PLoS ONE: Spontane genomiske Ændringer i en kimære Model af tyk- og endetarmskræft Aktiver Metastase og Guide Effektiv Kombinatorisk Terapi

Abstrakt

Tyktarmskræft er den anden mest almindelige årsag til dødelighed af kræft i den vestlige verden med metastaser almindeligvis til stede på tidspunktet for diagnosen. Screening for formering og metastatisk adfærd i en hidtil ukendt kimær-muse tyktarmskræft model, drevet af mutant p53 og β-catenin førte til identifikation af et unikt, invasiv adenokarcinom. Sammenligning af genomet af denne tumor, CB42, med genomer fra ikke- formeringsmateriale tumorer ved opstilling CGH og sekventering afslørede en amplikon på kromosom fem indeholdende CDK6 og CDK14, og en KRAS mutation hhv. Enkeltstof lille molekyle inhibering af enten CDK6 eller MEK, en kinase nedstrøms for KRAS, førte til inhibering af tumorvækst in vivo henviser kombinationsterapi ikke kun ført til regression af subkutane tumorer, men også i nærheden af ​​fuldstændig inhibering af lunge metastase; således, genomisk analyse af denne tumor ført til effektiv, individualiseret behandling

Henvisning:. Zhou Y, Rideout WM III, Bressel A, Yalavarthi S, Zi T, Potz D, et al. (2014) Spontane genomiske Ændringer i en kimære Model af tyk- og endetarmskræft Aktiver Metastase og Guide Effektiv Kombinatorisk Therapy. PLoS ONE 9 (8): e105886. doi: 10,1371 /journal.pone.0105886

Redaktør: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, USA

Modtaget: April 9, 2014 Accepteret: 24 Juli 2014; Udgivet: 27 August, 2014

Copyright: © 2014 Zhou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev helt finansieret af Aveo Pharmaceuticals. Aveo Pharmaceuticals er /var arbejdsgiver for alle de forfattere undtagen Marcus Bosenberg. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Dette arbejde blev helt finansieret af AVEO Pharmaceuticals Inc. Marcus Bosenberg var en betalt konsulent til AVEO. Alle andre forfattere er enten nuværende eller tidligere medarbejdere i Aveo Pharmaceuticals. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de fire mest almindelige og dødelige tumortyper forårsager ca. 53.000 dødsfald årligt i USA alene. Heldigvis sker der fremskridt mod CRC som både forekomsten og dødeligheden af ​​denne tumortype har været faldende i det seneste årti på ca. 2-3% om året. På trods af dette generelle fremskridt, det gennemsnit fem års overlevelse for fase 4 metastatisk kolorektal kræft er stadig en grim 12,5% [1]. Mange genetiske ændringer, der bidrager til CRC er blevet identificeret herunder mutationer, som inaktiverer tumor-suppressor-gener (f.eks p53 og APC muteret i 52% og 76% af tumorer, henholdsvis) eller aktiverer onkogener (f.eks KRAS og BRAF muteret i 42% og 10% af tumorer, henholdsvis) [2], [3]. Patienter med stadie 3 eller 4 CRC brug for mere effektive og mindre toksiske behandlinger til at forbedre deres overlevelse og livskvalitet. Som mere målrettede lægemidler bliver tilgængelige, har kliniske studier vist, at mange af dem er kun beskedent effektive, når de anvendes som et enkelt middel. I modsætning hertil nogle viser signifikant bedre resultater, når det kombineres med eksisterende kemoterapeutika eller andre målrettede lægemidler [4], [5]. For mere præcist at screene lægemiddelkombinationer for dem, der vil give den største fordel er der behov nøjagtige og prædiktive modeller. Gensplejsede musemodeller af CRC er blevet udviklet gennem de seneste to årtier hovedsageligt ved inaktivering af tumorsuppressorgener (fx APC1638N, [6] for en oversigt se [7]). Eksisterende prækliniske modeller af CRC falder primært i fire kategorier: etableret cellelinje xenografter, patient afledt xenotransplantater (PDX), kimlinie gensplejset musemodeller (GEMMs) og Cre-Lox betingede GEMMs. Hver af modelsystemer har sit eget sæt af fordele og ulemper med cellelinje xenotransplantater være den nemmeste at udføre, men mest fjernt beslægtet med den primære tumor i værten, medens i den anden ende af spektret Cre-Lox aktiverede GEMMs opstå i ønskede væv i en immunokompetente vært.

Den seneste samling og udbredelse af tumorer direkte fra patienter har givet nye PDX ressourcer, som opretholder en større tumor heterogenitet, både histologisk og genetisk [8]. Men etablering af humane tumorer i immunsvækkede mus udøver selektivt pres både i tilpasningen til en mus vært og sædvanligvis til en ektopisk sted (dvs. subkutan). Dette begrænser ifølge sagens natur matrixen af ​​interaktioner, der normalt forekommer mellem tumoren, stroma og det hæmatopoietiske system. I flere undersøgelser udbredelsen effektiviteten af ​​patient-afledt materiale i immunsvækkede mus er blevet blandet, med rapporter om op til 77% af meget avancerede humane kolon tumorer udbreder i nøgne mus [9].

GEMMS overvinde mange af de begrænsninger af xenotransplantater. Aktuelle GEMMs af tyktarmskræft udvikle tumorer i en kort tidsramme drevet af karakteristiske mutationer i afgørende onkogener og tumorer suppressor gener (for gennemgang se [7]). Nogle eksisterende musemodeller for tyktarmskræft, som beskæftiger relevante RAS mutationer, har givet indsigt i potentielle lægemiddelkandidater reaktioner [10]. Vores tilgang til at skabe GEMMs indebærer en ikke-germline, mus kimære baseret system, som vi har skabt komplekse modeller for kræft, herunder bryst- og lunge-modeller [11], [12]. Vores embryonale stamceller tilgang giver mulighed for hurtig generation af nye doxycyclin inducerbare modeller med flere genetiske modifikationer uden at skulle krydse avle de ændrede alleler sammen. Tumorer fra disse modelsystemer er blevet propageret som allotransplantater og anvendes til at generere arkiver tumor materiale hvilket muliggør prospektiv undersøgelse af lægemiddelrespons og korrelationen af ​​denne reaktion på tumor egenskaber [12], [13]. Molekylær karakterisering af microarray og array komparativ genomisk hybridisering (aCGH) analyser af sådanne opformerede biblioteker af tumorer har vist, at yderligere tumor fremmer mutationer havde fundet sted i tumor linier påvirker deres vækstrater, metastaser, og respons på lægemidler [12], [13] , [14]. Mens en række biomarkør genekspression skærme bliver stadig mere nyttige i dirigere terapi i igangværende kliniske undersøgelser (f.eks 21, 50, 70 kandidater for henholdsvis Oncotype Dx, PAM50, og Mammaprint [15]) og næste generation sekventering af kendte cancer-gener (n = 236) er begyndt at lede gavnlige valg af behandling for en bred vifte af tumortyper [16], den stigende billigere genom bred screening af udtryk, kopiere nummer, og sekvens kan give en fordomsfri tilgang til bestemmelse af effektiv kræftbehandling.

i dette papir beskriver vi processen med at gøre en ES-celle baseret model for tyktarmskræft drevet af p53 mutation, og inducerbart aktiveret β-Catenin (

CTNNB1

).

CTNNB1

mutationer findes i 5% af menneskers CRC med og uden tilsvarende mutationer i

APC

[2] især i HNPCC (HNPCC) patienter, hvor hyppigheden af ​​

CTNNB1 Salg mutation stiger [17]. De tumorer, der opstår fra disse ES celle baserede modeller indeholder identiske genetiske baggrund og indledende driver mutationer; men de har tendens til at erhverve de novo mutationer og kopiantal variationer i tumorigenese, der skaber begrænset mangfoldighed, som kan påvirke reaktionen på behandling. Den β-Catenin (ΔN131) -driven model præsenterer vi her genereret nye indsigt i genetiske ændringer, der er nødvendige for mus tumor formering, metastase, og lægemiddelrespons.

Resultater

ES-celle baseret kimære kolon model

Vi har tidligere rapporteret en hidtil ukendt fremgangsmåde til udvikling modellering cancer hos mus under anvendelse ES-kimærer. Sammenlignet med de konventionelle germlinie transgene modeller, en af ​​de vigtigste fordele ved det kimære tilgang er, at den tillader celler, der huser onkogene mutationer at sameksistere med naboceller, som er genetisk vildtype, bedre efterligner den onkogene proces i humane cancere. Deletion af APC, en kendt tumor suppressor, er en central begivenhed i tyktarmskræft progression. Inaktivering af APC resulterer i forhøjede nukleare β-catenin-niveauer, hvilket forhindrer terminal differentiering og fremmer proliferation. For at generere kolon model ES-cellelinjer, vi startede med en INK4a +/- linje (H12C23) og sekventielt ændret de to p53 alleler: den første p53 allel blev gjort betinget ved at indsætte loxP flankerer exon 2 til 7, der skifter fra en funktionel allel til en null allel ved Cre-medieret rekombination; den anden p53-allelen har en lox-stop-lox-kassetten indsat i intron 1 kombineret med R172H mutation i exon 5, som resulterer i ekspression af et onkogen version af p53 efter Cre-medieret fjernelse af stop-kassetten. Dernæst blev en GAPDH-lox-stop-lox-rtTA-IRES-luciferase-kassette (aktivatoren /markør-kassette) blev konstrueret, som, når det aktiveres af Cre, udtrykker rtTA (revers tetracyclin trans-aktivator) og Luciferase samtidigt. Endelig ES cellerne blev co-transficeret med konstruktioner til GAPDH-lox-stop-lox-rtTA-IRES-luciferase, villin-Cre og TetO-β-Catenin (ΔN131), en trunkeret version af β-Catenin, der mangler regionen der binder APC /Axin kompleks og konstitutivt akkumuleres i kernen. I ikke gastrointestinale epitelceller resulterende kimærer vil villin promoter tie og dermed Cre vil ikke blive udtrykt. I dette tilfælde er en p53-allel forbliver vildtype og den rtTA aktivator kassetten er inaktiv (fig. 1 ES-celle). I målceller i tarmepitelet hvor villin promoter driver Cre-ekspression, vil kun mutant p53 udtrykkes og aktivatoren kassetten vil udtrykke rtTA og luciferase og derfor β-Catenin (ΔN131) ekspression kan induceres specifikt i disse celler ved doxycyclin (Fig . 1 GI celle og GI celle + dox).

A). I ES-celler: 3 transgene kassetter blev indsat: villin-Cre, GAPDH-lox-stop-lox-rtTA-IRES-Luciferase, og TetO- β-CateninΔN131; alle tre tie i ES-celler. Desuden blev en p53-allel floxet og udtrykker vildtype p53 i ES-celler, og den anden allel blev målrettet med lox-stop-lox og R172H punktmutation, som funktionelt null i ES-celler. B). I mave-tarm-epitel, ekspression af Cre fører til deletion af de to lox-stop-lox kassetter samt floxed p53-allel. p53-ekspression vil skifte fra vildtype til den mutante form og udtryk rtTA og Luciferase tænder. C). i nærvær af doxycyklin, vil rtTA binde til tetO-promotoren og aktiverer transkription af β-CateninΔN131.

Twenty ES-kloner positive for alle fem genetiske elementer blev injiceret i blastocyster at generere kimærer, som fik 2500 ppm Doxycyclin mad efter fravænning. Efter induktion i 2-4 uger, for hver ES linje, 2-3 kimærer med 80% kimærisme ved pelsfarve blev ofret og væv blev indsamlet fra 3 forskellige regioner i tarmkanalen. Vi analyserede ekspression af Cre, rtTA, og β-Catenin ved QRT-PCR og rekombination af p53 alleler og aktivatoren kassetten ved PCR. Disse analyser identificeret 5 genetisk og funktionelt validerede ES linjer (91A2, 91C5, 91D3, 91F5, og 91F7) for yderligere undersøgelse (data ikke vist).

β-Catenin induktion i colon epitel medfører invasive adenocarcinomer

Et hundrede og tyve-ni kimære mus blev dannet ved anvendelse af 5 valideret kolon model ES-cellelinier og fodret med doxycyclin fødevarer efter fravænning. Efter 3 måneders induktion, vi screenet for okkult blod på månedsbasis og mus positive for 2 på hinanden følgende måneder blev overvåget dagligt og aflivet, når der blev observeret vægttab. Tarmkanalen blev dissekeret på langs, skyllet i PBS for at fjerne afføring, derefter fladtrykt på en papirserviet og scannet under en Stereoskopet for polypper og tumorer.

Fourty-fire procent af kimære mus induceret med doxycyclin udviklet intestinale neoplastiske læsioner inden 3-17 måneder med en median tumor latenstid på 11 måneder (fig. 2B, og tabel 1). Bioluminescerende billeddannelse påviste øget Luciferaseaktivitet i den nedre abdominale område af tumorbærende mus (fig. 2A). I disse mus identificerede vi i gennemsnit 2-3 neoplastiske læsioner per mus; histologisk analyse bekræftede 60% af læsionerne som polypper, 25% som adenomer og 15% som adenocarcinomer (fig. 2C). Interessant nok blev de tidlige læsioner (polypper og adenomer) findes ligeligt i både den øvre og nedre tarmkanal henviser blev fundet at langt størstedelen (85%) af avancerede læsioner i tyktarmen. De adenocarcinomer varierede fra 2-8 mm i diameter og lignede humane colontumorer histologisk. Invasion ind i sub-mucosale lag blev observeret hos 70% af adenocarcinomer (fig. 2C). Disse resultater viste, at nuklear β-catenin i kombination med p53 mutation, var tilstrækkelig til at drive malign tumor udvikling i mavetarmkanalen.

A). Bioluminescerende billeddannelse af tre kimære mus efter tre måneders doxycyclin induktion. Luminescerende signaler blev påvist i den nedre del af bughulen i to mus. B). Kaplan-Meyer kurve, der viser latens af colon tumor udvikling i kimære mus. C). Histologisk sammenligning af den normale mavetarmkanalen, godartede polypper, og adenocarcinom fra kimære mus. D). Kemiske kolorimetrisk farvning for Mucin og immunhistokemisk farvning for β-catenin Ki-67, og cyclin D1 i normal GI epitel, polypper og adenocarcinom.

Molekylær karakterisering af β-Catenin drevne kolon tumorer

Analyse ved immunhistokemi af kandidat-proteiner i β-Catenin-drevne primære tumorer angivet aktiveringen af ​​flere veje, der vides at spille en rolle i kolon tumorigenese. De normale tyktarmsepitelet former velorganiseret crypt-villus enheder (fig. 2C), med delende stamfaderceller placeret i krypten region og differentierede ikke-delende celler i villus som det fremgår af begrænsningen af ​​Ki-67 og cyklin D1-positive celler til krypten. Mens membranøs β-Catenin detekteres på alle epitelceller, er nuklear β-Catenin findes kun i 20-30% af cellerne i krypten (fig. 2D). I modsætning hertil blev den normale krypt-villus struktur tabt i både polypper og invasive adenokarcinomer. p-catenin farvning blev ikke længere begrænset til membranen; i stedet 80-90% af cellerne udviste cytoplasmatisk og nuklear β-Catenin positivitet. 60-80% af tumorer celler viste stærk Ki-67 farvning og cyclin D1 positivitet, hvilket viser, at tumorcellerne var aktivt prolifererende. Desuden, selv om stærk positiv farvning for epitel mucin blev påvist i 20-40% af cellerne i alle benigne polypper undersøgte, i overensstemmelse med deres colon epitel oprindelse, mucin blev ikke påvist i de undersøgte adenocarcinomer (fig. 2D). En brøkdel af adenocarcinomer viste også overekspression af EGFR (data ikke vist).

Serial udbredelse af kolon tumorer

Den lange latenstid af denne model, sammen med asynkron tumor udvikling, præsenteret en hurdle om at udføre prækliniske terapeutiske undersøgelser på en statistisk meningsfuld måde. For at overvinde dette problem, vi udforsket måder at udvide tumor materiale indsamlet fra denne model via seriel in vivo formering. Hidtil har rapporter om muse colon tumor formering været fraværende fra litteraturen. Vi testede in vivo opformering i 3 forskellige stammer af immunsvækkede mus, (SCID, NOD-SCID og Nude) i 3 forskellige steder (subkutan plads, nyre kapsel, og cecale sub-slimhinde space) (se tabel S1 for detaljer) af enten tumor fragmenter eller enkelt-suspensioner indlejret i Matrigel. Formering af tumor materiale fra 82 tumorer blev testet i alt 107 lokaliteter. Af de testede tumorer, kun en succes etableret en opformeret tumor linje, CB42, der opstod i coecum en kimære mus fra ES linje 91C5 (tabel 2 og tabel S1).

CB42 voksede robust i både nyrekapslen og det subkutane rum; for eksempel, når 10

5-celler blev injiceret per site, tumorer blev synlige i 5-7 dage og nåede humane grænser, inden for en anden 2 uger. Histologisk analyse viste, at arkitekturen af ​​tumorer formeres enten i nyrekapslen eller subkutane rum lignede den primære tumor (fig. 3A, B og data ikke vist). De opformerede tumorer bibeholdt mere end 80% af celler, der udviser cytoplasmatisk og nuklear β-Catenin ekspression (fig. 3C) og holdt deres epiteliale karakteristika som vist ved homogen IHC farvning for pan cytokeratin (Fig. 3D) og E-cadherin (data ikke vist ). Immunohistokemisk farvning for HGF var positiv i 70-80% af disse tumorceller, og farvning for phospho-MET afslørede høj MET ekspression og aktivering, men mærkeligt ingen EGFR positivitet (fig. 3C-F og data ikke vist) som ofte ses hos menneskelige CRC [18] og andre primære tumorer i ES-kimære B-catenin kolon model

A) Histologi (H . E farvning) af CB42 primær tumor. B). Histologi (H i leveren assay 7 ud af 10 mus udviklede synlige tumorknuder i leveren 5-8 uger efter injektion. En anden række metastase eksperimenter nærmere gengivet processen med metastaser hos patienter human cancer. Tumorceller blev først injiceret i det subkutane rum. Når de inokulerede tumorerne nåede 500-800 mm

3 i størrelse, vi udskåret dem kirurgisk og overvåges musene nøje for generel sundt udseende og vægttab, en angivelse af metastase på indre organer. Otte ud af 10 mus viste ingen tegn på genvækst af den subkutane tumor og 2 havde kun en meget lille knude ( 200 mm

3) på operationsstedet. Men alle 10 mus blev syge inden for 3-5 uger efter operationen. Nekropsi viste metastase til lungen i alle 10 mus og fjernt lymfeknudemetastase i 6 af de 10 mus. Omhyggelig histologisk undersøgelse af andre indre organer, herunder hjerne, lever, milt og nyre afslørede ingen tumor knuder (data ikke vist). Lunge og lymfeknudemetastaser lignede den primære tumor histologisk, og var positive for pan cytokeratin-farvning (fig. 4). Det var ikke klart dog baseret på dette eksperiment, om operationen var årsagssammenhæng formidling tumorceller til fjerne organer, eller blot tillod de formidles tumorer mere tid til at vokse i en fjern orgel ved at forlænge livet for disse mus. At skelne disse to muligheder, vi gentog eksperimentet uden kirurgisk fjernelse af den subkutane tumor. Musene blev aflivet, når de subkutane tumorer nået humane grænser og omhyggeligt undersøgt for tegn på metastase. Små hvidlige knuder blev fundet i lungerne hos 5/10 mus, og 2 af disse mus havde hævede accessoriske lymfeknuder i nærheden halsen. Dette forsøg viste, at CB42 havde kompetence til at metastaserer spontant

Lunge metastaser H lymfeknudemetastase H pan-cytokeratin immunhistokemi af lunge (E) og lymfeknude (F) metastaser.

Spontane genkopital ændringer i CB42

Da CB42 var unik blandt vores β-Catenin drevet kolon tumorer i sin evne til at udbrede og metastaserer udførte vi en række uvildige genomiske assays herunder klædt komparativ genomisk hybridisering (aCGH) og sekventering for at identificere spontane genomiske ændringer, der korrelerede med formering og metastase. Genomisk DNA isoleret fra CB42 primær og subkutan, serielt-formeret (passage 3, mærket som CB42P3) tumor prøver sammen med DNA fra 7 andre primære tumorer, der ikke udbreder blev valgt til sammenligning af aCGH. Analyse af aCGH data viste multiple amplikoner der var til stede i kun subkutant opformeret CB42 tumorer (CB42P3), men ikke det primære CB42 tumor, eller nogen af ​​de andre primære tyktarmstumorer (fig. 5A).

A ). aCGH profil CB42 primær tumor og passage 3 opformeret tumor. En 3,5 Mb amplikon på kromosom 5 blev opdaget kun i den formeret tumor. Sonder til Cdk6 blev farvet i gul og prober til Cdk14 blev farvet i blåt. B). RT-PCR-analyse for ekspression af 7 gener i kromosomet 5 amplikon. Den relative ekspression værdier af CB42P4 tumorer (n = 4) blev normaliseret til værdier for normale cecal epitel (n = 4). C). Western blot analyse for niveauer af Cdk4 og Cdk6 i CB42 og 4 menneskelige kolon kræftceller. D). Hyppighed af CDK6 og CDK14 forstærkning i humane prøver kræft fra 13 vævstyper. Data blev hentet fra CBio hjemmeside.

Den mest prominente amplikon var en 3,5 Mbp region på kromosom 5 mellem Cdk6 og Steap1 der indeholder mere end 25 kendte gener. Vi undersøgt ved QRT-PCR af ekspressionen af ​​7 kandidatgener inden amplikonet og opdagede, at 3 af de 7 gener blev signifikant overudtrykt i sammenligning med normal mavetarmkanalen epitel: Cdk6, Cdk14 (Pftk1) og Fzd1 (Fig 5B.). Western blot analyse af CB42 og flere humane colon tumor xenograft linjer bekræftede høj ekspression af CDK6 i CB42 og SW620 og påviselig CDK6 i HCT116 og HCC2998 indikerer, at aktivering af CDK6 kan være fordelagtig for humane tumor xenografter (fig. 5C). Analyse af (TCGA) database Cancer Genome Atlas fundet evidens for amplifikation af det syntenic region i det humane genom og afslørede, at mens amplifikation af regionen var ualmindelige i humane CRC, lå på op til 11% af gastriske tumorer (fig. 5D) .

mutationer identificeret ved genomsekvensering

Ud over at kopiere nummerændringer, vi undersøgte DNA fra opformerede CB42P3 tumorer for mutationsændringer ved hele genomet, exome, og RNA-sekventering, som konsekvent identificeret 9 mutationer i exon regioner (tabel 3). En af mutationerne forårsagede en ændring af glycin til cystein ved codon 12 positionen af ​​KRAS-genet. Efterfølgende pyro-sekventering af DNA fra både primær og opformeret CB42 samt 10 andre primære colontumorer bekræftede KRAS mutation kun opformeret CB42, men blev ikke fundet nogen KRAS mutationer i nogen af ​​de andre prøver, hvilket antyder, at aktivering af KRAS var ikke påkrævet for primær kolon tumor initiering i CRC-modellen, men var nødvendig for ondartet vækst af tumoren under formering og metastase.

vækst og metastaser af CB42 er MET /HGF vej uafhængig

da MET-ekspression og aktivering blev forhøjet i opformeret CB42 (fig. 3F) og den rolle, MET i invasion og metastase er godt understøttet i litteraturen [19], [20], [21], vi testede, om markedsøkonomisk vej kunne spille en vigtig rolle i CB42 proliferation og metastase. For at teste denne hypotese, gennemførte vi en serie på 3 forsøg. I det første forsøg, vi behandlede mus implanteret med subkutane CB42 tumorer med crizotinib (50 mg /kg po QD), en småmolekyle-inhibitor af MET og ALK. Overraskende, trods det høje niveau af MET-ekspression og aktivering, behandling af CB42 med crizotinib havde ingen virkning på tumorvækst (TGI = 0%, fig. 6A). I det andet eksperiment, studerede vi, om crizotinib kunne inhibere CB42 metastase. CB42 tumorceller blev injiceret subkutant og de primære tumorer blev kirurgisk fjernet efter 14 dage, når den gennemsnitlige tumorstørrelse nåede 500 mm

3. Disse mus blev cohorted i ét køretøj gruppe (n = 10) og en behandlingsgruppe (n = 10), og behandling startede den anden dag efter operationen. Mus i begge grupper begyndte at blive syg 2-3 uger efter operationen. Da de blev aflivet, blev lungemetastaser fundet i 9/9 mus i vehikelgruppen og 10/10 mus i crizotinib behandlede gruppe, mens der blev observeret lymfeknudemetastase i 2 mus fra hver gruppe. blev ikke observeret nogen signifikant forskel i antal eller størrelse af metastaser mellem behandlingsgrupper, tyder på, at hæmning af MET påvirkede ikke metastatisk vækst efter etablering af fjerne metastatiske tumorer.

A). MET inhibitor crizotinib ikke hæmme CB42 tumorvækst. B). CDK4 /6-inhibitor PD0332991 signifikant inhiberede CB42 tumorvækst (*** P 0,001). C). MEK1 /2-inhibitor PD0325901 blokerede fuldstændigt CB42 tumorvækst (*** P 0,001). D). Kombination af CDK4 /6 og MEK1 /2-inhibitor induceret CB 42 tumorregression (**** P 0,0001). E). Subkutane tumor dele af de tre behandlingsgrupper i slutningen af ​​studiet. Kombinationen er signifikant mere potent end CDK4 /6-inhibitor alene (**** P 0,0001) eller MEK-inhibitor alene (*** P 0,001). F). Gross undersøgelse af lungelapper for metastatiske knuder afslørede, at både CDK4 /6-inhibitor og MEK-inhibitor signifikant inhiberede CB42 lunge metastase (* P 0,05), men kombinationen var signifikant mere effektiv end enten alene middel (**** P 0,0001) og næsten helt elimineret lunge metastase.

i det tredje forsøg, vi testede, om markedsøkonomisk behandling hæmning kunne forhindre spredning af tumorceller ud af små primære tumor sites. I dette forsøg dosering med vehikel eller crizotinib startede to dage efter subkutan injektion af CB42 celler i recipientmus. De subkutane tumorer blev fjernet kirurgisk to uger senere og doseringen fortsatte indtil musene blev syge. Lungemetastaser blev observeret i alle mus, uanset om de har fået crizotinib eller vehikel. Baseret på disse eksperimenter, konkluderede vi, at markedsøkonomisk behandling ikke var nødvendig for CB42 tumorvækst og metastase.

Signifikant hæmning af subkutan og metastatisk tumorvækst ved CDK4 /6 eller MEK hæmning

Da formeret CB42 havde et genomisk amplifikation af CDK6 og stærk cellulær ekspression (se ovenfor), testede vi en forbindelse, PD0332991, som inhiberer både CDK4 og CDK6 [22]. Trods bekræftelse ved Western blot, der udviste stærk CDK6 og svagere CDK4 ekspression i CB42 (fig. 5C), en 3 dages in vitro proliferation assay viste, at PD0332991 ikke inhiberede proliferation af en CB42-afledt cellelinje selv ved den højeste dosis (10 uM) (data ikke vist). I modsætning hertil behandle mus der fik implanteret subkutane CB42 tumorer med PD0332991 (125 mg /kg, po QD) inhiberede stærkt subkutan tumorvækst (TGI-75%, p 0,00005, fig 6B.) Og reduceret lunge metastase. Ved afslutningen af ​​forsøget, kun fem ud af 15 mus behandlet med PD0332991 havde synlige knuder i lungerne henviser alle 15 mus i køretøjet grupperne var synlige lungemetastaser. Der var i gennemsnit 5 lungeknuder per mus i PD0332991 gruppen versus 18,3 i køretøjet (p = 0,00002). Samlet disse resultater antydede, at CDK6 overekspression tillader mus GI tumorer at vokse uden for colon sub-slimhinde miljø og at aktivering af CDK6 kunne bidrage til GI tumorer overleve og trives i et metastatisk indstilling.

Da CB42 havde også fået en aktivering Kras mutation og litteratur foreslog, at KRAS muterede tumorer var følsomme over for MEK-inhibitorer [23], MEK-inhibitor PD0325901 blev testet for dets evne til at inhibere væksten af ​​CB42 in vitro og in vivo. MEK hæmning blokerer nedstrøms signalering af KRAS. In vitro PD0325901 kraftigt blokeret ERK1 /2-signalering i CB42 celler (data ikke vist). In vivo, en enkelt dosis PD0325901, enten ved 5 mg /kg eller 15 mg /kg, resulterede i fuldstændig inhibering af ERK1 /2-phosphorylering 4 timer efter dosering (data ikke vist). Behandling med PD0325901 af subkutane CB42 tumorer hos mus, ved enten 5 mg /kg eller 15 mg /kg, medfører næsten fuldstændig tumorvækstinhibering (93% og 96% deltaTGI henholdsvis fig. 6C). Scanning af lungerne ved slutningen af ​​undersøgelsen viste også en signifikant reduktion af både antallet og størrelsen af ​​metastatiske knuder i de behandlede mus vs. køretøj gruppe. Disse data viste, at væksten og metastaser af CB42 som en subkutan allograft var også stærkt afhængig af KRAS mutation.

Regression af CB42 ved kombineret hæmning af KRAS /MEK signalering og CDK4 /6

de multiple genetiske læsioner identificeret i CB42 foreslået, at maksimal terapeutisk virkning kan opnås med en kombination af målrettede midler, som inhiberer flere af de dysregulerede pathways. For at teste denne hypotese, behandlede vi CB42 med MEK-inhibitor PD0325901 (5 mg /kg) i kombination med CDK4 /6-inhibitor PD0332991 (125 mg /kg). Kombinationen af ​​disse to lægemidler var veltolereret og medførte ikke signifikant vægttab ( 10%) (data ikke vist). Kombineret behandling med PD0332991 og PD325901 har dramatisk relatere tumorer med gennemsnitlig 35% (fig. 6D), mens de enkelte agent behandlingsgrupper igen viste signifikant tumorvækstinhibering sammenlignet med kontroller. Sammenligning af de individuelt plottede tumorstørrelser mellem de tre behandlingsarme i slutningen af ​​undersøgelsen illustreret, hvor væsentlig og ensartet tumorregression var i kombinationen arm (fig. 6E). Også ved slutningen af ​​undersøgelsen blev lungerne dissekeret og undersøgt for observerbare metastatiske knuder. Færre metastaser blev observeret i både enkelt agent behandlingsgrupper (ned til 5 knuder /mus i forhold til 15 knuder /mus i bilen kontrol arm), mens især kombinationen armen gennemsnit mindre end en knude pr mus (fig. 6F). Således for CB42, både erhvervede genetiske læsioner bidraget til subkutan tumorvækst samt metastatisk potentiale og /eller metastaseret tumorvækst.

Tvungen ekspression af CDK6 og CDK14 resulterede i propagatable colontumorer

Selvom der er noget litteratur beviser for, at både CDK6 [24], [25] og CDK14 [26], [27] er involveret i forskellige aspekter af tumorigenese, deres potentielle roller i colon tumorigenese øjeblikket ikke godt forstået. Vi tog fordel af fleksibiliteten i ES kimære model tilgang og tilføjede doxycyclin-inducerbare ekspressionskassetter af CDK14 alene eller i kombination med CDK6 og Fzd1 til den oprindelige kolon model ES linje 91C5 at etablere nye model linjer.