PLoS ONE: Inflammation og MIR-21 Pathways Funktionelt Interact at nedregulere PDCD4 i kolorektal cancer

Abstrakte

Inflammation spiller en direkte rolle i kolorektal cancer (CRC) progression; men de molekylære mekanismer, der er ansvarlige for denne effekt er uklare. Betændelsen induceret cyclooxygenase 2 (COX-2) enzym, der kræves til produktion af prostaglandin E2 (PGE

2), kan fremme colorektal cancer ved at reducere ekspression af tumorsuppressorgen programmeret celledød 4 (PDCD4). Som PDCD4 er også et direkte mål for onkogenet microRNA-21 (MIR-21) undersøgte vi forholdet mellem COX-2 og MIR-21 veje i colorektal cancer progression. Genekspressionsprofil i tumor og parret normal slimhinde fra 45 CRC patienter viste, at opregulering af COX-2 og MIR-21 i tumorvæv korrelerer med værre Dukes stadium. In vitro-undersøgelser i colon adenocarcinom celler afslørede, at behandling med det selektive COX-2-inhibitor NS398 faldt betydeligt MIR-21 niveauer (p = 0,0067) og øget PDCD4 proteinniveauer (p 0,001), mens behandling med PGE

2 op- reguleret mIR-21-ekspression (p = 0,019) og nedreguleret PDCD4 protein (p 0,05). Disse resultater viser, at MIR-21 er en komponent af COX-2 inflammation pathway, og at denne vej fremmer forværring af sygdom stadium i colorektal cancer ved at inducere akkumulering af PGE

2 og stigende ekspression af MIR-21 med deraf følgende nedregulering af tumorsuppressorgen PDCD4

Henvisning:. Peacock O, Lee AC, Cameron F, Tarbox R, Vafadar-Isfahani N, Tufarelli C, et al. (2014) Inflammation og MIR-21 Pathways Funktionelt Interact at nedregulere PDCD4 i kolorektal cancer. PLoS ONE 9 (10): e110267. doi: 10,1371 /journal.pone.0110267

Redaktør: Kalpana Ghoshal, The Ohio State University, USA

Modtaget: 15 juli, 2014 Accepteret: 10. september 2014 Udgivet: 13. oktober 2014

Copyright: © 2014 Peacock et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte oplysninger

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af en donation fra Derby Colorectal Cancer Fund. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tyktarmskræft er den tredje mest almindelige årsag til kræftrelaterede dødsfald på verdensplan [1]. Ca. halvdelen af ​​alle patienter diagnosticeret med kolorektal cancer i sidste instans dør af tilstanden [2]. De fem års overlevelse er steget til ca. 50-55%, hvilket skyldes primært en tidligere diagnosticering og bedre skræddersy behandlinger [3]. Døden fra kolorektal cancer kan forebygges ved tidlig fase afsløring sygdom, men desværre er det ofte opdages på et fremskredent stadium, hvor prognosen er dårligere [4]. Prognosen i kolorektal kræftpatienter er forbundet med sygdom scenen på tidspunktet for diagnosen.

Den nøjagtige “trigger” for udvikling af kolorektal cancer er stadig ukendt. I 1990 blev der foreslået en række morfologiske trin er kendt som den normale slimhinde-adenom-adenocarcinom sekvens i kolorektal cancer på grund af genetiske ændringer [5]. Men mange genetiske begivenheder føre til udvikling af sporadisk kolorektal cancer; ingen enkelt begivenhed forekommer i alle cancere og derfor ingen enkelt mønster er gældende for hver tumor [6]. Derfor kan forstå specifikke genetiske hændelser, der opstår i kolorektal carcinogenese få betydelige konsekvenser for diagnose, prognose og potentielt genterapi i fremtiden.

Der har været en nylig genopblussen i interesse i årsagssammenhængen mellem betændelse og kræft. Epidemiologiske undersøgelser har vist, at kronisk inflammation prædisponerer individer til forskellige former for kræft [7]. Det anslås, at 15% til 20% af alle kræftdødsfald verdensplan er forbundet med underliggende kroniske infektioner og inflammatoriske responser inden for sådanne [7] individer. Der er beviser fra dyreforsøg og observationer hos mennesker, at en daglig aspirin kan være effektive i forebyggelsen af ​​flere almindelige kræftformer [8], [9]. Dette er blevet bekræftet for nylig i opfølgende undersøgelser af patienter rekrutteret oprindeligt randomiserede forsøg med daglig aspirin versus kontrol til forebyggelse af vaskulære hændelser [10] – [12]. I disse forsøg, tildeling til aspirin resulterede i en reduktion på 40% i kræftdødsfald fra 5 år og opefter [11], og en vedvarende reduktion i kræft dødsfald ved 20 års follow-up [10], [12]. Observationelle undersøgelser har også vist, at aspirin anvendelse er forbundet med reduceret fjernmetastaser og fornyet i offentlige adenocarcinomer [13] – [15]., Hvilket antyder, at betændelse kan spille en rolle i progression samt i udviklingen af ​​kræft

En af de mulige årsager til de observerede kemo forebyggende effekter af aspirin i kolorektal cancer er dets evne til at reducere tumor udvikling ved hæmning af cyclooxygenase 2 (COX-2) [16]. Der er voksende beviser, der forbinder den pro-inflammatoriske enzym COX-2 med udvikling og progression af kolorektal cancer. COX-2 induceres i tyktarmsepitelet i aktiv inflammatorisk tarmsygdom (IBD) [17] og dens op-regulering resulterer i forhøjede niveauer af prostaglandin (PG), særlig PGE

2, der er en nedstrøms mediator af COX-2 og fremmer mange kræftfremkaldende veje, herunder cellulær proliferation, inhibering af apoptose og angiogenese [18]. Dette bidrager til den kroniske inflammatoriske proces orkestrere en tumor-understøttende mikromiljø, yderligere forbinder inflammation med carcinogenese.

Den mekanistiske forbindelse mellem betændelse og kræft er stadig ikke helt klar. Stigende tyder på, at mikro-RNA (miRNA) er involveret i reguleringen af ​​inflammatoriske processer og dysreguleret i inflammatoriske tilstande [19], herunder colitis ulcerosa [20]. Derfor miRNA dysregulering udgør en potentiel molekylær mekanisme for inflammatoriske veje til medierer kræft udviklingen og progressionen [21]. Især er ekspressionsniveauer af MIR-21 steg i aktiv inflammation i ulcerøs colitis, som kan være forbundet med øget risiko for udvikling af cancer med denne betingelse [22]. Opregulering af miR-21 er også blevet rapporteret i andre betændte stater, herunder allergisk luftvejsinflammation [23], inflammatoriske hudsygdomme [19] og

Helicobacter pylori

tilknyttet mavekræft [24]. MIR-21 er for nylig blevet påvist at være en ægte onkogen i præ-B-celle-lymfom [25] og fundet at være overudtrykt i de fleste tumortyper [26]. MIR-21 er en kraftig stimulator af væv og vaskulær invasion i kolorektal cancer og disse virkninger synes delvist medieret af dets evne til at forhindre translation af en af ​​MIR-21 målgener, programmeret celledød 4 (PDCD4) [27]. For nylig er en undersøgelse også vist signifikant nedregulering af PDCD4 i aktiv IBD sammenlignet med inaktiv IBD, som også korreleret med opregulering af MIR-21 [28], hvilket yderligere understøtter forbindelsen mellem inflammation, MIR-21 og carcinogenese.

Vores mål var at undersøge, om en funktionel interaktion eksisterer mellem COX-2 (pro-inflammatorisk enzym med forøget ekspression i CRC) og miR-21 (onkogenisk miR overudtrykt i CRC), der fører til nedregulering af tumoren suppressor PDCD4 i kolorektal cancer ikke forbundet med tidligere kronisk inflammatorisk sygdom.

Materialer og metoder

Humane væv

Denne undersøgelse modtaget etisk godkendelse fra Derbyshire Research etiske komité til indsamling af kolorektal cancer væv og matches normal slimhinde fra patienter, som gennemgik kirurgisk resektion for tarmkræft mellem august og december 2010 på Royal Derby Hospital, Derby, UK.

Alle patienter diagnosticeret med tyktarmskræft blev drøftet på Royal Derby Hospital kolorektal tværfaglig Team møde efter radiologisk iscenesættelse, og dem, anses for egnet til resektion med helbredende hensigt var berettiget til inklusion. Skriftligt informeret samtykke blev taget, og patienter, der ikke eller ikke villige til at give informeret samtykke, blev udelukket fra undersøgelsen, som var dem trække samtykke på ethvert tidspunkt.

Cell Culture

HCA-7-cellelinje blev opnået fra Sundhedsstyrelsen Culture Collection (HPACC, Porton Down, UK). Celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle Media (DMEM) (GIBCO, Paisley, UK) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Fisher Scientific, Loughborough, UK), 2 mM L-glutamin (Sigma-Aldrich, Poole, UK), penicillin ( 50 enheder /ml) og streptomycin (50 ug /ml) (Sigma-Aldrich). Celler blev dyrket i 75cm

3 ventilerede kolber (TSZ Scientific, Framingham, MA, USA) i befugtede inkubatorer ved 37 ° C med 5% CO

2 (Sanyo, Osaka, Japan).

cellelinie Transfektioner og behandlinger

celler blev podet ved 500.000 celler /brønd i en plade med 6 og inkuberet ved 37 ° C med 5% CO

2, indtil de nåede 70% konfluens.

For mIR-21 inhiberingsundersøgelser blev celler transficeret med mIR-21 inhibitor (100 nM) eller en negativ scrambled kontrol (100 nM) (miRIDIAN, Dharmacon Lafayette, CO, USA), ved anvendelse Dharmafect 2 lipid transfektionsreagens (Dharmacon Lafayette, CO, USA) ifølge producentens instruktioner.

i COX-2-inhibering, celler blev behandlet med serumfrit medium indeholdende kontrollen (0,1% DMSO) eller 100 uM NS398 (selektiv COX-2-inhibitor, Cayman Chemical, Michigan , USA) i 72 timer. For Prostaglandin E

2 (PGE

2) behandling blev cellerne dyrket 24 timer med serumfrit medium indeholdende DMSO vehikel alene eller 1 uM PGE

2, således at den endelige koncentration af DMSO i begge betingelser var den samme (0,1%). For kombineret MIR-21-inhibering og PGE

2 behandling, PGE

2 blev tilsat til kulturen 48 timer efter MIR-21 inhibitor transfektion og celler blev dyrket i yderligere 24 timer.

RNA analyser

Total RNA-ekstraktion blev udført under anvendelse TRI Reagent efter fabrikantens protokol (Sigma-Aldrich) og kvantificeret under anvendelse af et NanoDrop spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, dE, USA).

på miR -21 undersøgelser, i alt 6 ng total RNA blev anvendt til revers transkribere mIR-21 og RNU44 kontrol til cDNA efter TaqMan miRNA protokollen (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) under anvendelse hairpin primere rettet til mIR-21 og RNU44 som en kontrol i en thermocycler (GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems) i 30 min ved 16 ° C, 30 min ved 42 ° C, 5 min ved 85 ° C. Real-time kvantitativ polymerasekædereaktion blev derefter udført under anvendelse af miRNA specifik TaqMan probe-bestemmelser (MIR-21, ID 000.397; RNU44, ID 001.094; Applied Biosystems) i et Chromo4 thermal cycler (Bio-Rad Laboratories Ltd, Hemel Hempstead, UK). miR-21 ekspressionsniveauerne blev normaliseret til RNU44 og beregnes ved hjælp af 2

-ΔΔCt metode [29] ved hjælp af kommercielt tilgængelige normal colon RNA som kalibrator.

For

COX-2

PDCD4

analyser, 30 ng totalt RNA blev omdannet til cDNA med tilfældige hexamerer hjælp af TaqMan høj kapacitet cDNA revers transkription protokol (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Realtid PCR’er blev udført ifølge producentens instruktioner i en Chromo4 realtid variator (Bio-Rad Laboratories Ltd) under anvendelse af kommercielt tilgængelige 20x TaqMan assays (Applied Biosystems) for

PDCD4

(Hs00377253_m1) og

COX 2 Hotel (PTGS2 – Hs00153133_m1) sammen med de kontrol- generne

GAPDH

(Hs02258991_g1),

PGK1

(Hs00943178_g1) og

HPRT

(Hs01003267_m1). For eksperimenterne i cellelinjer, blev kvantificering udført i overensstemmelse med MIQE (Minimum Information til Offentliggørelse af kvantitativ real-time PCR Eksperimenter) retningslinjer [30] i forhold til det geometriske gennemsnit af reference- gener

GAPDH

,

PGK1-

,

HPRT

bruge Genex software (MultiD Analysis, Göteborg, Sverige). På grund af begrænset stikprøvens mængder, i humane væv udtryk blev kvantificeret relativt til

GAPDH

alene som beskrevet ovenfor for miR-21 analyser.

Protein analyser

Protein ekstraktioner og kvantificering var udført som tidligere beskrevet [31]. Western blotting blev udført under anvendelse af loading kontrol-anti-beta actin antistof (1:1000 fortynding Abcam, Cambridge, UK) i kombination med anti-PDCD4 antistof (1:500 fortynding; Sigma-Aldrich) eller anti-COX-2 (1 :1000 fortynding Abcam). Anti-kanin IgG antistof konjugeret til alkalisk phosphatase blev anvendt som sekundært antistof (1:30,000 fortynding DAKO, Ely, UK) til påvisning af primært antistof-binding. Immunkomplekser blev visualiseret ved forøget kemiluminescens under anvendelse af ECL-kittet (Bio-Rad) ifølge fabrikantens protokol. Det chemidoc system blev brugt til at fange billeder og Mængde One (Bio-Rad) software blev anvendt til kvantificering af bands intensiteter.

Elisa Analyse

PGE

2 niveauer blev målt i medier af HCA-7 behandlede og ubehandlede celler ved anvendelse af PGE

2 elisa detektion kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan USA) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Pladerne blev aflæst med en plade photocytometer ved 450 nm (Wallac 1420 Victor; Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA).

Statistical Analysis

Statistisk analyse blev udført under anvendelse af GraphPad Prism version 5.03 ( GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Den Kolmogorov-Smirnov test viste alle væv eksempeldata de at være ikke-parametrisk og alle celle line data til at være parametrisk. Derfor patientens data er udtrykt som medianer og interval, mens cellelinie data er udtrykt som middelværdi og standardfejl af middelværdien. The Wilcoxon-test (parrede data); Mann-Whitney U test (uparrede) og Kruskall-Wallis testen blev anvendt til komparativ analyse af patientens data. Den parrede t-test (parrede data); t-test (uparrede) og ANOVA testen blev anvendt til sammenlignende analyse af cellelinje data.

Statistisk signifikans blev bestemt ved p ≤ 0,05 for både patientens og cellelinie data.

Resultater

Stigning i miR-21 direkte vedrører stige i COX-2 mRNA-niveauer i CRC patienter

Vi har udført vores undersøgelse om primær kolorektal cancer væv og parret normal slimhinde indsamlet mellem august og december 2010 fra 45 elektive patienter med sporadiske tilfælde af CRC. Et prospektivt vedligeholdt database blev befolket med patientdemografi, neoadjuverende behandlingsformer og tumor egenskaber. Tumoren histopatologi blev klassificeret i henhold til den nationale minimum datasæt for tarmkræft designet af Royal College of Pathologists, UK [32]. Ingen patienter blev udelukket eller havde trukket sig ud af undersøgelsen, og ingen havde godartet sygdom. Den mediane alder var 69 (spændvidde 51-88) år, og de fleste var mandlige patienter. Fire patienter med endetarmskræft, der modtog neo-adjuverende kemo-strålebehandling var også inkluderet baseret på tidligere undersøgelser, der viser, at ekspressionen af ​​miR-21 svarer mellem udstrålede og ikke-udstrålede væv [33]. Alle patienter havde en komplet resektion og histologi bekræftet alle tumorer var adenokarcinomer. (Tabel S1 og S2 i File S1)

Brug af real time RT-PCR vi studerede udtryk for

COX-2

og miR-21 i tumorvæv sammenlignet med normal slimhinde i vores kohorte af CRC patienter. Relativ udtryk for miR-21 var signifikant opreguleret i CRC væv sammenlignet med den matchede normale slimhinde (p 0,0001, Wilcoxon matchede-par underskrevet rank test. Figur 1A). Desuden blev ekspressionsniveauer af MIR-21 korreleret med de almindeligt anvendte klinisk-patologiske træk for CRC (tabel 1). Højere ekspression af MIR-21 i tumorvæv signifikant korreleret med en dårligere Dukes stadium (p 0,0001, Kruskall-Wallis test. Figur 1B), lymfeknudemetastase (p 0,0001, Mann-Whitney U test;. Fig 1C) , og dybden af ​​tumorinvasion (pT-stadiet; p 0,0001, Mann-Whitney U test;. figur 1D). Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere rapporter [34], [35], og bekræfter, at miR-21 er opreguleret i CRC med stigende ekspressionsniveauerne korrelerer med øget sværhedsgrad af sygdommen.

Kolonne søjlediagrammer angiver medianen og whiskers demonstrere IQR af miR-21-ekspression. Bemærk, at signifikant stigning i miR-21-ekspression er observeret i tumorer, og dette øger yderligere med forværring etape, lymfeknude involvering og dybden af ​​invasion. Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af Wilcoxon-test i A, Kruskall-Wallis test i B, og Mann-Whitney U test i C og D.

Relativ udtryk for

PDCD4

var signifikant nedreguleret i CRC væv sammenlignet med matchede normal slimhinde (p 0,0001, Wilcoxon matchede-par signed rank test. figur 2A). Men der var ingen sammenhæng mellem

PDCD4

udtryk i tumorvæv og Dukes ‘stadium, med udtryk i Dukes’A etape bliver allerede faldet betydeligt i forhold til normalt væv, og ingen yderligere fald set i mere fremskredne stadier ( fig. 2B). Det er usandsynligt, at den observerede nedregulering af

PDCD4 dele på RNA-niveau er forårsaget af MIR-21 eftersom denne mikro-RNA virker til at forhindre PDCD4 mRNA translation snarere end inducere dets nedbrydning eller transkriptionel repression [27]. I betragtning af, at alle de undersøgte patienter gennemført ondartede svulster med en tildelt Dukes ‘stadium, data tyder på, at i løbet af progression af malignitet stigende mængder af miR-21 fører til hæmning af oversættelse af den allerede nedsatte niveauer af

PDCD4

mRNA. Etik begrænsninger forhindrede os i at analysere PDCD4 protein niveauer i disse patienter til at bekræfte denne hypotese, og vi gentog til

in vitro

undersøgelser for at få mekanistiske indsigt (se næste afsnit).

Kombineret relative udtryk for PDCD4 og COX-2 blev analyseret i primær tumor versus matchede tilstødende normale mucosa (n = 45; A og C henholdsvis), og er i normal (N) og tumor (T) væv fra Dukes ‘A (n = 9), B (n = 23) og C (n = 13) trin (B og D). Kolonnen søjlediagram viser medianen og knurhår demonstrere IQR af mRNA-ekspression. Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af Wilcoxon-test i A og C; Den Kruskall-Wallis test i B og D. Bemærk at

PDCD4

nedreguleres i tumor versus normal, men ingen forskel ses i den resterende udtryk i tumorer i forskellige Dukes ‘stadier. Derimod

COX-2

niveauerne stiger i tumor og med sygdom scene.

Interessant relative udtryk for

COX-2

mRNA var signifikant opreguleret i tumorvæv sammenlignet med deres matchede normal slimhinde (p 0,0001, Wilcoxon matchede-par signerede rank test;. figur 2C). Desuden, i lighed med hvad der blev observeret med MIR-21, relative ekspression af

COX-2

mRNA i tumorvæv signifikant korreleret med en dårligere Dukes stadium (p 0,0001, Kruskall-Wallis test. Fig 2D) . I betragtning af, at miR-21 og inflammation har begge vist sig at nedsætte PDCD4 protein niveauer [27], [36], en mulig fortolkning af disse resultater er, at stigningen i miR-21 og

COX-2

kan være funktionelt relaterede og at de kunne føre til nedregulering af PDCD4 gennem en fælles vej.

HCA-7 celler er et passende system til at analysere forholdet mellem miR-21 og COX-2 overekspression i CRC

for yderligere at undersøge potentialet i en funktionel sammenhæng mellem COX-2 og miR-21 i nedregulering af PDCD4 i CRC vi gentog en

in vitro

cellekultur system. Vi valgte den humane colon-adenocarcinom-cellelinje HCA-7 isoleret fra en Dukes ‘B tumor [37], fordi det har høje endogene niveauer af COX-2 [38] og efter behandling med COX-2-inhibitor NS398 øger ekspression af

PDCD4

[39]. For at afgøre, om HCA-7 celler er et godt system til at studere den funktionelle forhold mellem miR-21 og COX-2 veje, vi først brug for at afgøre, om miR-21 udtrykkes og er ansvarlig for

PDCD4

nedregulering i disse celler. For at opnå disse anvendte vi RT-PCR for at undersøge niveauerne af MIR-21 i ubehandlede HCA-7 celler eller i celler behandlet med 100 nM af et MIR-21 inhibitor eller scramble kontrol baseret på publicerede arbejde, der viser, at denne koncentration er ikke-cytotoksiske og effektive i inhibitoriske undersøgelser [40]

Vi fandt, at mIR-21 udtrykkes i høje niveauer i HCA-7 celler, og disse niveauer er ikke påvirket af behandling med scramble små RNA’er, men er signifikant reduceret (p. 0,0001 , uparret t-test) efter 72 timers behandling med en specifik mIR-21 lille RNA inhibitor (fig. 3A). Ingen signifikante forskelle i PDCD4 mRNA-niveauer blev observeret ved kvantitativ RT-PCR i nogen af ​​behandlingsgrupperne betingelser (Fig 3B.); Derimod blev en signifikant stigning (p = 0,002, uparret t-test) i PDCD4 observeret ved proteinniveauet ved western blot i Mir-21 inhibitor behandlede celler sammenlignet med ubehandlede eller scramble kontrolbehandlede celler. Disse resultater er i overensstemmelse med miR-21 handler at hæmme translation af PDCD4 mRNA snarere end at dirigere sin nedbrydning og bekræfter, at miR-21 spiller en rolle i PDCD4 nedregulering i HCA-7 celler. Derfor kan både COX-2 og MIR-21 pathways bidrager til nedregulering af PDCD4 i HCA-7 celler, hvilket gør dem et passende system til at undersøge, om der eksisterer et funktionelt forhold mellem de to veje.

Efter 72 timer fra transfektion signifikant fald i mIR-21, ses kun i celler transficeret med mIR-21-inhibitor (A).

PDCD4

mRNA niveauer blev ikke påvirket af inhibering af MIR-21 (B). Western blot analyse af PDCD4 (C toppanelet for en repræsentativ blot) afslører en betydelig stigning i proteinniveauer i celler transficeret med inhibitoren sammenlignet med ubehandlede eller scramble kontrolbehandlede celler, når kvantificeres relativt til beta actin protein (BACT) som en loading kontrol (C bundpanel). Kolonnen søjlediagram angiver middelværdien og whiskers demonstrerer standardfejlen af ​​middelværdien (SEM). Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af uparret t-test. Forsøg blev gentaget tre gange og analyseret in duplo. Ubehandlet = celler kultur i medierne; Scramble = celler transficeret med scramble RNA-hæmmere; miR-21 inhibitor = celler behandlet med miR-21-RNA-hæmmer.

Forholdet mellem miR-21 og COX-2 i nedregulering af PDCD4 i HCA-7 celler

Til yderligere at undersøge den funktionelle interaktion mellem MIR-21 og COX-2 veje, vi først analyseret COX-2-mRNA og protein niveauer i HCA-7 celler efter 72 timers behandling med MIR-21 inhibitor sammenlignet med scramble kontrol og ubehandlede celler. Ingen forskel i COX-2 ekspression blev observeret hverken i mRNA’et eller på proteinniveauet niveauer (p = 0,62 og p = 0,83 respektivt, uparret t-test), der viser, at COX-2 er ikke et mål på MIR-21 (fig. S1 i File S1).

Vi næste behandlet HCA-7-celler med 100 uM NS398, en specifik COX-2-inhibitor rapporteret at være ikke-cytotoksiske og effektive ved denne koncentration i cellekultur [41], eller med vehikel alene (0,1% DMSO). COX-2 spiller en kritisk rolle under inflammation i de indledende trin i omdannelsen af ​​arachidonsyre til prostaglandiner herunder prostaglandin E (PGE

2) og opregulering af COX-2 i kolorektal cancer er blevet vist at associere med markant stigning i produktionen af ​​PGE

2 [42]. Anvendelse af ELISA til at måle niveauer af PGE

2 fandt vi en signifikant reduktion (p = 0,006, uparret t-test) i medierne af celler behandlet med NS398 sammenlignet med ubehandlede celler eller celler behandlet med vehikel alene, i overensstemmelse med inhibering af COX 2 katalytisk aktivitet (fig. S2 i File S1).

har etableret behandlingens effektivitet målte vi derefter den relative ekspression af mIR-21 og vi kunne detektere et signifikant fald i mIR-21 efter NS398 behandling i 72 time (p 0,01, uparret t-test;. figur 4A). Derimod har behandling af HCA-7-celler med NS398 ikke ændre ekspression af PDCD4 mRNA (p = 0,74, uparret t-test) (fig. 4B), en iagttagelse, der er i modsætning til den tidligere rapporterede 1,5 gange opregulering af PDCD4 mRNA efter behandling af HCA-7-celler med NS398 [39]. Forskellen kan skyldes de anvendte metoder: sidstnævnte undersøgelse analyserede PDCD4 mRNA-ekspression ved Northern blot og kvantificeres det relativt til GAPDH, mens vi i vores undersøgelse har målt mRNA niveauer ved hjælp af kvantitativ RT-PCR og normaliseret dataene ved hjælp af den geometriske gennemsnit af tre referenceår gener (GAPDH, PGK og HPRT) i overensstemmelse med de MIQE retningslinjer [30] (se metoder). Vores real time PCR data antyder, at NS398 behandling fører til et fald i GAPDH-niveauer (fig. S3 i File S1) og denne ændring vil resultere i en tilsyneladende stigning i PDCD4 niveauer, hvis GAPDH blev anvendt som den eneste reference-genet. Derfor konkluderer vi, at NS398 behandling ikke ændrer PDCD4 transskription sats eller mRNA stabilitet; imidlertid i overensstemmelse med den observerede nedgang i MIR-21, signifikant opregulering i PDCD4 proteinekspression (p 0,001, uparret t-test) blev observeret i NS398 behandlede celler sammenlignet med ubehandlede eller bærestof celler (figur 4c.). Disse data indikerer, at nedregulering af PDCD4 af COX-2 er ikke en konsekvens af nedsat PDCD4 mRNA-syntese eller stabilitet, men snarere, at COX-2 kan virke ved at fremme en forøgelse af MIR-21, der på sin side inhiberer translation af PDCD4 mRNA.

Efter 72 timers behandling signifikant fald i mIR-21 niveauer ses i NS398 behandlede celler (A).

PDCD4

mRNA-niveauer påvirkes ikke af NS398 behandling (B). Western blot analyse af PDCD4 (C toppanelet for en repræsentativ blot) afslører en betydelig stigning i proteinniveauer i NS398 behandlede celler sammenlignet med ubehandlede eller vehikel alene (DMSO) behandlede celler, når kvantificeret relativt til beta actin protein (BACT) som et ladningskontrol (C bundpanel). Kolonnen søjlediagram angiver middelværdien og whiskers demonstrerer standardfejlen af ​​middelværdien (SEM). Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af uparret t-test. Forsøg blev gentaget tre gange og analyseret i tre eksemplarer. Ubehandlede = celler dyrket i medier; DMSO = dyrket i medier suppleret med 0,1% DMSO-vehikel-celler; NS398 = celler dyrket i medier suppleret med NS398 forberedt i DMSO til en slutkoncentration på 100 uM NS398 og 0,1% DMSO.

COX-2 aktivering af MIR-21 i HCA-7 celler medieres af PGE

2

i betragtning af den rolle, COX-2 i produktionen af ​​prostaglandiner, for at undersøge den mekanisme der ligger til grund aktivering af mIR-21 ved COX-2 behandlede vi HCA-7-celler med 1 pM PGE

2 for 24 timer som denne koncentration viste sig at arbejde effektivt på disse celler [38]. Vi fandt, at MIR-21-ekspression var betydeligt opreguleret (p = 0,019, uparret t-test) i PGE

2-behandlede celler sammenlignet med vehikel (0,1% DMSO) behandlede eller ubehandlede celler (fig. 5A). Der blev ikke observeret ændringer i PDCD4 mRNA-niveauer i PGE

2 behandlede celler (. figur 5B); imidlertid et signifikant fald (p 0,05, uparret t-test) blev observeret i PDCD4 proteinniveauer som parallelt stigningen i MIR-21 (figur 5C.). Kombineret behandling med PGE

2 og miR-21 hæmmer bragt niveauerne af miR-21 ned til niveauer sammenlignelige med dem i ubehandlede celler (fig. S4 i File S1), og behandling med aspirin også ført til et fald i miR- 21 niveauer (fig. S5 i File S1). Disse data antyder, at COX-2 drevet nedregulering af PDCD4 i dette modelsystem skyldes hovedsagelig PGE

2 inducerede opregulering af MIR-21.

Efter 24 timers behandling signifikant stigning i MIR-21 niveauer ses i PGE

2-behandlede celler (A).

PDCD4

mRNA-niveauer påvirkes ikke af PGE

2 behandling (B). Western blot analyse af PDCD4 (C toppanelet for en repræsentativ blot) afslører et signifikant fald i proteinniveauer i PGE

2-behandlede celler sammenlignet med ubehandlede eller vehikel alene (DMSO) behandlede celler, når kvantificeret relativt til beta actin protein ( BACT) som en loading kontrol (C nederste panel). Kolonnen søjlediagram angiver middelværdien og whiskers demonstrerer standardfejlen af ​​middelværdien (SEM). Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af uparret t-test. Forsøg blev gentaget tre gange og analyseret in duplo. Ubehandlede = celler dyrket i medier; DMSO = dyrket i medier suppleret med 0,1% DMSO-vehikel-celler; PGE

2 = celler dyrket i medier suppleret med PGE

2 udarbejdet i DMSO til en slutkoncentration på 1 uM PGE

2 og 0,1% DMSO.

Diskussion

dysregulering af miRNA er en anerkendt trin i patogenesen af ​​mange cancertyper, herunder CRC. MIR-21 er en miRNA ofte opreguleres i CRC, hvis forøget ekspression niveauer er forbundet med fattigere terapeutiske resultater i CRC [34]. Vi har bekræftet, at overekspression af miR-21 korrelerer signifikant med dårligere patologisk iscenesættelse i vores CRC patientens kohorte (fig. 1), består af patienter, der præsenteres med tumorer af en tildelt Dukes ‘stadium, hvilket tyder på en vigtig rolle for miR-21 i kræft invasion og formidling.

Kun få af de potentielle downstream mål reguleret af miR-21 er blevet bekræftet, og disse omfatter den programmerede celledød 4 (PDCD4) tumorsuppressorgen der hæmmer neoplastisk transformation [43]. Nylige undersøgelser har vist en gradvis reduktion i PDCD4 udtryk fra normal slimhinde, til polyp, til kolorektal tumor [33]. Interessant en betydelig stigning i MIR-21 blev set i CRC forhold til normal, men ikke mellem adenomatøse polypper og normale, selv om et fald i PDCD4 ekspression var tydelig ved denne overgang [33]. I vores kohorte observerede vi et fald i PDCD4 mRNA-niveauer i tumorerne i forhold til de normale væv, men ingen ændringer som sygdommen skred af Dukes stadium (fig. 2A). Tilsammen disse observationer antyder, at ved overgangen fra normal til hyperproliferation nedregulering af PDCD4 kan skyldes regulering på niveauet for transkription og /eller RNA og protein stabilitet. Men i overgangen til malignitet miR-21 medieret hæmning af oversættelse af PDCD4 protein niveauer i allerede nedsatte niveauer af

PDCD4

mRNA bliver fremherskende og dermed fremme en yderligere progression af malignitet. Derfor bestemme opstrøms faktorer, der påvirker miR-21 udtryk er medvirkende til at fastslå, om og hvordan miR-21 bidrager til malignitet progression og at give potentielle terapeutiske mål.

Da der i vores kohorte af CRC patienter opregulering af miR- 21 er en positiv sammenhæng med den for COX-2-mRNA og med dårligere patologisk mellemstation (fig. 1 og 2B), vi den hypotese, at mIR-21 opregulering i CRC kan være sammenkædet med en inflammatorisk respons. Tabel S2.