PLoS ONE: polymorf Expression af UDP-glucuronosyltransferase UGTlA Gene i Human Colorectal Cancer

Abstrakt

Baggrund

Polymorfi af gener, der koder narkotikarelaterede enzymer er kendt for at spille en vigtig rolle i øget følsomhed af kolorektal cancer. UGT1A gen locus er blevet foreslået at definere vævsspecifik glucuronidering aktivitet. Reduceret kapacitet af glucuronidering er korreleret med udviklingen af ​​colorectal cancer. Derfor søgte vi at udforske polymorfi af UGTlA gen i human colorectal cancer.

Metoder

Kræft og sunde væv blev opnået fra selectedpatients. Blodprøver blev opsamlet og UGTlA mRNA transskriptioner blev analyseret. Genomisk DNA blev fremstillet og UGTlA8 exon-1-sekvenser blev amplificeret, visualiseret og oprenset. Det ekstraherede DNA blev subklonet og sekventeret. To-tailed Fishers eksakte test, Odds ratio (OR), konfidensinterval (CIS) og Logistik regressionsanalyse blev brugt til statistisk analyse.

Resultater

UGTlA mRNA-ekspression blev reduceret i kræft væv sammenlignet med sunde væv fra den samme patient. Den UGTlA mRNA ekspressionen af ​​sundt væv i studie patienter var lavere end kontrol. MRNA udtryk for kræft væv blev nedreguleret i UGTlAl, 1A3, 1A4, LA6, 1A9 og opreguleret i UGTlA8 og UGTlAl0 UGT1A5 og UGT1A7 var ikke udtrykkes i colon væv af enten gruppe. Den allel frekvens på WT UGTlA8 * 1 var højere (p = 0,000), hyppigheden af ​​UGTlA8 * 3 blev sænket i kontrolgruppen (p = 0,000). Ekspressionen af ​​homozygot UGTlA8 * 1 var højere i kontrolgruppen (p = 0,000). Højere frekvens af både heterozygote UGTlA8 * 1 /* 3 og UGTlA8 * 2 /* 3 blev fundet i undersøgelsen (p = 0,000; p = 0,000). Forekomsten af ​​kolorektal cancer var primært relateret til tilstedeværelsen af ​​polymorfe UGTlA8 * 3 allelerne (p = 0,000).

Konklusion

Regulering af menneskelige UGT1A gener er vævsspecifik. Individuel variation i polymorfe udtryk for UGTlA genlocus blev bemærket i alle typer testet colonvæv, hvorimod levervæv ekspression var ensartet. Den høje forekomst af UGTlA8 polymorfi findes i patienter med tarmkræft. UGTlA8 * 1 allelen er en beskyttende faktor og UGTlA8 * 3 allel er en risikofaktor

Henvisning:. Wang M, Sun D-F, Wang S, Qing Y, Chen S, Wu D, et al. (2013) polymorf ekspression af UDP-glucuronosyltransferase UGTlA Gene i Human kolorektal cancer. PLoS ONE 8 (2): e57045. doi: 10,1371 /journal.pone.0057045

Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan

Modtaget: 16. december 2012; Accepteret: 16 Januar 2013; Publiceret: 27 feb 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Videnskab og Teknologi Key Project i Shandong-provinsen (No.2006GG3202050), Science Bonus Midler til Unge Forskere i Shandong-provinsen (NO.2007BS03017, ingen URL-link), og Natural Science Foundation i Shandong-provinsen (No.Y2008C115, ingen URL link). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kolorektal cancer er en af ​​de mest almindelige typer af kræft i hele verden. Baseret på data fra International Agency for Research on Cancer (IARC), kolorektal cancer udgør 9,4% af alle

de novo

kræft diagnose i 2007.Compare til tallene i 2000, nydiagnosticeret kolorektal cancer i 2007 var steget med 27%, havde og dødeligheden steget med 28%; som tegner sig for en årlig stigning på 3,9% og 4,0%, henholdsvis [1].

Selvom ætiologien af ​​kolorektal cancer ikke er fuldt forstået, er Polymorfi af gener, der koder narkotikarelaterede enzymer er kendt for at spille en vigtig rolle i forøget modtagelighed for tyktarmskræft [2]. Et utal af enzymer er involveret i fase I og fase II metaboliske veje, herunder medlemmer af cytochrom P450 (P450) og UDP-glucuronosyltransferase (UGT) superfamilier. UGT’er katalyserer glucuronidering reaktion, hvilket er vigtigt for xenobiotisk stofskifte. Glucuronidering muliggør udnyttelsen af ​​visse næringsstoffer samt afgiftning og udskillelse af potentielt skadelige forbindelser og metabolitter såsom steroider, bilirubins, exogene stoffer, giftige kemikalier og mutagene stoffer [3]. Over 50 typer UGT’er var blevet identificeret i mange organer og væv fra både dyr og menneske, herunder lever, tarmslimhinden, lunger, hjerne, placenta og livmoderen [4] – [8]. Humane UGT’er er blevet inddelt i UGT1, 2, 3 og 8 multigenfamilier baseret på evolutionær divergens [4]. Til dato har 21 forskellige UGT’er [9] blevet fundet i mennesker. Det humane UGT1A gen locus er lokaliseret på kromosom II. Det er sammensat af tretten forskellige første exoner på 5′-enden forbundet ved alternativ splejsning, til fire forskellige fælles exoner på 3′-enden. UGT1A gen locus koder mindst ni funktionelle proteiner (UGT1A1, UGT1A3-UGT1A10) og fire pseudogener (UGT1A2, UGT1A11-UGT1A13) [10].

Tissue-specifikt udtryk for det UGT1A genlocus er blevet godt karakteriseret. Genet var blevet foreslået at definere vævsspecifik glucuronidering aktivitet i menneskelige fordøjelsessystem. Nedsat UGT1A proteiner (UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6, og UGT1A9) er blevet undersøgt og identificeret i detaljer. Undersøgelser undersøger fordøjelsessystemet har ført til identifikation af tre ekstrahepatiske UGT1A udskrifter: UGT1A7, UGT1A8 og UGT1A10 [11], [12]. Anvendelse af revers transkriptase polymerasekædereaktion (RT-PCR), lavere genekspression af UGT1A8 blev bemærket i spiserøret [13]. En mere omfattende undersøgelse viste ingen påviselig UGT1A8 RNA i tyndtarmen, men rigelige niveauer af UGT1A8 mRNA i tyktarmen [12]. I øjeblikket data om ekspression af UGT1A8 i lever eller ethvert andet humant væv har været få. Den selektive ekspression af UGT1A8 i colon kan indikere, at UGT1A8 spiller en vigtig rolle i cellulær homeostase og dispositionen af ​​endogene og exogene forbindelser. Det blev rapporteret, at human UGT1A8 protein katalyserer glucuronidering af coumariner, phenolforbindelser anthraquinoner, flavonoider og en række steroider, på transficerede humane embryoniske nyre 293 (HEK293) celler [14]. Overvej det faktum, at tyktarmen indeholder en betydelig mængde UGT1A proteiner [12], en reduceret kapacitet på glucuronidating specifikke stoffer kan være til skade for den homeostatiske balance af tyktarmen.

I løbet af de seneste år, havde genotype og sekventering data førte til opdagelsen af ​​flere end 100 varianter inden for de promotorområder og den kodende sekvens af UGT1A gener. Især er mange af de varianter udviser allel frekvenser på op til 40-50% i den almindelige befolkning, som findes at være i bindingsuligevægt. Men, et par varianter er af tilstrækkelig frekvens i den almindelige befolkning til at blive klassificeret som polymorfier [15], [16]. Polymorfi er bedst repræsenteret ved UGT1A1 genet, der vides at indeholde 113 variant allel genotyper af UGT1A1 (UGT1A1 * 1-UGT1A1- * 113). Mange af UGT1A1- gener udviser høje allel frekvenser [17], [18]. Genetisk polymorfisme havde også fundet i UGT1A3 [19], [20], UGT1A4 [21], [22], UGT1A6 [23], [24], UGT1A7 [16], [25], [26], UGT1A8 [12 ], [14], [21], [27], [28], og UGT1A9 [29]. Polymorfi fører til forskellige grader af transkriptionelle såvel som funktionelle ændringer, hvilket kan formindske UGT’er aktivitet og resulterer i patologi de afficerede individer. Analysen af ​​en case-kontrolleret undersøgelse viste øget risiko for udvikling af kolorektal cancer (CRC) i individer, der bærer UGT1A1 * 6 og UGT1A7 * 3 varianter [30]. Analysen af ​​genetiske polymorfier af UGT1A3 gener (UGT1A3 * 2, UGT1A3 * 3) viste, at ikke kun aktiviteten af ​​den udtrykte UGT1A3 proteinet havde ændret men specificitet for forskellige substrater blev påvirket såvel [20]. Omfattende undersøgelser blev udført på UGT1A7 genvarianter. Med sit lave carcinogen metaboliserende aktivitet, UGT1A7 gen er en risikofaktor for hepatocellulært carcinom (HCC) udvikling i, Kinesisk (OR = 3,06) [31], Fransk (OR = 3,4) [32], Japansk (OR = 2,33) [33 ], og koreanerne (OR = 1,45) [34]. Desuden UGT1A4 * 2 og UGT1A4 * 3 blev også betragtet som en risikofaktor for HCC i en allelassociation undersøgelse [21].

Den katalytiske effektivitet UGT1A8 * 3 (C277Y) og UGT1A9 * 3 (M33T ) allozyme mod mycophenolsyre blev drastisk formindsket [29]. Allel variation i en af ​​de mange UGT loci kan medfører betydelige biokemiske ændringer i lægemiddelmetaboliserende potentiale. Disse UGT enzymer er kendt for at nedbryde kræftfremkaldende stoffer; manglende funktion kan spille en vigtig rolle i ætiologien for kræftfremkaldende episode såsom kolorektal cancer.

For at opnå en bedre forståelse af den rolle UGT1A i mavetarmkanalen, havde den aktuelle undersøgelse fokuserede på UGT1A8 i mavetarmkanalen. Baseret på tidligere rapporter [35], vi anerkendt ændringer i udtryk og funktion af UGT1A8 kan være en risikofaktor for tyktarmskræft. I denne undersøgelse blev polymorfe ekspression af UGT1A gener undersøgt. Vi testede genotype af UGTlA8 hos patienter med kolorektal cancer og udforskede forholdet mellem polymorfi af UGTlA8 gener og tarmkræft.

Materialer og metoder

2.1 Klinisk materiale

(1) kolorektal cancer gruppe, 150 patienter (90 kvinder og 60 mænd, gennemsnitsalder 56,8 ± 11,3 år) blev screenet i vores General Surgery Department, Qilu Hospital, Shandong University, Shandong-provinsen, Kina. Disse patienter blev udvalgt i henhold til standard Amsterdam II [36], til hinder HNPCC (HNPCC) og familiær adenomatøs polypose (FAP). Berettigelse blev bestemt, hvis primær diagnose opstod op til seks måneder før at studere tilmelding, med endelige diagnose bekræftet gennem Patologisk Institut.

Ingen af ​​patienterne fik kemoterapi, strålebehandling eller bioterapi før prøver kollektion. 120 normale forsøgspersoner (48 kvinder og 72 mænd, gennemsnitlig alder 57,2 ± 11,9 år) blev screenet fra Institut for interventionel Gastroenterologisk i Qilu Hospital, Shandong University. 72 normale hepatiske vævsprøver fra frivillige (30 kvinder og 42 mænd, gennemsnitsalder 56,5 ± 10,2 år) blev opnået gennem Institut for Almen Kirurgi, Qilu Hospital i Shandong University. Serielle markører for serum hepatitis virus var negative i disse 72 emner. Ti patienter blev henvist til hepatisk hæmangiom og fjorten blev henvist til hepatisk cyste. Gennemgang af journaler i alle ovennævnte emner indikerede fravær af kroniske narkotika tager adfærd, samt fravær af rygning og alkoholmisbrug. blev taget ekstra prøve normalisering foranstaltninger, herunder rygestop 6 måneder før vævsprøve samling, og fastende mindst 12 timer før de kirurgiske procedurer og væv samling.

(2) 327 patienter (123 kvinder og 204 mænd , gennemsnitsalder 56,4 ± 11,0 år) med colorectal cancer blev screenet i Institut for Almen Kirurgi og Institut for Gastroenterology, Qilu Hospital, Shandong University. Disse patienter blev udvalgt på grundlag af standarder for Amsterdam II kriterier som før [36]. I kontrolgruppen var der 327 køns- matchede frivillige (gennemsnitlig alder 54,2 ± 10,3 år). I gennemsnit frivillige var to år yngre end kolorektal kræftpatienter (p 0,05). Alle emner var Han-folk, der kommer fra det fælles område med Shandong-provinsen i Kina, uden consanguinous forhold. Spørgeskemaer blev administreret af specialuddannede sygeplejersker til at studere emner i-person. Spørgeskemaet indsamlede oplysninger om livsstilsfaktorer såsom fysisk aktivitet; alkohol og tobak forbrug; medicinsk, familie og arbejde historie; og brugen af ​​over-the-counter medicin. Derudover for at bevare epidemiologiske arkiver og vurdere individuelle udsættelse for kosten kræftfremkaldende stoffer, blev detaljeret spørgeskema anvendt til at måle gennemsnitlige indtagelse kosten et år før diagnosen kolorektal cancer, eller et år før datoen for udvælgelse til kontrol. Der var ingen andre signifikante forskelle (fx ved alder, familie historie af kolorektal cancer, rygning status, samlede indtag af kød, uddannelsesniveau eller indkomst) mellem individer, der har givet blodprøve og befolkningen generelt. Informeret samtykke blev opnået, og undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité i Shandong University.

2.2 Vævsprøver og reagenser

(1) I kolorektal cancer gruppe, 150 par af prøver (1 cm × 1 cm x 1 cm) blev høstet ved drift kirurger fra 150 patienter med colorectal cancer under delvis kolektomi. Prøver blev derefter afkølet i 0 ° C saltvand. Hver par af prøve bestod af malignt væv og omkringliggende raske væv. Raske væv blev høstet i en afstand på mere end 5 cm fra resektionsranden af ​​colorektal cancer. 120 sunde kolon slimhinder prøver fra kontrolgruppen blev høstet gennem elektrisk enteroscope. Makroskopisk undersøgelse af raske slimhinde fra studiegruppe og kontrolpersoner viste ingen tegn på nedbrydning, såsom nekrose. Mikroskopisk undersøgelse med lysmikroskop dokumenteret normal histologi. Vævene var fri for tumor og enhver påviselig samtidige sygdomme såsom colitis, dysplasi. Tyktarmsslimhinde blev dissekeret og opnå vævsprøver fri for kolon muscularis og de fleste af submucosa. Dette gav mulighed for en direkte sammenligning med nedsat epitel ved at minimere tilstedeværelsen af ​​nonepithelial celletyper. 72 hepatiske vævsprøver af frivillige blev opnået ved laparoscope i en afstand af mere end 5 cm fra kanten af ​​kirurgisk ablation. Prøver blev udvalgt for fravær af histologisk tilsyneladende sygdom, såsom hepatitis og levercirrose at minimere prøve bias. Efter at være indkapslet i tin folie wrapper og mærket blev alle vævsprøver skyllet i koldt 0,9% NaCl, og umiddelbart frosset i flydende nitrogen inden for 10 minutter kirurgisk fjernelse og blev kontinuert opbevaret ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse.

Revers transkriptase MMLV blev købt fra Sigma Chemical Co. TaqDNA polymerase blev købt fra Shanghai Shengong Co reagenser nødvendige reaktionssystemer af Reverse Transcription (RT) og polymerase Chain Reaction (PCR) blev leveret af Tumor Immunityand gensplejsning Key Laboratories. UGTlA kit blev købt fra Gentest Corp.

(2) 5 ml perifere venøse hele blodprøver blev indsamlet fra 327 af kolorektal cancer patienter og 327 sager fra raske voksne. Begge grupper blev fastet i mindst 12 timer forud for prøvetagning. Syrecitratdextrose (ACD) blev anvendt til at forhindre blodet koagulere indtil analyse. Reagenser af erythrocyt lysat, leukocyt lysat, protein nedbør og DNA hydrering blev leveret fra Medical Genetics Institute of Medical College i Shandong University. Nødvendige reagenser i reaktionssystemer af RT-PCR og TaqDNA endonuclease blev indkøbt fra Promega CO. PCR produkter gelatine hentning kit blev indkøbt fra BioTek CO. Alle andre reagenser blev opnået fra kommercielle kilder og af analysekvalitet.

2.3 Påvisning af UGTlA mRNA-ekspression i forskellige væv

tilstedeværelsen af ​​UGT1A transkripter i alt væv RNA blev analyseret ved PCR-amplifikation, udført som en duplex RT-PCR co-amplifikation med β-actin-cDNA som en kontrol. RT-PCR påvisning af alle UGT1A transkripter forudsagt af den humane UGT1A locus blev udført under anvendelse exon 1 specifik sense-primere og antisense-primere, som ligger inden for exonerne 2-5 eller inden for en fælles del af 3′-enden af ​​de første exoner. Alle primere blev biosyntetiseres fra Shenggong CO., Shanghai, efter hentning i genomisk laboratorium, som vist i tabel S1.

RNA-isolering blev fremstillet ifølge guanidiniumisothiocyanat metoder. Ca. 200 mg frosset væv blev pulveriseret i en morter fyldt med flydende nitrogen. Tissue pulver blev straks lyseret i sur phenol-guanidiniumisothiocyanat opløsning. UGT1A cDNA blev co-synthesizd med β-actin-cDNA i Eppendorf-rør indeholdende 1 ug RNA, 1 pi MMLV, 7 pi RT-PCR-system, 1 μ1 nedstrømsprimerne .UGT1A cDNA blev co-amplificeret med β-actin-cDNA i en startvolumen af 98 pi indeholdende 20 pi reverse transskriptionsprodukter, 19 pi PCR-system, 1 pi opstrømsprimere, 58 pi ultrarent vand. Efter inkubering ved 94 ° C i 3 minutter blev PCR-cyklus startes ved tilsætning af 2 pi TaqDNA polymerase efterfulgt af centrifugating. I alt fem og tredive cyklusser blev udført. Hver PCR-cyklus består af amplifikationsreaktioner ved 94 i 1 min, 58 ° C i 1 min og 72 ° C i 1 min, efterfulgt af forlængelses reaktioner med forlænget forlængelse på cirka 7 minutter ved 72 ° C. Analytisk agarose-gelelektroforese blev udført for at identificere PCR-produkter. Kodak Gelatine Analysis System blev anvendt til at evaluere udtryk intensitet UGT1A og UGT1A isoformer efter følgende formel:

Eksperimenter blev udført med flere niveauer af kontroller, herunder kontroller uden cDNA, primere eller termofil polymerase. Specificitet af dette assay blev bestemt ved PCR under anvendelse alle primerpar på hver klonet skabelon-cDNA for at udelukke krydsreaktivitet. For at bekræfte påvisning af specifikke UGT1A cDNA under anvendelse af dette assay, PCR-produkterne blev delvist sekventeret for at dokumentere identiteten af ​​disse specifikke genprodukter.

2.4 DNA-isolering fra fuldblodsprøver Salg

300 pi blodprøver blev infunderet i 1,5 ml Eppendorf-rør. 900 pi erythrocyt lysat blev sat til prøven. Fordøjelse lodes i 10 minutter ved stuetemperatur. Prøven blev derefter centrifugeret ved 12.000 g i 20 sekunder og de klare supernatanter blev fjernet. 50 pi erythrocyt lysat og 300 pi leukocyt lysat blev tilsat for at resuspendere pelleten, efterfulgt af 30 minutters fordøjelse ved stuetemperatur. Protein blev udfældet ved tilsætning af 100 pi protein nedbør og prøven blev derefter centrifugeret ved 12.000 g i 20 sekunder. Supernatanten blev overført til et nyt 1,5 ml Eppendorf-rør efterfulgt af langsom instillation med dobbelt-volumed forkølet dehydreret ethanol. Prøven blev vaklede lidt, indtil DNA nedbør. Prøven blev derefter centrifugering ved 9.000 g i 1 minut og de klare supernatanter blev fjernet. 500 pi 75% ethanol blev tilsat til bundfaldet, efterfulgt af centrifugering ved 9.000 g i 1 minut, supernatanterne blev fjernet, og DNA-præcipitatet fik lov til at lufttørre. DNA hydratisering blev tilsat til rehydrere DNA og fortyndet DNA-opløsning til en koncentration på 20 mg /l til yderligere anvendelse, efter kvantificering af DNA ved ultraviolet spektrofotometer. DNA blev rehydreret med rent vand til en koncentration på 20 mg /l. Koncentrationen blev verificeret med ultraviolet spektrofotometer før yderligere brug.

2.5 Forstærkning af UGT1A8 exon-1 ved PCR

Exon-1, som ligger i 5′-enden af ​​den menneskelige UGT1A8, præsenterer individuel variation i sin regulering. Primerne blev designet baseret på matrix af UGT1A gen locus (accession nummer AF297093). Forward primer (prlA8F, bases34175-34198): 5′-TGG GGT CAG GTT TTG TGC CTG TAG-3 ‘, revers primer (prlA8F, baser 35.175-35.208): 5’-GAA ATT GTC AAA TCA CAA TTC AGT AAG GAA TCT -3 ‘. Reaktionen betingelse blev justeret til 4 pi 5 x PCR-reaktion, 4 pi 5 x dNTP, 0,5 pi fremadrettet primer, 0,5 pi revers primer, 5 pi Taq DNA endonuclease, 2 pi DNA-skabelon, og supplerende optisk volumen sterilt tre gange destilleret vand, som udgjorde et samlet volumen på 100 pi. 35 amplifikationscykler blev udført. Hver cyklus bestod af denaturering ved 95 ° C i 30 sekunder, annealing reaktion ved 57 ° C i 30 sekunder og forlængelse ved 72 ° C i 30 sekunder. Hele cyklussen blev forudgået af en 3 minutter inkubation af reaktionsblandingen ved 95 ° C efterfulgt af 10 minutter forlængelse ved 72 ° C. Identitet af PCR-produkterne blev bekræftet med gel electrophrosis.

2.6 Purication og sekventering af PCR-produkter

PCR-produkter blev farvet med ethidiumbromid i 15 minutter, og isoleret med 20 g /l agarosegel , ved en spænding på 120 V i 1 time. De amplificerede DNA remme blev skåret ud under ultraviolet lampe ved 320 nm og anbragt i 1,5 ml Eppendorf-rør. Firedoblet volumen af ​​bindingspuffer blev tilsat til DNA-stropper. Efter inkubering med vandbad ved 65 ° C i 7 min blev blandingen overført til kolonner og centrifugeret ved 12.000 g i 1 minut. 300 pi bindingspuffer blev anvendt til at rense søjlen efter kassere opløsningen. Yderligere 750 pi DNA Wash Buffer blev tilsat til prøven og centrifugering blev gentaget ved 10.000 g i 1 minut. Den blandede opløsning blev centrifugeret ved 12.000 g i 1 minut før kassere supernatanterne. Efter fjernelse af supernatanten blev prøver overført fra 1,5 ml Eppendorf-rør i kolonnen. Derefter blev 30 pl af DNA Water Buffer tilsat til søjlen, blev blandingen derefter centrifugeret ved 12.000 g i 1 minut. Opløsningen blev opsamlet til kvantificering og yderligere analyse. De indsamlede DNA-fragmenter af forskellige genotyper blev overført til TOPO TA plasmid DNA prøver blev sekventeret i Medical Genetics Institute of medicinsk uddannet i Shandong University med en fuldautomatisk sequencer (Prism 377, ABI CO., USA) ifølge producentens anvisninger.

Denne undersøgelse anvendte de samme kvalitetskontrol foranstaltninger beskrevet af Lesley M. Butler, et al. [37]. Første, positive og negative kontroller blev indbefattet i hver PCR og Taqman eksperiment. Homozygot vildtype, heterozygote og homozygote varianter for hver UGT1A8 genotype fra genomiske DNA-prøver af UGT1A8 genotype blev medtaget. For det andet, blev gentagne analyser udført på tre tilfældigt udvalgte prøver fra hvert forsøg, og der var 100% enighed. Tredje blev tre yderligere tilfældigt udvalgte prøver bekræftet ved direkte DNA-sekventering. Endelig blev laboratoriepersonale blindet til sagen status af prøverne.

2.7 Statistisk analyse

Software pakke af SPSS11.0 blev brugt til at analysere data i denne undersøgelse. Kvantitative data er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelsen (× ± s). Sammenligninger mellem hjælp af to grupper af prøver blev foretaget med Students

t

-test, mens flere gruppe midler blev analyseret ved ANOVA. Resultater af case-kontrol studier blev analyseret ved hjælp af to-tailed Fishers eksakte test for at bestemme fordelingen forskel på flere alleler mellem cases og kontroller. Justeret yderste periferi og 95% CIs for colorectal cancer blev beregnet ved hjælp af logistiske regressionsmodeller. CI’ers 95% blev anvendt, medmindre andet er angivet. Justeret Ors og 95% CIs blev brugt til at evaluere virkningerne af UGT1A8 alleler, genotype og køn på modtagelighed i kolorektal cancer. En p-værdi på 0,05 eller mindre blev defineret som statistisk signifikant.

Resultater

3.1 Variation af ekspressionen af ​​UGT lA mRNA

Alle menneskelige UGT1A gentranskripter vise en unik 5 terminale ende er karakteristisk for hver af de individuelle transferase og en fælles 3′-delen kodes af exoner 2-5. 3′-regionen er identisk i alle medlemmer kodet af UGT1A locus og kan derfor udnyttes til at analysere overordnede UGT1A ekspression. Co-amplifikation af 487 bp UGT1A og 317-bp humane β-actin PCR-produkter, adskilt i en 2% agarosegel og farvet med ethidiumbromid, demonstreres ved hjælp af cancervæv, dens omgivende sunde væv, normale colon-væv fra kontrolpatienter og hepatiske væv. Bredde og intensiteten af ​​β-actin (317 bp) i paneler var konsekvent som forventet. Bredden og intensiteten af ​​UGT1A mRNA (487-bp) var langt mere variabel. Kvantificering af DRT-PCR-produkter blev opnået ved at beregne relative koefficient under anvendelse af Kodak Gelatine Analysis System. Men kvantificering afslørede signifikante forskelle i steady state niveauer blandt tre extrahepatisk kilde og hepatiske væv.

I kolorektal kræftpatienter, UGTlA mRNA-ekspression blev væsentligt reduceret i patologiske væv sammenlignet med de omkringliggende sunde væv høstet sammen. UGT1A mRNA-ekspression i raske væv høstet fra kolorektal kræftpatienter var signifikant lavere end raske colon væv høstet fra normal kontrol. Det højeste niveau af UGT1A mRNA-ekspression blev påvist i levervæv, hvilket var betydeligt højere end normale colon væv fra raske kontroller (P 0,01), (Table.1). Colon UGTlA gen udtryk var præget af betydelig individuel variation, mens hepatiske UGTlA mRNA udtryk var mere ensartet.

3.2 polymorf udtryk for UGT1A isoformer i forskellige væv

Analyse af UGT1A genekspression var udføres på mRNA-niveauet under anvendelse UGT1A exon 1-specifik DRT-PCR. Som tidligere rapporteret, er menneskelig lever- og colon væv kendetegnet ved en unik og vævsspecifik forskellen udtryk for UGT1A locus [11], [12]. Produkter fra exon 1-specifik DRT-PCR påviser specifikt transkripter af alle kendte UGT1A isoformer. DNA stropper blev separeret i 2% agarose og farvet med ethidiumbromid (figur 1). De UGT1A familien isoformer analyseret, blev UGT1A5 og 1A7-mRNA ikke fundet i alle vævsprøver, og antallet af prøver udtrykt UGT1A isoformer var forskellige i forskellige væv. Analyse af 150 forskellige UGT1A udskrifter af kræft væv viste følgende: UGT1A1, 1A8 og 1A10 mRNA blev udtrykt i 102 prøver (Fig.1.a). UGTlAl, 1A3, 1A4, LA6, 1A8, 1A9 og 1A10 mRNA blev udtrykt i 54 prøver (Fig.1.b). UGTlAl, 1A3, 1A6, 1A8 og 1A10 mRNA blev udtrykt i 66 prøver (Fig.1.c). UGTlA3, 1A4, 1A8, 1A9 og 1A10 mRNA blev udtrykt i 108 prøver (Fig.1.d). Den polymorfe ekspression af UGTlA isoformer i forskellige væv blev vist i table.2 og fig.2. I modsætning til kræft væv, blev UGTlA8 og UGTlAl0 mRNA ikke udtrykkes i 72 forskellige hepatiske vævsprøver de. Der var lidt variation i overflod af UGTlA isoformer transkripter, når hver blev sammenlignet med p-actin ekspressionsniveauer. UGTlAl, 1A3, 1A4, LA6 og 1A9-mRNA-niveauer var differentielt nedreguleret i cancervæv sammenlignet med omgivende normale slimhinde (P 0,01), dog UGTlA8 og UGTlAl0 mRNA niveauer var opreguleret (P 0,01).

AT: coloncancer væv; N: Omkringliggende sund slimhinde; M: Marker

A.PCR produkter UGTlA8 exon-1 (1 033 bp). 1,2,3: PCR-produkter af UGTlA8; M: Marker. B.Sequenced resultater af uGTlA8 alleler. a: UGTlA8 * 1 b: UGTlA8 * 2; c: UGTlA8 * 3

Disse data viser, at UGT1A locus udtrykkes i fordøjelsessystemet.. Dataene også bemærke polymorfe regulering og individuel variation af UGTl Et gen locus på RNA-udskrift. Hertil kommer, at identifikationen af ​​vævsspecifik udtryk for UGT1A8 indebærer, at de regulerende mekanismer kan være tegn på den evolutionære udvikling og det biologiske grundlag fastsætte individuelle variationer kræftrisiko.

3.3 Identifikation af vifte af DNA udvundet af hele blodprøver

SeqMan af DNASTAR Software til Molekylær Biologi blev anvendt til at analysere sekvenser af PCR-produkter. Fundne sekvenser blev sammenlignet med præ-specificerede standardiserede kriterier ved humane genom projekt [HGP] til at bestemme steder af SNP og hyppigheden af ​​alleler, efter samlet analyse af sekventerede resultater og forskellige udelukkelser af spøgelse toppe og dårlige sektorer. Befolkning distribution af alleler mødte Hardy-Weinberg ligevægt ved χ2 test (frihedsgrader = antal alleler-1). Længden af ​​PCR-produkter var 1,033bp (Fig.2.A). Sekventerede resultater af oprensede PCR-produkter viste, at der var tre SNP’er ved basepar 518 (CG), basepar 765 (AG), og basepar 830 (GA) i den kodende region af UGT1A8 exon-1 (Fig.2.B, tabel S2) .Den mutation i nukleotid 518 fører til missense mutation i codon 173, som et resultat, er alanin erstattet med glycin. Mutationen ved nukleotid 830 resultater i substitution af tyrosin for cystein kodes af kodon 277. mutationen ved nukleotid 765 er tavs mutation. De funktionelle polymorfier er vist i tabel S2. For hovedparten af ​​prøverne med en heterozygot mutation, kun en enkelt mutation var til stede, indikerer de tre punktmutationer er ikke forbundet (tabel S2, S3). At forbedre nøjagtigheden, blev de opsamlede DNA-fragmenter af forskellige genotyper overført til TOPO TA klonings- plasmider. Multiple kloner fra hver DNA-prøve blev karakteriseret ved DNA-sekvensanalyse. I alle tilfælde er mutationen mønstre matchede identiteten af ​​allelerne som skitseret i tabel S2 og Table.S3. Genotype af prøver kan kontrolleres ved hjælp af TOPO kloning af DNA-fragmenter, i dette tilfælde UGTlA8 * 2 og UGTlA8 * 3 alleler blev identificeret under anvendelse TOPO kloning.

3.4 Analyse af hyppigheden af ​​alleler og genotype af UGT1A8

i kontrolgruppen, allelen hyppigheden af ​​UGTlA8 * 1 (vild type) og UGTlA8 * 1a var dominerende (79%), efterfulgt af 18,8% for UGTlA8 * 2. Identiteten af ​​UGTlA8 * 3 var faktisk sjældent, med kun 2,3% af de observerede at bære denne genotype (Table.3, Figure.3) kontroller. UGTlA8 * la er en tavs mutation og koder UGTlA8 * l. En homozygot mønster af UGTlA8 * 1 (UGTlA8 * 1 /* 1, UGTlA8 * 1 /* 1a, UGTIA8 * 1a /* 1a) udgjorde ca. 65,21% af normale voksne (Table.4). Det konstateredes, at genotypen af ​​UGTlA8 * 1 /* 2 og UGTlA8 * 1a /* 2 var ved en frekvens på 24,64%, genotype UGTlA8 * 1 /* 3 og UGTlA8 * 2 /* 3 var ved en frekvens på 4,35%, UGTlA8 * 2 /* 2 var med en frekvens på 5,8% i kontroller. Interessant var der ingen homozygot UGTlA8 * 3. I tilfælde af patienter med colorektal cancer, allelen hyppigheden af ​​UGTlA8 * 1 og UGTlA8 * 1a, UGTlA8 * 2, UGTlA8 * 3 udgøres af ca. 61,5%, 22,0% og 16,5% (Figure.3) hhv. Den heterozygote ekspression af UGTlA8 * 1 /UGTlA8 * 2, bestå af dem med en genotype af UGTlA8 * 1 /UGTlA8 * 2 og UGTlA8 * 1a /* 2, var ved en frekvens på ca. 18,84%. 28,98% af personer med tarmkræft udtrykte UGTlA8 * 1 /* 3 og UGTlA8 * 2 /* 3. Den homozygote genotype UGT1A8 (UGTlA8 * 1 /UGTlA8 * 1, UGTlA8 * 2 /UGTlA8 * 2), der består af 46,38%, 4,35% af cancerøse tilfælde hhv. Et tilfælde af homozygot UGT1A8 * 3 bemærkede også (Table.3). Der var statistisk signifikante forskelle i allel frekvens og genotyper mellem studiegruppe og kontrolgruppen. Den vildtype allelen (UGTlA8 * 1) frekvens var lavere blandt studiegruppe end kontrolgruppen [P = 0,000, OR = 0,45, CI (0,28-0,79)]. Den samme betydning kunne noteres med genotype UGTlA8 * 1 /* l [P = 0,000, OR = 0,28, CI (0,19-0,41)] og UGTlA8 * 2 /* 3 [P = 0,000, OR = 10,58, CI (4.48- 24,98)] (Table.4 og Fig.4). De modsatte resultater blev noteret i allel UGTlA8 * 3 [P = 0,000, OR = 6,99, CI (3,39-14,42)] (Table.3 og Fig.4) og genotype UGTlA8 * 1 /* 3 [P = 0,000, OR =