PLoS ONE: Mesenchymale Fænotype disponerer Lung Cancer Cells til Nedsat spredning og Redox Stress som reaktion på Glutaminase Inhibition

Abstrakt

Nyt arbejde har fremhævet glutaminase (GLS) som en central aktør i kræft cellens stofskifte, giver glutamin- afledt carbon og nitrogen til veje, der understøtter proliferation. Der er en betydelig interesse i at målrette GLS til cancerterapi, skønt genet ikke er kendt for at være muteret eller amplificeret i tumorer. Som følge heraf er der behov identifikation af medgørlige markører, der forudsiger GLS afhængighed til oversættelse af GLS-inhibitorer til klinikken. Heri vi validere et lille molekyle hæmmer af GLS og viser, at ikke-småcellet lungekræft celler markeret med lav E-cadherin og høj vimentin udtryk, kendetegnende for en mesenchymal fænotype, er særligt følsomme over for inhibering af enzymet. Endvidere lungecancerceller induceres til at undergå epitelial til mesenkymale overgang (EMT) erhverver følsomhed over for GLS-inhibitor. Metaboliske undersøgelser tyder på, at mesenkymale celler har en nedsat evne til oxidativ phosphorylering og øget følsomhed over for oxidativ stress, gør dem ude af stand til at klare de forstyrrelser fremkaldt af GLS hæmning. Disse resultater belyse selektive metaboliske afhængigheder af mesenkymale lunge kræftceller og foreslå nye veje som potentielle mål i denne aggressive kræftform

Henvisning:. Ulanet DB, Couto K, Jha A, Choe S, Wang A, Woo HK, et al. (2014) Mesenchymale Fænotype disponerer Lung Cancer Cells til Nedsat spredning og Redox Stress som reaktion på Glutaminase Inhibition. PLoS ONE 9 (12): e115144. doi: 10,1371 /journal.pone.0115144

Redaktør: Pier Giorgio Petronini, University of Parma, Italien

Modtaget: 16. juli 2014 Accepteret: November 19, 2014; Udgivet: 12. december, 2014

Copyright: © 2014 Ulanet et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Alt arbejde blev finansieret af Agios Pharmaceuticals. De finansieringskilder, gennem sine medarbejdere, der er forfatterne af dette manuskript, havde en rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, og forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne er alle medarbejdere i Agios Pharmaceuticals. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Det er blevet værdsat i 60 år, at glutamin (Gin) er en betinget essentiel aminosyre for væksten af ​​cancerceller i kultur [1]. Glutamin er den mest rigelige cirkulerende aminosyre hos mennesker ved en koncentration på ~500 uM i serum, og mange undersøgelser viser, at Gin er en vigtig kilde til carbon og nitrogen i tumorceller [2], [3]. Et enzym i særdeleshed, glutaminase, lokaliseres til mitokondrierne og synes at være kritisk for indtastning af glutamin kulstof i tricarboxylsyre (TCA) cyklussen i mange cancerceller [4], [5]. Glutamin omdannes til glutamat og ammoniak ved glutaminase, og glutamat carbon efterfølgende shuttled ind i TCA-cyklus via omdannelse til a-ketoglutarat (α-KG) af flere forskellige enzymer, herunder glutamat dehydrogenase og forskellige aminotransferaser. Pattedyr bære to gener, der koder mitokondrie glutaminase,

GLS1

(eller KGA) og

GLS2

(eller LGA), som i første omgang blev identificeret i normal nyre og lever, henholdsvis [6].

GLS1

gen producerer to fremherskende splejsning varianter koder kanonisk GLS1 (også kendt som KGA) og GAC, men den differentierede funktioner af disse to varianter er ikke godt forstået [7].

Flere elegant undersøgelser har vist bidrag carbon afledt fra Gin i TCA-cyklus via glutaminolysis [8], [9].

GLS1

udtryk er også blevet identificeret som et mål for den myc onkogen [10] og har været impliceret som en effektor af Rho-medieret transformation i brystkræft cellelinier [11]. Interferens med GLS aktivitet via enten genetisk eller farmakologisk manipulation er blevet påvist ved en række grupper til negativ indflydelse på væksten af ​​udvalgte cancer cellelinjer [11] – [13]. Baseret på den samlede offentliggjorte data om betydningen af ​​Gln og glutaminase i kræft, er GLS blevet fremhævet som et potentielt mål lægemiddel til onkologiske indikationer [14]. Til vores viden

GLS1

ikke muteret eller forstærkes i humane kræftformer. For at lette anvendelsen af ​​GLS1 inhibitorer i klinikken en bedre forståelse af de genetiske og fænotypiske sammenhænge, ​​der driver afhængighed GLS1 er påkrævet.

I denne undersøgelse validere vi on target cellebaseret aktivitet af en offentliggjort GLS1 inhibitor, BPTES (bis-2- (5-phenylacetamido-1,2,4-thiadiazol-2-yl) ethyl sulfid) [15], hvilket viser, at det virker specifikt via en GLS1-afhængig mekanisme til at inducere anti-proliferativ og metaboliske forstyrrelser i celler. Vi bruger BPTES som en valideret værktøj forbindelse til screening af et panel af lungekræft linjer og identificere en undergruppe af linier, der udviser GLS afhængighed og udtrykke markører der er karakteristiske for en mesenchymale fænotype. TGF-β-medieret induktion af EMT sensibiliserede celler til GLS inhibering og var forbundet med nedsat mitokondrie respiratoriske kapacitet og øget følsomhed for oxidativ stress. Disse resultater peger på en selektiv rolle for GLS i mesenkymale NSCLC celler, der anvender GLS til at give en carbon kilde til oxidativ phosphorylering og at opretholde redox balance kræves for cellulær proliferation.

Resultater

Cell linje panel skærm og validering af BPTES som et redskab sammensatte

for at få indsigt i de genetiske /fænotypiske determinanter for GLS afhængighed, vi screenede et panel af cellelinjer med den offentliggjorte GLS1 hæmmer BPTES [15]. Vi fokuserede specifikt på en tumortype, lungecancer, på grund af det store antal etableret cellelinie modeller til rådighed. Af de 62 lunge linjer udvalgt til analyse ved hjælp BPTES er 44 blevet klassificeret som NSCLC (S1 Table i S2 File). Relative vækstrater (mu_

BPTES /mu_

DMSO) blev beregnet efter medicinsk behandling med henblik på bedst sammenligne relative følsomhed over for BPTES mellem cellelinjer, som varierede i fordoblingstid. Ca. 30% af disse 62 linjer udviste signifikant følsomhed over for BPTES som defineret af 40% reduktion i væksthastighed (figur 1A, S1 tabel i S2 Filer.). Graden af ​​følsomhed over for BPTES var meget varieret, med celledød tydelig i nogle cellelinjer (μ

BPTES /μ

DMSO 0; fx A427) og en næsten komplet mangel på respons i andre (f.eks NCI H1563). Da CellTiter-Glo (CTG), som måler ATP-niveauer, blev anvendt som en hurtig, surrogat fremgangsmåde til screening celleantal efter BPTES behandling, vi valideret, at virkningerne af glutaminase inhibering på cellulære ATP-niveauer var en repræsentativ udlæsning af celleantal. Vurdering af celletal ved DNA-indhold (Syto60) viste en sammenlignelig effekt af BPTES behandling på celleproliferation som angivet af CTG i 72 timer endpoint (S1 figur i S1 File).

(A) Følsomhed af et panel af NSCLC linjer til inhibering af væksten af ​​10 uM BPTES i en 72 hr proliferationsassay. Vækstrater (mu) plottet i forhold til DMSO kontrol for hver cellelinje (mu /max). (B, C) A427 moderceller eller celler, der stabilt udtrykker en tom vektor kontrol (Con), vildtype GAC (GAC), eller en BPTES-resistent GAC enzym (GAC-BR) blev behandlet med de angivne koncentrationer af BPTES (A ) eller den inaktive BPTES analog, AGX-4769 (C), i en 72 timers proliferationsassay. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg med middelværdi og standardafvigelse angivet. (D, E) Måling af isotopomer mærket

13C (5) Glu (D) eller

13C (4) Asp (E) fra celler behandlet i 4 timer med BPTES eller med inaktiv analog AGX-4769. Resultaterne er middelværdien af ​​tre gentagelser med standardafvigelsen angivet. Beregnede p-værdier fra student t-test,

* (3 × 10

-8),

** (10

-9),

# (10

-7 ),

## (2 × 10

-6).

for at bekræfte, at virkningerne af BPTES på celler er on target, vi manipuleret A427 celler at overudtrykke cDNA koder for en tidligere beskrevet BPTES resistent muteret GAC, opkaldt GAC-BR (F318A og F322A) og vurderede virkningen af ​​BPTES på cellevækst af disse celler i forhold til celler, der overudtrykker vildtype GAC (GAC-WT) eller en tom vektor. GAC-BR er ikke i stand til at binde BPTES men opretholder katalytisk aktivitet [16]. Overekspression af GAC-BR gjorde de A427 celler er resistente over for de væksthæmmende effekter af BPTES (fig. 1B), mens celler, der udtrykker tom vektor eller GAC-WT beholdt betydelig følsomhed over for BPTES. Den beskedent afstumpet virkning BPTES på vækst af GAC-WT sammenlignet med de parentale eller tom vektor udtrykkende linjer skyldes sandsynligvis den ~2x stigning i GAC-ekspression i denne model. Vi udnyttede også dette system for at imødegå konsekvenserne på mål af BPTES i modulering de novo syntese af glutamat og aspartat fra glutamin. S2 Figur (i S1 File) fremhæver strømmen af ​​carbon fra glutamin til glutamat og nedstrøms TCA mellemprodukter som det er blevet beskrevet [8], [9]. Overekspression af GAC-BR, men ikke GAC-WT, lindres den BPTES inducerede blokeret glutamin strømme ind glutamat og aspartat (fig. 1D, E). Den ufuldstændige restaurering af

13C (5) -aspartate niveauer kan afspejle særlige følsomhed denne metabolit til GLS hæmning, måske på grund af det bidrag, både kulstof og kvælstof fra glutamin til aspartat biosyntese og /eller på grund af påvirkning fra hæmning af den endogene GLS1 aktivitet. En biokemisk inaktiv BPTES analog, AGX-4769, med en konservativ modifikation (S3 figur i S1 File), blev anvendt til at behandle de samme cellelinjer og havde ingen virkning på spredning eller downstream metabolitter (fig. 1C-E). Disse data indikerer, at virkningerne af BPTES på spredning og modulering af downstream metabolitter skyldes hæmning af GLS1 og ikke på grund af off-target effekter.

Som endnu et middel til validering nytten af ​​BPTES som et redskab sammensatte til screening for GLS afhængighed, udførte vi siRNA-medieret knockdown af GLS1 (enten total eller GAC specifikt) i en undergruppe af 6 i NSCLC linjer fra panelet. Alle 3 linier, der var følsomme over for BPTES var også følsom over for GLS KD, mens 3 der ikke var følsomme over for BPTES var mindre /ikke følsom (S4 figur i S1 File). Mens KD of GAC alene resulterede i væsentlig vækstinhibering i BPTES følsomme linjer, KD af samlet GLS1 resulteret i en endnu dybere nyrefunktion indikerer, at begge isoformer af GLS1 (KGA og GAC) bidrage til vækst /levedygtighed af disse celler.

GLS1 afhængighed i NSCLC med en mesenkymale (EMT) fænotype

Baseret på række BPTES følsomhed observeret på tværs af de 62 cellelinjer (fig. 1), søgte vi efter transkriptionelle markører, der er forbundet med følsomhed eller resistens anvender en offentligt tilgængelig datasæt fra de overordnede Institute (https://array.nci.nih.gov/caarray/project/golub-00327). Notatet hverken GLS1 eller GLS2 mRNA-ekspressionsniveauer korreleret med følsomhed. De øverste 200 sonder viser mest signifikant sammenhæng med følsomhed blev derefter forelagt GeneGO pathway analyse (https://portal.genego.com/cgi/data_manager.cgi). Vi bemærkede, at ingen stofskifte-relaterede veje var stærkt forbundet med BPTES lydhørhed, hvilket indikerer, at eventuelle iboende forskelle i stofskiftet mellem følsomme og resistente celler ikke bredt afspejlet på det transkriptionelle niveau (Tabel S2 i File_S2). Interessant, 4 af de 25 veje var relateret til EMT (rangerer 1, 15, 23, 25,. Figur 2A). Immunrespons veje var også meget repræsenteret i denne analyse. Mens vi valgte at fokusere vores undersøgelser om sammenhængen mellem EMT og GLS1 afhængighed, er det bemærkelsesværdigt, at en sammenhæng mellem NF-KB og glutaminaseaktivitet er blevet påvist ved andre [11], [17].

(A ) GeneGo analyse indikerer fire top-ranking mesenkymale signaturer korrelerer med BPTES følsomhed. P-værdier beregnes i GeneGo software ved hjælp af hypergeometriske fordeling. (B) Anti-korrelation mellem høj E-cadherin lav vimentin RNA ekspressionsniveauerne og følsomhed over for BPTES. (C) Mu /mumax værdier afbildet efter 72 timers behandling af NSCLC linjer med 10 pM BPTES. Lige proteinmængder af tumorcellelinie ekstrakter blev elektroforesebehandlet, med den gruppe af mere sensitive linjer på venstre mindst følsomme til højre, og immunoblottedes for de angivne proteiner. Histon H3 blev anvendt som en loading kontrol. (D) Kvantificering af gennemsnitlige GAC protein niveauer i forhold til PC-proteinekspression (+/- SEM) i BPTES følsomme (n = 7), mellemliggende (n = 7), og ufølsomme (N = 7) linjer.

P

= 0,03 sammenligne GAC /PC protein niveauer i følsomme forhold til ufølsomme linjer;

P

= 0,06 sammenligne følsomme over for mellemliggende grupper (uparret to-tail t-test).

For at identificere specifikke markører prædiktive af BPTES følsomhed, vi undersøgt listen over betydeligt korrelerede sonder fra ovenstående analyse for de enkelte EMT gener. E-cadherin og vimentin var positivt og negativt korreleret med vækst i nærvær af BPTES (dvs. manglende følsomhed over for GLS hæmning), (fig. 2B). Low E-cadherin /høj vimentin er veldefinerede markører for celler, der har en mesenkymale fænotype [18]. En signifikant korrelation blev også observeret i flere andre gener typisk modulerede under EMT, herunder claudin4 /7 og ZEB1 (tabel S3 i File_S2). Efter den indledende screening BPTES, en delmængde af 21 af de NSCLC linjer blev undersøgt for BPTES følsomhed og analyseret for protein ekspressionsniveauer af udvalgte markører identificeret fra transkriptionelle profilanalyse (Fig 2C, D;. Tabel S4 i File_S2). I 6/7 af de øverste følsomme NSCLC linjer, var lave E-cadherin og høj vimentin proteinniveauer reproducerbart observeret (fig. 2C). Gruppen af ​​følsomme linjer blev også præget af et gennemsnitligt højere andel af GAC /pyruvatcarboxylase (PC) protein niveauer (Fig 2C, D;.

P

= 0,03). Lignende resultater blev opnået sammenligne total GLS1 /PC niveauer. Vi valgte at fokusere på GAC niveauer, som denne isoform dominerer i de fleste cancerceller. PC protein niveauer alene var signifikant forhøjet i ufølsomme forhold til sensitive linjer (

P

= 0,02) og mRNA-niveauer negativt korreleret med BPTES følsomhed i større panel af 60 + lungekræft linjer screenet (Pearson korrelation faktor: 0,29 ; Pearson

P Drømmeholdet værdi: 0,03). Da pyruvatcarboxylase kan erstatte glutaminase i at yde kulstof til TCA cyklus [19], sammenslutningen af ​​ændrede GAC /PC-forhold med følsomhed over for GLS hæmning antyder muligheden for, at alternative former for kulstof indgangsveje til TCA kan påvirke GLS afhængighed.

det er interessant, de tre NSCLC linjer, der var mest følsomme over for BPTES (A427, LXF289, SW1573) alle bærer aktiverende mutationer i β-catenin (T41A i A427 og LXF289, S33F i SW1573, tabel S4 i File_S2). Wnt /β-catenin signalering er en af ​​flere veje, der har været impliceret i kørsel EMT [20]. Som et resultat, anvendte vi siRNA medieret knockdown af β-catenin i A427-celler for at bestemme, om tab ville resultere i en ændring i følsomhed til BPTES. Påfaldende, β-catenin knockdown resulterede i nedsat følsomhed for BPTES behandling (fig. 3A). Interessant nok blev reduktionen i β-catenin-proteinniveauer ledsaget af en stigning i E-cadherin-niveauer (fig. 3B), som det tidligere er blevet beskrevet i blære cancerceller [21]. I mangel af BPTES behandling, β-catenin KD resulterede i en beskeden. (23% fald;

P

= 0,02) værdiforringelse i cellevækst (. Figur 3A)

(A) A427 celler blev transficeret med ikke-targeting (NT) eller β-catenin målretning siRNA’er og behandlet med de angivne koncentrationer af BPTES (venstre panel). Vækstraterne var normaliseret til DMSO behandlede celler transficeret med NT siRNAs. Højre panel afbilder virkningerne af de β-catenin siRNA’er på vækst af DMSO behandlede celler. (B) Immunoblot af A427 proteinekstrakter indsamlet fra celler 72 timer efter transfektion. (C) NCI-H358-celler blev behandlet med 25 ng /ml TGF-ß til 4 wks. Induktion af EMT blev bekræftet ved tabet af E-cadherin og gevinst på vimentin. EMT blev ledsaget af en stigning i GAC i forhold til PC protein niveauer (resultater er repræsentative for 2 uafhængige eksperimenter). Actinniveauer indikeret for protein normalisering. (D) NCI-H358 forældre og 6wk TGF-ß behandlede celler blev behandlet i tre eksemplarer med BPTES i 72 timer og cellevæksten vurderet af CTG. Resultaterne er repræsentative for 3 uafhængige forsøg og plottes som gennemsnitlige vækstrater (+/- SD) sammenlignet med DMSO behandlede celler.

TGFp-induceret EMT i NCI-H358 NSCLC celler fører til GLS1 afhængighed

for at bedre at forstå det bidrag mesenkymale versus epitelial fænotype GLS afhængighed behandlede vi NCI-H358-celler, som er fænotypisk epitel (høj E-cadherin /lav vimentin) og udviser moderat følsomhed for BPTES (fig. 2C), med TGFp at inducere EMT. Som det er blevet beskrevet [22], TGFp flyttet NCI-H358 linje til en mesenchymal fænotype som demonstreret ved nedsat E-cadherin og forhøjet vimentin (Fig. 3C). Især blev GAC proteinniveauer også påvirket i denne overgang, med en 2-fold stigning i proteinniveauer i mesenkymale variant (fig. 3C). I modsætning hertil blev PC niveauer let reduceret (1.4x fald) upon EMT, resulterer i en øget GAC /PC-forhold (fig. 3C). Interessant, samtidig med stigningen i GAC udtryk, niveauer af mindre fremtrædende udtrykte KGA isoform faldt (~ 40%) efter EMT. Forordningen og potentielle forskellen funktion af de forskellige GLS1 isoformer fortsat uklart. I overensstemmelse med den model, der mesenkymale karakter forudsiger GLS1 afhængighed viste TGFp-behandlede NCI-H358 mesenkymale celler signifikant forøget følsomhed over for BPTES forhold til de ubehandlede celler (Fig. 3D). Den TGFp-behandlede linie havde en 1,5-2 gange reduceret vækstrate i forhold til den parentale linje, selv fra den større panel af linjer screenet, var der ingen sammenhæng mellem vækstrate og følsomhed over for BPTES. Disse data kombineret med udtrykket analyser af cellelinje panel, stærkt hævder, at mesenkymale lunge kræftceller er disponeret for afhængighed GLS1.

Da glutaminase tjener som en vigtig regulator af glutamin kulstof indtræden i TCA, vi spurgte, om hæmning af GLS1 forskelligt påvirker oxidative fosforylering (OXPHOS) i epitel sammenlignet med mesenkymale (NCI-H358_M) linje. Mitokondrie iltforbrug blev målt i realtid efter BPTES behandling. Ved baseline, O

2 forbrug sats (OCR) var ikke signifikant forskellig mellem de to linjer (S5A Figur i S1 fil). Efter 2 timer behandling med BPTES blev OCR sammenligneligt reduceret i de epitel- og mesenchymal linjer i forhold til de DMSO-behandlede celler (figur 4A;. S5B figur i S1 File). Især med stigende tid efter BPTES behandling, OCR i forældrenes linje langsomt genvundet, mens OCR fortsatte med at falde med tiden i NCI-H358_M celler (Fig. 4A, S5B figur i S1 File). Faldet i OCR var ikke afspejler nedsat celle nummer på dette tidlige (20 timer) tidspunkt (S5C figur i S1 File). For at bekræfte at denne virkning af GLS inhibering ikke var enestående for NCI-H358 celler udførte vi det samme eksperiment i en yderligere par af følsomme (NCI-H1703) og ufølsomme (NCI-H1563) celler. Hæmning af O

2 forbruget var meget selektiv for GLS1 afhængige NCI-H1703 linie (fig. 4B) tyder på, at svækkelse af oxidativ fosforylering er en del af de anti-proliferative effekt induceret af GLS-hæmning.

(a) NCI-H358 epitel og mesenchymale linjer eller (B) NCI-H1703 (BPTES følsom) og NCI-H1563 (BPTES ufølsomme) celler blev behandlet med DMSO eller 8 uM BPTES og ilt forbrug sats (OCR) blev overvåget i løbet af en 20 HR behandling. Data normaliseret til OCR ved tiden nul (100%) og præsenteres som middelværdier +/- SEM.

P

= 0,024 sammenligne ændringer i iltoptagelse med BPTES i epitel vs mesenkymale line;

P

= 0,00017 sammenligne NCI-H1703 og NCI-H1563 celler. (C) OCR efter behandling med de angivne lægemidler til forstyrre mitochondrial respiration. Data normaliseret til OCR måling før oligomycin behandling. (D) Tilsætning af pyruvat til medier genopretter nedsat FCCP respons i mesenkymale linje. Middelværdier +/- SEM angivet. Resultater er repræsentative for 2-3 uafhængige forsøg.

Den differentierede indvirkning af BPTES på mitokondrie respiration i mesenkymale versus epitelial linje førte os til spørgsmålet om, hvorvidt disse linjer måske mere bredt forskellige i deres evne til adaptivt reagere på metabolisk /mitochondrial stress. For at udforske denne mulighed udførte vi sekventiel behandling af celler med oligomycin (ATP syntase inhibitor), FCCP (afkobler respiration fra ATP-syntese, tillader vurdering af maksimal respiration), og rotenon (inhiberer optagelse af elektroner på Complex I) [23]. Slående, at NCI-H358_M celler var defekte i stigende O

2 forbrug som reaktion på FCCP, indikerer en lavere respiratorisk kapacitet af disse celler (figur 4C;. S5D Figur i S1 File). For nylig blev det påvist, at pyruvat er nødvendig for stimulering af maksimal OCR i brystcancerceller [24]. Interessant yderligere supplering af RPMI medier (indeholdende 11 mM glucose og 2 mM glutamin) med 2 mM pyruvat i nærvær af mitokondrielle inhibitorer genoprettede evnen hos NCI-H358_M celler til at reagere på FCCP med en øget OCR (fig. 4D) , hvilket indikerer, at disse celler kan være ude af stand til effektivt at udnytte endogene forsyninger af pyruvat /andre alternative kulstofkilder i tilstrækkelig grad brændstof deres reserve respiratoriske kapacitet. Taget sammen tyder disse resultater på, at overgangen til en mesenchymal tilstand kan resultere i en forringet evne til adaptivt svare GLS inhibering og potentielt til andre mitokondriske belastninger.

Vi næste testede, om alternative carbonkilder også kunne redde nedsat vækst af NCI-H358_M celler efter BPTES behandling. Tilsætning af enten natriumpyruvat eller en celle permeabel analog af α-KG, dimethyl-2-oxoglutarat (m-αKG), til vækstmediet resulterede i en redning af proliferation til ~85-90%, der blev observeret i vehikelbehandlede celler, sammenlignet til ~45% for dimethylsuccinat (fig. 5). I modsætning αKG og pyruvat, har succinat til vores viden ikke blevet rapporteret at have anti-oxidant egenskaber. Da glutamat afledt glutamin kan indgå i glutathion (GSH) biosyntesevejen og bidrage til at opretholde redox balance [25] (samt brændstofpåfyldning TCA via omdannelse til a-KG) vi undersøgte også effekten af ​​en celle gennemtrængelig derivat af GSH , glutathion reduceret ethylester (GSH-MEE), og antioxidanten N-acetylcystein (NAC) på BPTES induceret væksthæmning. Både GSH-MEE og NAC alene restaureret vækst til ~75-85%, at af vehikelbehandlede celler, mens kombinationen af ​​pyruvat og NAC restaureret spredning til tæt på 95%, der af kontrol celler (Fig. 5). Disse resultater tyder på, at nedskrivninger i både redox stress og TCA cyklus anaplerosis bidrage til de anti-proliferative virkninger af GLS hæmning i disse celler.

NCI-H358_M celler blev behandlet med DMSO eller 8 uM BPTES i tre eksemplarer i nærvær eller fravær af dimethyl-2-oxoglutarat (m-α-KG), natriumpyruvat, dimethylsuccinat, glutathion reduceret ethylester (GSH-MEE), eller N-acetylcystein (NAC) i 96 timer og cellevækst blev målt ved CTG. Resultater er repræsentative for 2 uafhængige eksperimenter. Værdier afbilder gennemsnitlige tilvækst +/- SD forhold til celler behandlet med DMSO alene.

P

værdier sammenligner DMSO vs BPTES behandling med de forskellige hjælpepakker betingelser:

P

= 0,0001 (ingen redning),

P

= 0,04 (m-α-KG),

P

= 0,001 (2 mM pyruvat),

P

= 0,0003 (m-succinat),

P

= 0.01 (GSH-MEE),

P

= 0,003 (NAC),

P

= 0,06 (pyruvat + NAC).

for yderligere at belyse den mekanisme ligger til grund for forskellen følsomheden af ​​epitel og mesenkymale NCI H358 celler GLS inhibering, udførte vi en metabolisk analyse af disse celler, undersøger mønstre af glutamin og glucose (Glc) udnyttelse (Glc mærkning skematisk afbildet i S6 figur (i S1 File) og virkningerne af GLS-inhibering. vi bekræftede først at BPTES blev sammenligneligt hæmmende GLS i både af linjerne ved at overvåge

13C (5) -Gln og

13C (5) -Glu niveauer ved LCMS i celler fodret med ensartet mærket

13C-Gln (U-

13C-Gln). Brug

13C (5) -Glu /

13C (5) -Gln niveauer som en udlæsning for GLS-aktivitet, viste vi effektiv (97%) hæmning af GLS aktivitet i både epitel og mesenkymale linjer (fig. 6A; S7 figur i S1 File). Disse data indikerer, at langt størstedelen af ​​omdannelse af Gln til Glu i disse cellelinier katalyseres af GLS1 og ikke GLS2 eller andre Gin anvender enzymer. En mulig hypotese til at forklare forskellen følsomhed af de to linjer var, at mesenchymale celler fortrinsvis kunne benytte glutamin til brændstof TCA. Overraskende, en 4 hr feed af celler med U-

13C-Gln demonstrerede store bidrag glutamin til citrat puljer i både epitel (63%) og mesenchymale (49%) linje (fig. 6B). I overensstemmelse med den fremtrædende bidrag af glutamin til citrat pools, en 20 timer BPTES behandling reducerede de samlede niveauer af TCA metabolitter, herunder α-KG og citrat (Fig.6C; S7 figur i S1 File). blev observeret lille eller ingen effekt af lægemidlet på celleantal inden denne tid af BPTES behandling i disse (S5C figur i S1 File) og andre cellelinjer testes (S1 figur i S1 File). På trods af det faktum, at glutamin bidraget mere fremtrædende til citrat pools i epitel sammenlignet med mesenkymale linie (fig. 6B), citrat niveauer faldt mere dramatisk og sænke (61%) samlede niveauer i BPTES behandlede NCI-H358_M celler. Taget sammen med den øgede fald i O

2 forbrug BPTES i mesenchymal sammenlignet med epitelial linje, antyder disse data en potentiel forringelse af evnen af ​​mesenchymale linie til at tilpasse sig en blok af Gin strømning ind i TCA, måske på grund til en differentieret evne til at bruge alternative kulstof kilder i denne indstilling.

NCI-H358 epitelial (E) og mesenkymale (M) linjer blev behandlet med DMSO eller 8 uM BPTES for 20 timer. Celler var enten umærket eller U-

13C-Glc eller U-

13C-Gln etiketter blev inkluderet i de sidste 4 timer af medicinsk behandling og niveauer af centrale kulstof metabolitter blev målt ved LCMS. (A) Inhibering af GLS-aktivitet med BPTES. (B) Procentdel af citrat pulje, der er enten umærket eller indeholder kulstof stammer fra U-

13C-Gln (DMSO behandlede celler). (C) TCA metabolit og glutathion pool størrelser +/- BPTES. Der blev indsamlet data i tre eksemplarer eller fire eksemplarer fra 3 uafhængige forsøg (for α-KG og citrat) og afbildet som gennemsnitlige niveauer +/- SD i forhold til NCI-H358 DMSO behandlede celler; værdier blev normaliseret for celleantal;

P

= * 1 × 10

-5; ** 4 × 10

-6; *** 9 × 10

-8 (D) Citrat isotopomer procenter fra

13C (6) Glc mærkede celler behandlet +/- BPTES. *

P

= 0,001, **

P

= 0,002 sammenligne% citrat m + 2 i DMSO eller BPTES behandlet E vs M celler. (E) Ændringer i relative forhold mellem DHAP og 3PG niveauer i eVSM celler +/- BPTES.

P

værdier for sammenligning af metabolitter +/- BPTES: * 0,1, ** 0,57,

# 0,04,

## 0,07. Resultater er repræsentative for 2 uafhængige eksperimenter.

Interessant, overvågning af glukose flow ind i TCA ved hjælp af en U-

13C-Glc foder (S7 figur i S1 File), afslørede glukose bidrag til 28% og 37% af den samlede citrat pool i epitel- og mesenchymale celler henholdsvis; på BPTES behandling blev denne relative bidrag reduceret til 15% i epitel og 3% i mesenkymale linie (figur 6D;. S7 figur i S1 File), tegn på en selektiv blok i glukose flow ind i TCA med BPTES behandling i mesenchymale linie. I overensstemmelse med dette begreb, undersøgelse af glycolytiske mellemliggende pool størrelser afslørede øget DHAP og reduceret 3-PG-niveauer (figur 6E;. S7 figur i S1 fil) med BPTES behandling i mesenkymale linje, der angiver en blok i flow på dette trin i glykolysen. Salg

Ud over forskelle i metabolitter er involveret i bioenergetic /biosyntetiske veje, de NCI-H358_M celler var lavere reduceret glutathion (GSH) niveauer i både basal og BPTES behandlet indstilling i forhold til den epitheliale variant (figur 6C.; S7 figur i S1 File). I 6 yderligere NSCLC undersøgte linjer, der var en lignende tendens mellem graden af ​​fald i GSH puljer med BPTES følsomhed (S8A Figur i S1 File), fører os til at undersøge effekten af ​​BPTES behandling på ROS-niveauer.

Modulation af oxidativ stress ved GLS hæmning i mesenkymale NSCLC celler korrelerer med sensitivitet

for at teste, om følsomhed over for GLS hæmning korreleret med øget oxidativt stress på BPTES behandling, vi målte niveauer af reaktive ilt arter (ROS) ved hjælp af CM-H2DCFDA i NCI-H358 epitelial og mesenkymale par samt et andet par af BPTES følsomme (NCI-H1703) /ufølsomme (NCI-H838) linjer. NCI-H838 linje blev valgt til undersøgelse, da i lighed med NCI-H358 linje, den udviser ringe følsomhed til BPTES trods et betydeligt bidrag af Gin til TCA kulstofpuljer (upublicerede data). Mens GLS hæmning resulterede i øgede ROS niveauer i alle fire testede linier, de følsomme linjer udviste en større størrelse af stigningen i ROS ved BPTES (7,4 vs 4,4 gange i NCI-H358_M forhold til forældrenes; 15,9 gange vs 4,6 gange i NCI -H1703 sammenlignet med NCI-H838 celler. figur 7A). Interessant nok er det blevet vist, at oxidativt stress kan forringe kulhydrat flux gennem glycolysen via inaktivering af enzymer, herunder GAPDH [26]. Taget sammen antyder disse data en model, hvor forøget ROS-generering efter GLS inhibering i mesenkymale celler sensitizes GLS inhibering delvis via hæmning af glucose strømning ind TCA, resulterer i reducerede citrat niveauer og OXPHOS (fig. 7C).

(A) Celler blev behandlet med BPTES i 20 timer og ROS-niveauer målt med CM-H2DCFDA farvestof. Resultater er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter; data plottet som ROS niveauer i forhold til DMSO behandling af hver cellelinje (gennemsnit +/- SD);

P

= 0,01 sammenligne induktion af ROS ved BPTES i de 2 par følsomme /ufølsomme linjer. (B) NCI-H358 epitel- og mesenchymale linier blev behandlet med BSO eller H

20

2 i en 72 hr CTG assay. Resultater er repræsentative for 2-3 uafhængige forsøg og plottet som middelværdi +/- SD. (C) Model for følsomhed af mesenchymale NSCLC celler GLS inhibering. Hæmning af Gln → Glu konvertering af BPTES svækker strømmen af ​​kulstof fra Gln i TCA i begge linjer.