: © 2015 Huang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:. The National Science Foundation of China (Grant nr 21.305.069 og 21.275.161) ydet støtte til beslutningen om at offentliggøre og udarbejdelse af manuskriptet. Uddannelsesprojektet for Unge talenter i Jiangsu-provinsen mødres og børns sundhed Hospital (FRC201302) ydet støtte til indsamling og analyse af data. Jiangsu-provinsen Clinical Science Teknologi Special Project (SBL2012061) ydet støtte til studiedesign

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindelige kræftform hos mænd og den anden mest almindelige kræftform hos kvinder på verdensplan [1]. I Kina, CRC er en af ​​de mest almindelige maligne cancere og har en høj dødelighed. Traditionelt CRC diagnose bruger Dukes klassificeringssystem, som kategoriserer kræft i faser A, B, C, eller D. De relaterede data viser, at 5-års-overlevelse for postoperative CRC patienter er 81-85% i fase A, 64- 78% i fase B, 27-33% i fase C, og 5-14% i fase D; derfor kan tidlig diagnose af CRC og efterfølgende behandling effektivt øge overlevelsesrater. Tidlige screeningstest er nøglen til tidlig diagnose af CRC og forbedring af overlevelsesraten [2]. CRC screeningstest omfatte procedurer såsom en koloskopi, fækal okkult blodprøve, og fibersigmoidoscopy [3]. Selv om disse fremgangsmåder har gode kliniske resultater, har de også ulemper. For eksempel kan de invasive teknikker let forårsage blødning og perforation, og følsomheden og specificiteten af ​​nogle fremgangsmåder er utilstrækkelige; Derfor er udviklingen af ​​en enkel, ikke-invasiv fremgangsmåde med høj følsomhed og specificitet er nødvendig for tidlig diagnose af CRC.

De nylige hurtige fremskridt inden for molekylær biologi gør det muligt at foretage hurtig invasiv diagnose af CRC ved føleligt analysere eksfolierede celler i afføringen prøver af CRC patienter. Fordi onkogenese af CRC, der indebærer en vekselvirkning mellem multiple gener, er en flertrinsproces [4], såsom aktivering af proto-onkogener og inaktivering af tumorsuppressorgener, single-genet påvisningsmetode ofte fejldiagnosticerer sygdom; derfor er den kombinerede detektering af multiple gener er nyttige i at øge hastigheden af ​​positive diagnoser af sygdommen. Forekomsten og udviklingen af ​​CRC ofte ledsager genmutation og ændringer i genekspression [5]; derfor, CRC diagnose involverer påvisningen af ​​disse aktiviteter [6-11]. Selvom DNA-sekventering teknik er en klassisk fremgangsmåde, hvorved der påvises genmutationer, kan det ikke analysere prøver, hvor antallet af mutationer er 20% [12]. For at opdage genmutationer ved lave niveauer i de tidlige stadier af kræft, blev en EndoV /ligase-baserede mutation scanning metode udviklet med en detektionsgrænse på 1,0% [13]; Imidlertid er fremgangsmåden ikke er i stand til at detektere mutanter (mutS) til en meget lavere niveau på grund af den kvantitative analyse baseret på det analoge signal. Selvom den digitale analysemetode, kaldet strålede [14,15], blev udviklet for at detektere mutS på en ultra-lavt niveau (0,1% af mutS), flowcytometeret anvendes i processen er dyrt og kun ét gen er påvist i en forsøg. På grund af sin høje følsomhed og høj specificitet, er kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR), der anses for at være den bedste metode, hvorved genekspression kan analyseres; Men på grund af det begrænsede antal fluorescerende markører, qPCR er ikke egnet til at analysere multiple gener i samme reaktion. Selvom mikromatrice samtidig kan analysere flere gener, problemet er stadig en lav detektionsgrænse og dårlig kvantitativ ydeevne til analyse cancer-relaterede gener udtrykt på et lavt niveau i den tidlige diagnose af CRC. Selv den kombinerede analyse af mutationer og kræft-relaterede genekspression kan øge nøjagtigheden og følsomheden af ​​CRC diagnose, næsten alle de rapporterede teknikker gælder kun ét felt detektere enten mutationer eller genekspression.

Her vi foreslået en fremgangsmåde betegnet “multiplex ligering-afhængig probe amplifikation-digitalforstærkning kombineret med hydrogel bead array” (MLPA-DABA) hvorved mutationer og ekspressionsniveauer af multiple gener ved lave niveauer samtidigt kan analyseres på én afsløring platform. Baseret på tidligere arbejde [3,16,17], den tekniske platform for MLPA-DABA blev udviklet ved at forbedre de følgende tre aspekter: For det første MLPA, i stedet for konventionel PCR eller target beriget multiplex PCR (Tem-PCR), blev anvendt til at forberede skabeloner med fælles ender; sekund, mutationer og udtryk for multiple gener, i stedet for kun en eller den anden, blev samtidigt målt med den tekniske platform ved at ændre udformningen af ​​specifikke MLPA prober; tredje, dye-fri og genspecifikke MLPA prober, i stedet for høje omkostninger og genspecifikke fluorescerende prober blev anvendt til at mærke flere mutS og cancerrelaterede gener. Problemerne med usikre antal farvestof-mærket deoxynukleotidtrifosfater (dNTP) inkorporeret i en DNA-streng og konkurrencen mellem udvidelse reaktion og hybridiseringsreaktionen nævnt i tidligere værker blev løst; Derfor blev den høje specificitet, lave omkostninger og høj stabilitet af fremgangsmåden opnået. Metoden blev anvendt med succes til CRC diagnose ved at analysere ekspressionen af ​​fem gener (

β-actin

,

C-myc

,

H-ras

,

CD44v6

,

Cox-2

, og

N-ras

) og tre mutation loci på APC gener (codon 1406, 1338 og 1356) i CRC væv, CRC celler, og afføring prøver fra CRC patienter. Resultaterne viser, at metoden kan være et effektivt redskab i tidlig diagnosticering af CRC.

Materialer og metoder

Reagenser

N-hydroxysuccinimidester (NHS) -aktiverede sepharose HP affinitetssøjle og dNTP’er blev indkøbt fra Amersham Biosciences (Piscataway, NJ).

Taq

DNA-polymerase var fra Promega (Madison, WI). DC 5225C Formulation Aid og DC 749 Fluid blev erhvervet fra Dow Chemical Co. (Midland, MI). AR20 Silicone Oil blev opnået fra Sigma (St. Louis, MO). SuperScript III revers transkriptase blev købt hos Invitrogen (Carlsbad, CA). Amplicase blev indkøbt fra Epicenter (Madison, WI). Andre kemikalier var af en kommercielt ekstra ren kvalitet. Alle opløsninger blev fremstillet med demineraliseret og steriliseret vand.

Sekvenser af primere og prober

amin-modificerede primer (5′-NH

2-TTT TTT TTT TCC ATC TGT TGC GTG CGT GTC-3 ‘) blev syntetiseret af Takara Biotechnology Co., Ltd (Dalian, Kina). Alle de andre primere blev syntetiseret af Invitrogen Inc. (Shanghai, Kina). Et par almindelige primere, common-1 (5’-CCA TCT GTT GCG TGC GTG TC-3 ‘) og common-2 (5′-CCT TGG CAA TCA GGC GAA TC-3′) blev anvendt til at amplificere MLPA produkter. De genspecifikke MLPA prober til påvisning mutanter blev opregnet i tabel 1. De genspecifikke MLPA prober til analyse af genekspression blev opført i tabel 2. fluorescens prober til perle-dekodning var 5’-Cy3-TGC CTT GTC ATT CGG- 3 ‘og 5′-Cy5-GGA AAA GAG CCA A-3’. Revers-transskription primer var oligo (dT) 15.

Skabelon forberedelse

Enheder af CRC væv og CRC celler blev opnået fra Jiangsu Cancer Hospital (Nanjing, Kina) . Den høst af væv, celler og afføring fra deltagerne blev godkendt af den etiske komité i Første Tilknyttede Hospital i Nanjing Medical University, og deltagerne forudsat skriftligt informeret samtykke. Totale RNA’er blev ekstraheret fra væv af CRC patienter og CRC-celler ved hjælp af RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Tyskland) ifølge producentens anvisninger. Den ekstraherede RNA blev bestemt ved gelelektroforese udføres på en 2% agarosegel og et UV-VIS-spektrofotometer (Naka Instruments, Japan). Den første streng cDNA blev syntetiseret fra oligo (dT) 15-primere ved hjælp SuperScript III revers transkriptase, ifølge producentens anvisninger.

Genomisk DNA blev ekstraheret fra væv og celler ved phenol-chloroform-ekstraktion. Før ekstraktion blev cellerne vasket to gange med normal saltopløsning og væv blev skåret og homogeniseret i 1 ml fysiologisk saltvand. Det ekstraherede DNA blev fortyndet i TE-buffer og bestemmes ved UV-VIS-spektrofotometer.

Stool fra en CRC patient i Jiangsu Cancer Hospital (Nanjing, Kina) blev homogeniseret i ASL buffer og ekstraheret med en QIAamp DNA Stool Mini (Qiagen, Tyskland).

Multiplex ligering-afhængig probe amplifikation-digital forstærkning

Efter tilsætning parrene af prober (100 fmol af hver) og 1,0 U Ampligase, reaktionsblandingen indeholdende den DNA eller cDNA prøverne blev inkuberet ved 94 ° C i 1,0 minutter efterfulgt af 60 ° C i 4,0 min; denne cyklus blev gentaget 10 gange.

Digital emulsion PCR (emPCR)

De pakkede perler (10 pmol NHS sites /ml) fra 1 ml NHS-aktiveret Sepharose HP affinitetskolonne blev fjernet fra søjlen og spredt i isopropanol. Efter vasket med 1 mM HCI til grundigt at fjerne isopropanol blev perlerne aktiveret af 1 mM iskold HCl ved 4 ° C i 1 time. Derefter blev de aktiverede perler og amin-modificerede primere (10 mM) inkuberet i bindingspuffer (0,5 M NaCl, 0,2 M NaHCO

3, pH 7,5) ved 20 ° C i 5 timer. Perlerne blev holdt væk fra sedimentation i inkubationen. Efter inkubering blev primer-immobiliserede perler opbevaret ved 4 ° C til anvendelse.

Systemet med emPCR blanding indeholder oliefase og vandfase. Den vandige fase er opdelt i to dele, Mock amplificeringsblandingen og PCR reaktionsblandingen. Ligeringsprodukterne blev anvendt som templates for PCR. Først, for at gøre emulsionen mere stabil, 225 pi mock amplificeringsblandingen (1 × Promega

Taq

puffer, 2 mM MgC

2, 0,1% BSA og 0,01% Tween-80) blev homogeniseret med 375 pi emulsion olie (40% (vægt /vægt) DC 5225C Formulation Aid, 30% (vægt /vægt) DC 749 Fluid og 30% (vægt /vægt) AR20 siliconeolie) af magnetisk microstir-bar ved 1200 rpm i 5 min i et 5 ml hætteglas. Sekund, 200 pi af PCR-reaktionsblandingen (1 × Promega

Taq

puffer, 2 mM MgC

2, 0,5 mM dNTP-blanding, 0,125 U /ml

Taq

DNA-polymerase, 0,1 % BSA, 0,01% Tween-80, 0,06 mM common-2 primer og 0,6 mM af hver af fælles-1-primere), primer-coatede perler og skabeloner blev tilsat i hætteglasset, og derefter hætteglasset blev omrørt ved 1500 rpm i 3 minutter at blande emulsionerne godt. Emulsionerne blev alikvoteret med 100 pi hver i 8 PCR-rør. Tredje, termocyklisering blev udført på PTC-225 Peltier Thermal Cycler (MJ Research, INC.) Ved et indledende denaturering ved 95 ° C i 3 minutter, derefter 40 cyklusser (94 ° C, 58 ° C og 68 ° C i 30 s , 60 s, 90 s hver) til forstærkning og 13 cykler (94 ° C og 58 ° C i 30 s, 360 s hver) for hybridisering og udvidelse.

Digital bead regner med selv-producerede hydrogel bead- vifte

efter forstærkning blev emulsioner opdelt ved at tilføje isopropanol. Emulsionerne med isopropanol blev filtreret gennem et 25-mm-diameter mikropore membran og perlerne blev fanget på membranen. Efter perlerne på membranen blev ønsket med isopropanol, 80% ethanol i opløsning (4,0 mM Tris, pH = 7,5) og 0,1% Tween 20, blev de genfundet i 1,0 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA). DNA (dsDNA) immobiliserede perler blev behandlet med 0,1 mM NaOH i 5,0 minutter til fremstilling af enkeltstrenget DNA (ssDNA) immobiliserede perler. Efter at supernatanten var fjernet, blev kuglerne vasket to gange med ddH

2O og opbevaret i opløsningen. Salg

Acryl-modificerede objektglas blev fremstillet ifølge Xiao et al [18]. De objektglas (Shanghai Jinglun Industrial Glass Co, Ltd, Shanghai, Kina) blev renset ved iblødsætning i 10% vandig salpetersyre til 2,0 t.

hydrogel perle-række blev fremstillet ved at tilsætte perlerne til en acrylamid monomer løsning, og på acryl-modificerede dias og straks dækker med en dækning slip (20 × 20 mm) til at holde en enkelt perle lag. Efter copolymerisation, som blev udført ved stuetemperatur i 10 minutter, blev dækglasset forsigtigt fjernet fra hydrogelen. Fluorescens prober (1,0 pmol /ul) blev hybridiseret med ssDNA på perlerne i polyacrylamidgel ved 40 ° C i 1,0 timer. At fjerne de frie og uoverensstemmende prober fra gelen chip, blev probe-hybridiserede objektglas underkastet elektroforese ved 4,0 ° C under 50 V for 5,0 minutter i 1 × Tris /borat /EDTA-puffer. Efter vask med vand, blev billeder af objektglassene fremstillet ved anvendelse af LuxScanner (CapitalBio Corporation, Beijing, Kina). Endelig scanning billede af perlen array var input til GenePix Pro 4.0 at tælle farve perler på array.

Resultater og Diskussion

Princip

Rettet mod samtidigt analysere multiple mutationer, og ekspressionen af ​​multiple gener, blev et mål-beriget MLPA kombineret med perle-baserede emPCR for multiplex single-molekyle amplifikation. Protokollerne af analysen er vist i figur 1 og omfatter følgende trin:. Skabelon forberedelse, emulgering, single-molekylær forstærkning, demulsifikation, udarbejdelse af hydrogel perle-array, probehybridisering og perle optælling

Analysen omfatter følgende tre trin: (1) MLPA for at forberede skabeloner tagget med universelle sekvenser; (2) emulsion (EM) PCR til fremstilling perler overtrukket med amplikoner genereret fra et enkelt molekyle af MLPA produkter; og (3) perle dekodning ved hybridisering universelle Cy5-mærkede prober og universelle Cy3-mærkede prober. Hvis en perle vises som grøn, bør amplikoner belagt på perlen blive forstærket fra MUT skabeloner eller mål for CRC-relaterede gener, mens en rød perle betyder vildtype-skabeloner eller mål for husholdning gener.

Første, DNA og cDNA blev anvendt som mål i MLPA at forberede skabeloner kvalificeret til emPCR, som er en yderst præcis digital PCR teknik, hvor der er en reaktion til amplifikation ét molekyle at realisere enkelt-molekyle amplifikation. I mutationsdetektering, ligering kræver tre prober til én loci, nemlig “venstre probe”, “højre føler 1”, og “højre sonde 2”. Der er to dele i venstre probe og tre dele i hver af de to højre prober. De to dele i venstre probe er et almindeligt hale i 5′-enden til at tilføre en fælles primingsite nødvendig i den efterfølgende PCR amplifikation og et gen-specifikke sekvens ved 3′-enden til annealing målet. De rigtige prober indeholder et gen-specifik sekvens med en mutation sted af interesse ved den første base af 5′-enden, en kilde-specifik sekvens til hybridisering fluorescerende prober i midten, og en fælles priming site ved 3′-enden. Højre prober 1 og 2 svarer til MUT og vilde typer (WTS), hhv. I genekspression analyse, to prober, venstre probe og højre probe, blev anvendt i ligeringsreaktionen. Den venstre probe indeholder en fælles primingsted og et gen-specifik sekvens. Den højre probe indeholder et gen-specifikke sekvens ved 5′-enden, en kilde-specifik sekvens i midten, og en fælles priming site ved 3′-enden. Efterfølgende blev enkelt-molekyle amplifikation udføres i vand-i-olie-emulsion. Fordi begge perler og skabeloner fra MLPA fortyndes således at ikke mere end et mål-molekyle og en kanttråd er til stede i hvert rum, beaded ampliconer genereret fra emPCR stammer fra præcis én målmolekylet. Efter demulsifikation, er perler opsamlet og fikseret som en enkelt-bead lag (40 um tyk) på en hydrogel perle-array. Perlerne amplificeret fra husholdning genet (eller WT amplikoner) blev afkodet ved hybridisering 3′-Cy5-mærkede prober, mens perlerne amplificeret fra CRC-beslægtede gener (eller mutS) blev dekodet ved hybridisering 3′-Cy3-mærkede prober; derfor, at antallet af røde (Cy5 dye) perler og antallet af grønne (Cy3 dye) perler afspejlede ekspressionsniveauerne for husholdning genet (eller WT amplikoner) og CRC-beslægtede gener (eller mutS) hhv. Udgifterne til analysen dramatisk faldet med anvendelse af almindelige fluorescerende prober til dekodning perlerne overtrukket med amplikoner af mutS, WT amplikoner, husholdning gen, og CRC-relaterede gener.

Specificitet af perle-række

specificiteten af ​​hydrogel chip platform til analyse af målene fra forskellige kilder blev undersøgt. CDNA’et af

β-actin

blev ligeret med de genspecifikke MLPA prober indeholdende tag-sekvens for kodning Cy5-labled prober til frembringelse MLPA produkter

β-actin

. De MLPA blev derefter amplificeret ved anvendelse af to almindelige primere og 5′-enden af ​​en primer blev modificeret med biotin. Efter biotin-modificerede PCR-produkter blev immobiliseret på streptavidin-modificerede perler blev perle-arrayet fremstillet og dækket med Cy5- og Cy3-labled prober til analyse. Som vist i figur 2A, er der kun røde perler på billederne. Tilsvarende, når cDNA’et af CRC-beslægtede gener blev ligeret med de genspecifikke MLPA prober indeholdende tag-sekvens til kodning Cy3-labled prober, kun grønne perler kan scannes (Fig 2B). Resultaterne indikerede, at elektroforese effektivt fjerner de fejlparrede sonder på perlerne ‘overflade eller de resterende prober inde i hydrogelen. Hybridiseringen mellem fluorescerende prober og mål inde i hydrogelen er specifik. kan anvendes Platformen af ​​perle-array til præcist at skelne mellem mål fra forskellige kilder i MLPA-DABA.

Både Cy5-mærkede og Cy3-mærkede prober blev føjet til perle-array til hybridisering, og elektroforese blev udført for at fjerne de fejlparrede og frie prober. Endelig er de tre fotografier af panel A eller panel B taget ved anvendelse af tre typer af fluorescens kanaler, både Cy3 og Cy5 kanaler, kun Cy3 kanal, og kun Cy5 kanal, henholdsvis.

Specificitet af MLPA -DABA til analyse mutanter og gen-udtryk

for at analysere genekspression, den del af CRC-perler falsk scoret i 100% cDNA af

β-actin

den del af husholdning perler falsk scoret i 100 % cDNA af CRC-gener blev bestemt. Efter hybridisering og elektroforese blev billeder taget af perlerne overtrukket med 100% fragmenter fra

β-actin

og 100% fragmenter fra CRC-beslægtede gener; resultaterne er vist i figur 3A og 3B. Der var næsten ingen falsk scoret perler findes i enten test; derfor, MLPA-DABA anvendelse er yderst specifik for analyse ekspression af CRC-beslægtede gener i CRC

Prøverne blev 100% mål for

β-actin

(A).; 100% mål for CRC-beslægtede gener (B); 100% WT DNA af kodon 1338 i normalt væv (C); og 100% MUT DNA fra kodon 1338 i SW480-celler (D). Syv par prober CRC-relaterede gener og

β-actin

sattes til MLPA reaktionsblandingen (A og B), og alle prober kodoner 1406, 1338 og 1356 blev anvendt til de MLPA reaktioner (C og D). Efter emulsion PCR bliver begge Cy5-mærkede og Cy3-mærkede prober blev sat til perle-arrayet til hybridisering.

SW480-celler (humane CRC-celler) med en homozygot mutation i codon 1338 (4012 C T) blev valgt som MUT mål. Normalt væv anvendt som WT målet blev samtidigt analyseret. Fraktionen af ​​falsk nu perler i en 100% MUT DNA eller i et 100% WT DNA blev påvist. De i fig 3C og 3D resultater viser, at procentdelen af ​​falsk nu perler (herunder urenheder) i begge var tæt på 0, hvilket antyder, at fremgangsmåden er også specifik for mutationsdetektering i CRC.

Kvantificering af to gener ved hjælp af MLPA-DABA

for at verificere muligheden for at benytte MLPA-DABA at analysere forskellige gener blev to husholdning gener bruges som eksempel. I et rør, blev målene for

p-actin

ligeret med MLPA prober, der kunne hybridisere de Cy5-labled prober, mens målene af

GAPDH

blev ligeret med MLPA prober, som kunne hybridisere de Cy3-labled prober. Efter digital forstærkning af ligeringsprodukter og probehybridisering af perlerne blev de røde og grønne kugler tælles. Resultaterne er vist i figur 4. Antallet af røde perler og grønne perler afspejler ekspressionsniveauerne af

β-actin

GAPDH

hhv. Ved at tælle de farvede perler på chippen, blev det konstateret, at forholdet mellem ekspression af

β-actin

med den for

GAPDH

var næsten 1: 1, hvilket antyder, at de to housekeeping-gener var held påvist. Der var ingen gule perler, hvilket indikerer, at enkelt-molekylært amplifikation blev opnået ved at holde mere end én målmolekyle i hvert rum, og at det er muligt at MLPA-DABA kan analysere gener fra forskellige kilder.

En rød perle stammer fra et molekyle af

β-actin

og en grøn perle stammer fra et molekyle af

GAPDH

.

Application

for at demonstrere anvendelsen af ​​MLPA-DABA i påvisning af kliniske prøver, blev påvist de relative ekspressionsniveauer af fem CRC-relaterede gener og mutS i både tumorvæv og tilstødende normalt væv fra CRC patienter. De typiske skannede billeder af en patient er vist i figur 5. De relative ekspressionsniveauer af de samlede fem CRC-beslægtede gener til

β-actin

i tumorvæv er meget højere end dem i det tilstødende normale væv (Fig 5A og 5B). Alle perlerne var rød i DNA-analyse af den tilstødende normale væv (Fig 5C), hvilket indikerer, at de var MUT negativ, mens de grønne kugler (Fig 5D) indikere, at de var MUT positive i tumorvævet. Den MUT sats var 3,1%, beregnet som forholdet mellem grønne perler til røde perler. Væsentlige forskelle i mutation og genekspression mellem tumorvæv og det tilstødende normale væv viste, at MLPA-DABA kan anvendes til tidlig diagnose af CRC med lav-niveau mutationer og en lav overflod af genekspression.

( A) Ekspression analyse af CRC-beslægtede gener i tilstødende normalt væv; (B) ekspression analyse af CRC-beslægtede gener i tumorvæv; (C) mutation påvisning af hosliggende normalt væv; (D) mutation påvisning af tumorvæv. Røde perler stammede fra cDNA’er af

β-actin

vildtype-DNA; grønne perler stammer fra cDNA af CRC-relaterede gener (

C-myc

,

H-ras

,

N-ras

,

CD44v6

, og

Cox-2

) og mutant-DNA.

for at vurdere mulighederne for MLPA-DABA i invasiv påvisning af kliniske prøver, blev afføring fra seks CRC patienter anvendes. Som vist i S1 tabel, kun 50% af de seks CRC patienter (3/6) var MUT positive og 83% af de seks CRC patienter (5/6) blev testet med en høj ekspression af CRC-beslægtede gener i noninvasive analyser af afføringsprøver. Den samlede opdagelse sats af MLPA-DABA er 83%. Baseret på påvisning resultaterne og Dukes stadium af patienter, konkluderes det, at vores metode er lovende i tidlig diagnose af colorektal cancer, fordi påvisning frekvens af patienter i de tidlige stadier (Dukes ‘faser A og B) er så høj som 75% (3/4). Vi mener, at detektionsraten kunne øges yderligere ved at øge størrelsen af ​​panelet i mutation loci og CRC-beslægtede gener. Typiske resultater fra MLPA-DABA hjælp af en af ​​afføring CRC patienter og fra en rask frivillig er vist i figur 6. afføring fra CRC patient blev påvist at være MUT positivt med en høj ekspression af CRC-beslægtede gener, mens afføringen fra rask frivillig blev påvist at være MUT negativ med en lav ekspression af CRC-beslægtede gener

(a) Mutation detektion af afføringsprøve fra CRC patient.; (B) analyse af CRC-relateret genekspression af afføringsprøve fra CRC patient; (C) Mutation detektion af afføringsprøve fra raske frivillige; (D) analyse af CRC-relateret genekspression af afføringsprøve fra raske frivillige.

Konklusion

I denne undersøgelse en følsom og specifik analyse for digitalt afsløre mutS og udtryk niveauer af multiple gener på en hydrogel bead array blev udviklet. Ved at kombinere MLPA og perle-baserede emPCR, single-molekyle amplifikation med fælles primere anvendt til alle mål blev nået. MLPA blev anvendt i fremstillingen af ​​skabeloner med universelle ender fra DNA og cDNA-prøver fra forskellige kilder, som begunstiger multiplex amplifikation. I modsætning til analoge forstærkning i konventionelle PCR-reaktioner, 10

6 individuelle amplifikationsreaktioner kan udføres samtidigt i et rør med perle-baserede emPCR

Perler immobiliseres som et enkelt lag på en hydrogel-chip til. fuldføre high-throughput detektion. Sammenlignet med de almindelige metoder til anvendelse af acrylamid i elektroforese for at separere proteiner og nukleinsyrer, MLPA-DABA bruger polyacrylamidgel at indlejre perlerne. Præpolymeren af ​​acrylamidmonomeren med perler er punkteret på acryl-modificeret glas og polymerisationen udføres for at indlejre perlerne på overfladen af ​​glasset chip med ammoniumpersulfat og tetramethylethylendiamin. På grund af den høje permeabilitet af geler med en 3-dimensionelle porøs struktur, de uoverensstemmende prober og andre urenheder indlejret i den porøse struktur kan frit passere gennem strukturen; derfor kan proberne og urenheder effektivt fjernes ved elektroforese. Høje ydeevne hydrogel overvinder de problemer med andre metoder, såsom den høje baggrund interferens fra utilstrækkelig vask af de resterende prober. I MLPA-DABA blev baggrunden væsentligt reduceret; efterfølgende blev følsomheden og specificiteten af ​​MLPA-DABA stærkt forbedret. Desuden fordi polyacrylamid gel har amfifile og ladede egenskaber, biokompatibilitet er befordrende for hybridisering af prober og mål i en løsning-lignende miljø.

Fordi diagnosticering af sygdomme er foretaget på grundlag af de generelle oplysninger af flere gener, det er ikke nødvendigt at måle en genetisk MUT eller ekspressionen af ​​en specifik cancerrelateret gen. Et panel af flere gener som en enkelt diagnostisk biomarkør demonstrerer en mere markant forskel end de enkelte gener. I MLPA-DABA blev én type fluorescerende signal med en farve anvendes til at afspejle flere mutS og udtryk for flere CRC-relaterede gener. Både generelle oplysninger om den samlede ekspression af cancerrelaterede gener og en samlet MUT rate opnås ved at beregne forholdet mellem det totale antal grønne perler fra forskellige kilder til antallet af røde perler. Det er bemærkelsesværdigt, at de vigtigste trin i processen med MUT detektion og processen med genekspression analyse er identiske; derfor, MLPA-DABA kan analysere begge samtidigt på den samme chip platform, hvilket er meget ønskeligt i cancer diagnose. Anvendelsen af ​​MLPA-DABA, som har fordelene ved at være tumorspecifikke; kræver let prøvetagning, har stor nøjagtighed; er noninvasiv til kroppen; og kræver ingen kost forberedelse før prøven i sammenligning med andre non-invasive metoder, såsom koloskopi og fækal okkult blodprøve, er lovende for at analysere eksfolierede celler i afføringsprøver fra CRC patienter og vil blive et kraftfuldt værktøj til ikke-invasiv og tidlig diagnose af CRC.

Støtte Information

S1 Table. Detaljer og afsløring resultater af 6 patienter ved hjælp af afføring som udgangsmateriale

doi:. 10,1371 /journal.pone.0123420.s001

(PDF)