PLoS ONE: Udvikling og karakterisering af Blære kræftpatient-afledte Xenografter for molekylært Guided Målrettet terapi

Abstrakt

Baggrund

Det overordnede mål med projektet er at etablere en patient-afledt blærekræft xenograft (PDX) platform, kommenteret med dyb sekventering og patient kliniske oplysninger, for at fremskynde udvikling af nye behandlingsmuligheder for patienter blærekræft. Heri beskriver vi skabelsen, første karakterisering og anvendelse af platformen til dette formål.

Metoder og Resultater

Toogtyve PDXs med kommenteret klinisk information blev etableret fra dyrkede uselekterede klinisk blære kræft prøver i immundefekte NSG mus. Den morfologiske fidelity blev opretholdt i PDXs. Hele exome sekventering afslørede, at PDXs og parentale patientgrupper cancere delt 92-97% af genetiske afvigelser, herunder multiple druggable mål. For narkotika nyorientering, en EGFR /HER2 dual inhibitor lapatinib var effektiv i PDX BL0440 (progressionsfri overlevelse eller PFS på 25,4 dage versus 18,4 dage i kontrol, p = 0,007), men ikke i PDX BL0269 (12 dage versus 13 dage i kontrollen, p = 0,16), selv om begge udtrykt

HER2

. Til skærm til den mest effektive MTT, vi evalueret tre lægemidler (lapatinib, ponatinib, og BEZ235) matches med afvigelser i PDX BL0269; men kun en PIK3CA inhibitor BEZ235 var effektiv (p 0,0001). For at undersøge mekanismerne ved sekundær resistens, et fibroblastvækstfaktorreceptor 3 inhibitor BGJ398 forlænget PFS of PDX BL0293 fra 9,5 dage i kontrollen til 18,5 dage (p 0,0001), og serielle biopsier viste, at MAPK /ERK og PIK3CA-AKT pathways blev aktiveret ved resistens. Inhibering af disse veje signifikant forlænget PFS fra den 12. dag i kontrollen til 22 dage (p = 0,001). For at screene for effektive kemoterapeutiske lægemidler, fire af de første seks PDXs var følsomme over for cisplatin /gemcitabin kombination, og kemoresistens til én narkotika kunne overvindes ved det andet lægemiddel.

Konklusion

PDX modeller her beskrevne viser god korrelation med patienten på det genomiske niveau og kendt patientens respons på behandlingen. Dette understøtter yderligere evaluering af de PDXs for deres evne til præcist at forudsige en patients reaktion på nye målrettede og kombination strategier for blærekræft

Henvisning:. Pan Cx, Zhang H, Tepper CG, Lin Ty, Davis RR, Keck J et al. (2015) Udvikling og karakterisering af blærekræft Patient-Afledte Xenografter til molekylært Guided målrettet terapi. PLoS ONE 10 (8): e0134346. doi: 10,1371 /journal.pone.0134346

Redaktør: Chandan Kumar-Sinha, University of Michigan, USA

Modtaget: Januar 20, 2015; Accepteret: 8 Juli 2015; Udgivet: 13 August, 2015

Dette er en åben adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Data Tilgængelighed: Information om alle de blærekræft PDX modeller fås fra JAX PDX portal vært ved Mouse Tumor Biology (MTB) database (http : //tumor.informatics.jax.org/mtbwi/pdxSearch.do)

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af: Veteran Administration Karriereudvikling Award (PI:. Pan); Veteran Administration Merit (PI: Pan; Grant #: 1I01BA001784); NCI Cancer Center Support Grant (PI: de Vere White; Grant #: 2 P30 CA 0.933.730); Den Laney Foundation (PI: de Vere hvid). Ingen finansieringsorganer havde nogen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Indledning

Blærekræft er blandt de ti mest almindelige [1], men den mest dublerede og underfinansierede, cancere [2]. Der er to store grupper af blærekræft: ikke-myoinvasive og fremskreden kræft. Ikke-myoinvasive blærekræft (NMIBC) tegner sig for 80% af tilfældene ved diagnose. De er som regel behandlet med transuretral resektion og, i de fleste tilfælde, intravesikal terapi. Men cirka 60% af patienterne vender tilbage på to år, og 25% fremgang til fremskredne stadier [3-5]. Det er disse 20% tilfælde med fremskredne stadier på diagnose og 25% af NMIBC sager, der skred til fremskredne stadier, der tegner sig for den høje dødelighed af blærekræft. Meget giftig platinbaseret kemoterapi er almindeligt anvendt til behandling af fremskreden blærekræft med en svarprocent på omkring 50% [6]. Selvom cellelinier er almindeligt anvendt til prækliniske undersøgelser, korrelationen af ​​lægemiddel følsomhed mellem cellelinier og kliniske forsøg er generelt dårlig [7]. Hidtil ingen test er til rådighed til at identificere effektive kemoterapi før administration af behandlingen. Hvis patienter er diagnosticeret med lokalt fremskreden blærekræft uden metastase, er radikal cystektomi normalt udføres der er forbundet med den værste sundhedsrelaterede livskvalitet på grund af selve operationen og tilhørende postoperative komplikationer [8,9]. I tilfælde af tilbagefald eller prognose, er der ingen standard second-line kemoterapi. Der er ikke nogen målrettet terapi godkendt af den amerikanske Food and Drug Administration (FDA), selv om tilbagevendende genetiske afvigelser er blevet identificeret. Der er ingen signifikant forbedring i samlet overlevelse og prognose i de sidste tredive år [10]. Derfor er der er en kritisk udækket behov i blærekræft at vælge en effektiv first-line og bjærgning kemoterapi, og udvikle målrettede terapi.

Dette projekt er at udvikle patient-afledte xenografter (PDXs) for at forbedre behandlingsresultater af blære kræft. Mange dyremodeller der i øjeblikket anvendes i kræftforskning, såsom mus xenografter udviklet af kræft cellelinjer og gensplejsede musemodeller (GEMM). Selvom disse modeller har gjort et fantastisk bidrag til kræftforskning, de falder kort til at opfylde de individuelle patient-specifikke behov i en tid med præcision medicin. Den seneste udvikling i og konvergens af kræft biologi, “omics” teknologier, computational biologi og lægemiddeludvikling revolutionerer målrettet terapi og fører til et nyt niveau af “molekylært guidet målrettet terapi (MTT)”, hvilket betyder, matching målrettet behandling med patient-specifikke genetiske afvigelser i kræft. viste imidlertid to nylige kliniske forsøg, der matcher MTT mod patient-specifikke genetiske afvigelser var forbundet med skuffende responsrater på 12% og 9% [11,12]. Den lave svarprocent på MTT er delvist tilskrives det faktum, at de fleste kræftformer havnen flere genetiske afvigelser [13-16], og at de nuværende beregningsmæssige biologi teknologier er i stand til håndfast at skelne driver mutationer (dem kritisk for kræft celle funktioner) fra personbiler mutationer (dem, der har lidt funktionel konsekvens for kræftceller). Vi foreslog, at patienten specifikke PDX platform udviklet her ikke kun potentielt kan bruges til screening for den mest effektive MTT til at målrette de molekylære drivere og effektiv first-line og redde kemoterapi, men også for narkotika nyorientering og studere af sekundære resistensmekanismer at vejlede yderligere personlig terapi og lægemiddeludvikling.

Metoder

udvikling af patient-afledt blære kræft implanteret

Den protokol til at indsamle kliniske informationssystemer og kræft prøver fra patienter blev godkendt af University of California Davis Institutional Review Board (protokol nr 218.204). Alle deltagere forudsat skriftligt informeret samtykke før deltagelse i denne undersøgelse, og før eventuelle prøver eller kliniske oplysninger blev indsamlet. Dyret Protokollen blev godkendt af Jackson Laboratory (JAX) Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC, protokol nr 12027) og UC Davis IACUC (protokol nr 17794).

Friske kliniske kræft prøver (3 -5mm

3) blev implanteret subkutant i flankerne af 4-5 uger gamle NOD.Cg-

Prkdc

scid

Il2rg

tm1Wjl

/SzJ (aka, NSG) mus. For hver patientprøve, blev fem NSG mus implanteret og overvåges for tumorvækst i op til fem måneder. En ortotopisk PDX model blev genereret via injektion af enkelt celle suspension fra subkutane PDXs i musen blærevæggen.

RNA isolering

Hematoxylin og eosin pletten blev udført, og de slides blev gennemgået for at sikre, at der på mindst 85-90% af cellerne var kræftceller før prøvetagning. Totalt cellulært RNA blev isoleret fra enten friske frosne xenograft tumorstykker vha TRIzol Plus RNA Purification Kit (Life Technologies) eller fra formalinfikserede, paraffinindlejrede (FFPE) prøver (8 x 12-um snit) ved hjælp af miRNeasy FFPE Kit (Qiagen) ifølge producentens protokoller. Totalt RNA blev elueret fra søjlerne i nuklease-frit vand og opbevaret ved -80 ° C. RNA koncentration og renhed blev vurderet med en NanoDrop 2000 spektrofotometer (Thermo Scientific) og kvalitetsvurderinger (

e

.

g

., RNA integritet) blev foretaget ved hjælp af en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) . For miRNA ekspression profilering, blev totalt cellulært RNA (herunder små RNA-fraktion) isoleret fra FFPE blærekræft prøver vha den miRNeasy FFPE Kit (Qiagen) ifølge producentens protokol.

DNA isolation

DNA blev isoleret fra frisk frosset eller FFPE patient tumor og xenograft prøver (5 x 20-um snit) ved hjælp standard QIAamp DNA eller QIAamp DNA FFPE Tissue Kits (Qiagen).

Transkriptomet profilering af RNA-sekventering (RNA -Seq)

RNA-Seq bibliotek forberedelse og sekventering.

Transkriptomet profilering af P0 (passage 0) blærekræft xenotransplantattumorer blev udført af RNA-Seq analyse. RNA-sekventering (RNA-Seq) biblioteker blev fremstillet ud fra 1 ug totalt RNA ved anvendelse af TruSeq RNA Prøveforberedelse v2 Kit (Illumina, San Diego, CA) ifølge fabrikantens protokol. Kort fortalt blev polyadenyleret mRNA oprenset fra totalt RNA og ribosomale RNA fjernet ved to runder af binding til magnetiske oligo-dT-perler efterfulgt af RNA fragmentering, eluering og priming ved inkubation ved 94 ° C i 8 minutter. Dobbeltstrenget cDNA blev derefter frembragt ved vilkårligt primet første-streng syntese med SuperScript II revers transkriptase og efterfølgende anden streng syntese med RNase H og DNA Polymerase I. cDNA’et blev stump-endet med T4 og Klenow-DNA-polymeraser til fjernelse af 3 ‘ -overhangs og udfylde 5′-overhæng, phosphorylerede med T4 PNK, og derefter 3’-A tailed ved inkubering med Klenow Fragment (3’→ 5’exo-) og dATP. Illumina parrede-ende (PE), blev indekseret adaptere derefter ligeret, efterfulgt af oprensning med AMPure XP perler. Biblioteket blev derefter beriget med high-fidelity PCR-amplifikation (15 cyklusser) og adapter-specifikke primere. Den molære koncentration af bibliotekerne blev bestemt ved at måle koncentrationen med en qubit fluorometer (Invitrogen), bestemme indsatsen længde med en Agilent 2100 Bioanalyzer, og derefter qPCR-baserede kvantificering (KAPA Bibliotek Kvantificering Kit). Biblioteker blev forelagt New York Genome Center for 100-bp parret ende, multiplex sekventering på en HiSeq 2000 sekventering-system (8 biblioteker pr bane, 2 baner).

RNA-Seq dataanalyse

.

Billedbehandling, basen ringer, kvalitet scoring (Phred), og prøve demultipleksing blev henrettet af HiSeq Control software med Real Time Analysis (HCS 1.5 /RTA 1.13) og casava 1,8 software (Illumina, San Diego, CA). Analyse af RNA-Seq data blev udført under anvendelse af en standard TopHat-Manchetknapper workflow [17]. Sekvens læser (FASTQ format) blev klassificeret som menneske (graft) eller mus (host) ved hjælp Xenome [18] og efterfølgende justeret til det humane genom samling henvisning (feb 2009 GRCh37 /hg19) med TopHat, der giver mulighed for højst to uoverensstemmelser; TopHat udnytter Bowtie aligner [19] og omfatter et værktøj til kortlægning splejsesamlinger [20] for RNA-Seq læste tilpasning til referencen humane genom sekvens (GRCh37 /hg19). Gen- og udskrift-niveau ekspression blev omfattende kvantificeret med Manchetknapper software [21] for

1)

udskrift samling,

2)

identifikation af splejsningsvarianter, og 3) kvantificering af normaliseret udtryk som FPKM (fragmenter pr kilobase af udskrift per million kortlagt læser) værdier.

hele-exome sekventering (WES)

Udarbejdelse af hele exome-capture sekventering biblioteker og sekventering.

DNA prøver blev forberedt til hel-exome sekventering på Illumina platformen udnytte SureSelect

XT Target Enrichment System (Agilent), sammenholdt med SureSelect

XT Menneskelig All Exon V4 + UTR’er capture bibliotek. Dette blev udført ifølge fabrikantens protokoller og fortsatte i 3 generelle trin begynder med DNA-fragmentering, efterfulgt af biblioteket forberedelse, og målrettet berigelse for alle exoner og utranslaterede regioner (UTR’er). Højmolekylært DNA (3 ug) blev klippet i fragmenter med gennemsnitlige maksimale størrelse på 150-200 bp under anvendelse af en Covaris S220 fokuserede-ultralydsapparat og derefter oprenset under anvendelse Agencourt AMPure XP magnetiske perler. Standardprotokoller blev anvendt til adaptorligering, indeksering, high-fidelity PCR-amplifikation. Efterfølgende blev exome berigelse udført af hybrid capture med All Exon v4 + UTR’er capture bibliotek (789.141 biotinylerede, ultra-lange RNA oligomer lokkemad) for at fange de målrettede sekvenser spænder 71Mb af genomet og omfattende af 20,965 gener og 334,378 exons. Capture biblioteker blev forstærket, samlede, og indsendes til New York Genome Center for 100-bp parret ende, multiplex sekventering på en HiSeq 2000 sekventering systemet (4 biblioteker pr bane).

WES dataanalyse.

Sekundær analyse af WES data bestod af læse tilpasning til referencen genom sekvens (GRCh37 /hg19) ved hjælp af Burrows-Wheeler Aligner (BWA) [22] og anvendelse Genome Analysis Toolkit (GATK) [23] for basen kvalitet score rekalibrering, Indel udretning, to eksemplarer fjernelse, og udførelse af SNV og INDEL opdagelse og genotypning på tværs af alle prøver samtidigt ved hjælp af standard hårde filtrering parametre eller variant kvalitet score rekalibrering [24]. Før justering, læser var fejl-trimmet før forekomsten af ​​en lav kvalitet base (Phred score ≤20). Hertil kommer, for analyse Wes data fra xenograft væv, såvel som patientens tumor data brugt i sammenligninger, Xenome blev anvendt til human /mus læse klassificering og bestemmelse af niveauer af muse genomisk kontaminering [18]. Ydeevne statistik for næste generations sekventering og efterfølgende analyser, herunder det samlede antal af læser, procentdel mapping, og den menneskelige /mus læse klassificering, indgår i S1 Bord og S2 tabel.

Efter anvendelsen af ​​GATK, varianter blev filtreret for dem, der har bekræftet somatisk mutation status og /eller er blevet identificeret som en somatisk mutation i mindst en tumor ved hjælp af komplet katalog af somatiske mutationer i Cancer (COSMIC) og The Cancer Genome Atlas (TCGA) databaser. For yderligere at definere sandsynligheden for en tidligere bekræftet somatisk variant som værende en somatisk aberration i disse PDX tumorer, blev der indført et ekstra filter til selektion for variant allel fraktioner i området fra 10-40% eller 60-90%, hvilket tyder tilstedeværelsen af ​​tumor heterogenitet og at varianten blev afledt af en tumor sub-population. Langs disse linjer, flere varianter med “afledt somatisk” status opfyldte disse kriterier, og var også inkluderet i resultaterne. Selv om disse ikke svarer til en eksakt match i COSMIC eller TCGA blev filtreringen udført med Ingenuity Variant Analysis (Qiagen, Inc.) til

1)

udelukke varianter, der er forbundet med normal menneskelig genetisk variation identificeret fra stor- skala sekventering projekter, herunder 1.000 genomer Project, Complete Genomics Public genomer, NHLBI GO Exome Sequencing Project (ESP), og dbSNP, og 2) at identificere “ikke-dbSNP” varianter med mellemliggende allelfrekvenserne der ville være karakteristisk for varianter stede i en heterogen tumor snarere end i kimcellelinje.

Effekt undersøgelse

Denne protokol blev godkendt af UC Davis Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC, protokol # 17794) før studere indvielse. Alle dyreforsøg fulgte IACUC retningslinjer. Kvindelige NSG mus i en alder af 4-5 uger blev bestilt fra JAX, og fik mindst en uge til at akklimatisere sig til det nye miljø før ind i studiet. At etablere flere PDXs at tillade effektstudier med flere lægemidler, blev PDXs fra Passage 2-4 hakket i 3-5 mm

3 og injiceres i flere mus enten subkutant i flanken eller ortotopisk i den muskulære lag af blærevæggen. Når subkutane tumorstørrelser nået ~ 200 mm

3, mus blev behandlet med målrettede terapeutiske midler matches med de genetiske ændringer identificeret gennem dyb sekventering som beskrevet ovenfor (S1 Fig). De følgende lægemidler blev anvendt i denne undersøgelse: sEphB4-HSA blev udviklet ved konjugering af opløselige EphB4 til humant serumalbumin. Den blev leveret af Parkash Gill, MD, ved University of South California. Andre lægemidler, herunder BGJ398 og BEZ235, blev købt fra Selleck kemikalier (Houston, TX). For hver behandlingsgruppe blev 8-10 mus bruges til at tillade statistisk analyse. Musene blev overvåget for tumorvækst og ændringer i kliniske parametre såsom vægt ændringer, bortskaffelse af affald, pels tekstur, farve, urin pletter, skorpedannelse omkring øjnene, aktivitetsniveau og kropsholdning. Mus blev aflivet, når tumorstørrelsen nåede fem gange baseline størrelse (omkring 1.000 mm

3). Adskillige mus blev aflivet før behandlingen startede eller under behandlingen for at bestemme de nedstrøms signalvej aktiviteter, der benytter western blot, immunhistokemisk farvning eller immunfluorescensfarvning. Mus blev aflivet ved pentobarbital overdosis (180 mg /kg) eller pentobarbital overdosis (60 mg /kg) efterfulgt af cervikal dislokation.

Statistisk analyse

Forsøgene blev gentaget mindst tre gange. Statistisk analyse blev udført ved anvendelse af GraphPad InStatTM software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) og ANOVA (variansanalyse) blev udført for at sammenligne forskellene i de tre behandlingsgrupper. Alle resultater blev udtrykt som middelværdien ± standardfejlen medmindre andet er angivet. En værdi på p 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Etablering af patient afledte xenotransplantater (PDX) fra urotelial karcinom

Til dato har vi etableret 22 PDXs fra. blære kræftpatienter, der repræsenterer 41% af tumorerne implanteret. Blandt disse 22 PDXs blev 13 PDXs afledt fremskreden blærekræft, og 9 PDXs fra NMIBC. De kliniske karakteristika er vist i tabel 1. Den mediane alder donor patienter var 74 år (spændvidde: 54-83). Fem af de 13 PDXs afledt af fremskreden blærekræft modtaget tidligere neoadjuverende kemoterapi før implantation, mens ingen af ​​de NMIBC gjorde det.

Tyve to PDXs blev udviklet, herunder 13 fra fremskreden blærekræft og 9 fra ikke-myoinvasive blærekræft .

Morfologisk troskab mellem patient tumorer og tilsvarende xenografter

Vi sammenlignede morfologi patientens blære tumorer og tilsvarende PDXs på forskellige passager. Den morfologiske fidelity blev opretholdt fra patienttumorceller enheder gennem passagen 6 (Fig 1A). Morfologien af ​​subkutane og ortotopisk blærekræft PDXs blev også opretholdt (Fig 1A højre paneler). Kræftceller i PDXs blev farvet positiv med et anti-humant Ki67-antistof, der bekræfter, at kræftcellerne i PDXs faktisk var af human oprindelse. Over 90% af PDX blære cancerceller udtrykte Ki67, en markør for celleproliferation (Fig 1B). I overensstemmelse med dette fund, PDX tumorvolumen fordoblingstiden var mellem 10-20 dage. Selvom PDXs blev udviklet fra inokulering af kliniske prøver, der omfattede støtte humane stromaceller blev der ikke stromaceller i PDXs farvet positive med et anti-humant vimentin antistof, hvilket antyder, at stromacellerne i PDXs var af museoprindelse (Fig 1C). Dette er yderligere bekræftet af observation af varierende niveauer af muse-afledte sekvens læser stede i den næste generation sekventering (NGS) data (S2 tabel). Nogle humane blære cancerceller og stromale celler i de kliniske cancer prøver samt kræftceller i PDXs, blev farvet positive for humant vimentin. Da disse NSG mus ikke har nogen art killer (NK) celler, T- og B-lymfocytter, ingen lymfocyt, ved morfologi, blev observeret i PDXs.

(A) Sammenligning af morfologi mellem patientprøver og PDXs, subkutan og ortotopisk PDXs, af PDX BL0293 og BL0440. Hematoxylin og eosin farvning (H 20 og forekommer ved en allel frekvens på ≥0.5. Af det samlede antal varianter identificeret i BL0429 (n = 15.653) og BL0440 (n = 16.916) patientens tumorer, blev 91,8% og 97,6% af disse konserverede i P0 tumor (figur 2). For formodede somatiske mutationer (

e

g

, ikke-synonyme og indels, som ikke findes i dbSNP..), Et ensartet højt molekylær bevaring blev observeret: 92,7% (101 af 109) og 94,4% (135 af 143) af varianterne i BL0429 og BL0440 henholdsvis (figur 2). Sammenfattende blev genomiske variationer til stede i blæren kræftpatienter tumorer stærkt konserveret i PDXs.

WES-analyse blev udført på genomiske DNA-prøver isoleret fra forældrenes patient tumorer og indpodet PDX P0 tumorer. WES data blev filtreret for varianter, der forekommer ved en frekvens på 0,5 og derefter sammenlignet mellem prøverne på grundlag af varianttyper. Antallet og typen af ​​varianter, der forekommer i hver forældrenes tumor og i P0 PDX tumor blev kvantificeret og afbildet som procent af bevaring i grafen. For alle varianter, blev 91,8% og 97,6% bevaret i BL0429 og BL0440 henholdsvis.

Analyse af kendte funktionelt aktive gener og markant muterede gener

Vi næste vurderede mutationen status kendte funktionelt aktive gener og markant muterede gener tidligere identificeret fra store, multicenter analyser af blære kræft [15,25-27], hvoraf mange har vist roller i tumor undertrykkelse, chromatin /kromosom dynamik, transkriptionel regulering, og signal transduktion. Da matchede normale væv ikke indgik i denne undersøgelse blev analyserne primært rettet mod identifikation af varianter, der tidligere bekræftet somatisk status i en eller flere cancertyper ifølge den COSMIC og /eller TCGA databaser. For de 236 gener i betragtning, i alt 71 ikke-synonyme enkelt nucleotid varianter (SNVs), der fører til missense eller nonsense mutationer blev identificeret i 51 forskellige gener, med varierende alternative allel fraktioner spænder fra 0,160 til 0,982 (Fig 3, S3 og S4 Table Tabel). Mens 15 gener viste sig at blive ændret i to eller flere tumorer, forekom kun 5 mutationer i mere end én tumor model (

ADCY2

p.V147L,

ERBB2

p.I655V,

NCF2

p.H308Q,

SYNE1

p.L885V, og

ZNF814

p.158V). De fleste PDXs indeholdt 3-10 somatiske mutationer (i 3-10 gener), undtagen for PDXs BL0269 og BL0293 der havde 13 mutationer hver i 11 og 13 forskellige gener, henholdsvis. Især blev mutationer i funktionelt aktive gener identificeret i hver PDX, herunder

ARID1A

,

ATM

,

CASP8

,

CDH1

,

KALRN

,

KMT2C

,

NCF2

,

mTOR

,

PIK3CA

,

TSC1

, og

TP53

; 6-10 mutationer i blære kræft driver gener blev fundet i 5 af 8 modeller (S4 tabel). Integration af RNA-Seq data med disse resultater antydede, at ud af de 71 mutationer fundet, var der ca. 29 “udtrykt” mutationer i 20 gener (

e

.

g

.,

ARID1A

,

CASP8

,

KLF5

,

MLH1

,

NOTCH1

,

PIK3CA

, og

SYNE2

), der oversteg cut-off af lav /moderat udskrift overflod (

jeg

.

e

., ≥10 FPKM eller fragmenter pr kilobase af exon per million fragmenter kortlagt) (S5 tabel).

WES blev udført på P0 tumorer fra hver PDX model. Efterfølgende blev GATK anvendes til variant påvisning og funktionel annotation. Resultaterne blev filtreret for somatiske mutationer forekommer i en konsolideret liste over 130 kendte blærekræft funktionelt aktive gener [27] og betydeligt muterede gener [15,25,26]; disse er angivet i højre side panel som

BLCA driver (IntOGen)

,

TCGA Betydeligt Muteret

, eller

BGI Markant Muteret

. Somatiske mutationer blev fundet i 51 forskellige gener (angivet langs siden af ​​bordet) (S3 Table og S4 Table). Den PDX model nummer er angivet øverst på nettet. Frekvenser (0,3-1,0) for hver mutant allel er angivet for hver variant og repræsenteret ved at øge farve intensitet.

mutationsanalyse af tumor suppressor veje

Tre fjerdedele af blærekræft PDXs indeholdt afvigelser i et eller flere af tumorsuppressorgener

TP53

,

RB1 ​​

, og

CDKN2A

(figur 4). Konkret disse medtaget somatiske mutationer af

TP53

(R248Q, R280T, E177 *, og E285K) og

RB1 ​​

(R358X), og kopier nummer varianter af

RB1 ​​

( i BL0293, BL0429, og BL0479) og

CDKN2A

(i BL0269, BL0382, BL0429, og BL0479). De fleste af de TP53 somatiske mutationer var heterozygot (allel frekvens = 0,5), med undtagelse af R280T i BL0479 og E177X beskærer mutation i BL0382, hvor sidstnævnte blev også ledsaget af markant reducerede

TP53

transkriptniveauer (Fig 4A og 4B). Et tilsvarende fald i

MDM2

udtryk blev observeret i BL0293 og BL0479 tumorer, der indeholder R248Q og R280T mutationer i

TP53

hhv. Kopiér nummer tab eller sletninger, der forekommer på

RB1 ​​

CDKN2A

loci blev valideret ved sammenligning med de RNA-Seq data viser en næsten fuldstændigt fravær af udtryk i de fleste tilfælde.

(A) Integreret analyse af

mRNA Expression

,

Mutationer

, og

Kopier nummer

blev udført for gener i

TP53

RB1 ​​

tumor suppressor veje. Gene-niveau ekspression (FPKM) værdier for pathway medlems gener præsenteres og relativ genekspression for hvert gen tværs over pladen af ​​PDX modeller er angivet med Heatmap (grøn = lavere end medianen, rød = større end medianen). Mutationer (aminosyreændringer) i

TP53

og

RB1 ​​

er angivet. Gene kopiantal præsenteres, og varianter angivet som tab (

jeg

e

, .. 2), eller gevinster (

jeg

e

, . 2) vist ved mørkere nuancer af rød og grøn, hhv. (B) Ekspressionsniveauer (FPKM) af tumor suppressor pathway gener i hver PDX er vist i søjlediagrammet.

Transkriptomet profilering af PDX tumorer

Ud over det 20 muterede gener, der var fundet at have mindst et minimalt niveau af ekspression (

over

), yderligere evaluering af gen-ekspression for hele konsoliderede liste over 236 blærekræft funktionelt aktive og markant muterede gener viste, at 85-104 af disse havde moderat til meget høje niveauer af ekspression (FPKM = 15-2,417) i mindst én PDX (figur A i S2 fig, S6 tabel). Desuden flere udstillet universelt høj ekspression i PDX-modeller, herunder

AHNAK

,

BCL2L1

,

CDKN1A

,

CTNNB1

,

HRAS

,

RhoA

, og

YWHAZ

. Tilsvarende evaluering af 291 høj tillid driver (HCD) gener identificeres via pan-cancer analyse af TCGA datasæt [27], og efter de samme kriterier for analyse, som beskrevet ovenfor, viste, at 199 HCD gener blev udtrykt i panelet (figur B i S2 fig, S7 tabel). Som en metode til at definere veje kørsel biologi PDX tumorer, funktionelle annotation klyngedannelse af de mest udtrykt gener (≥50 FPKM) på tværs af panel af PDXs blev udført ved hjælp af DAVID bioinformatiske ressourcer værktøjer [28]. Dette afslørede inddragelse af flere grundlæggende cellulære veje og deres molekylære bestanddele, herunder ubiquitinproteasomvejen, translationsfaktorer, og metaboliske enzymer (glycolysen, oxidative fosforylering). Især gener negativt regulerer apoptose blev også væsentligt beriget (25 gener,

s

= 3,95 x 10

-06), såsom

DAD1

,

MCL1

,

SOD1

,

TPT1

, og YWHAZ, implicerer tilstedeværelsen af ​​en generaliseret overlevelse fordel.

PDX platform til at guide molekylært målrettet terapi

et vigtigt mål kørsel udviklingen af ​​disse PDX modeller var at etablere en platform til at hjælpe med at identificere den korrekte driver mutation og dens matchede målrettet terapi. Baseret på hele exome og transkriptom sekventering data, der er mange druggable mål med inhibitorer, der er FDA-godkendt eller i kliniske forsøg (Fig 5A) (S7 Table, S8 Table og S9 tabel). Vi valgte en delmængde af disse mål at informere matchede terapi test (S1 Fig): fibroblast vækstfaktor receptor 3 (

FGFR3

), ephrin type B receptor 4 (

EphB4

), proto-onkogen tyrosin-proteinkinase

Src

, human epidermal vækstfaktor receptor -2 og 3 (

HER2 /3 fotos) og phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat 3-kinase, katalytiske underenhed alpha (

PIK3CA

).