PLoS ONE: selvlysende ortotopisk musemodeller af menneskelig Lokaliseret Ikke-småcellet lungekræft: Feasibility og Identifikation af cirkulerende Tumorceller

Abstrakt

Baggrund

Prækliniske modeller for ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) kræver bedre klinisk relevans for at studere sygdomsmekanismer og innovative lægemidler. Vi søgte at sammenligne og forfine selvlysende ortotopisk musemodeller af menneskelig lokaliserede NSCLC.

Metoder

athymiske

nøgne

mus undergik subkutan injektion (gruppe 1-SC, n = 15, kontrol), perkutan ortotopisk injektion (gruppe 2-POI, n = 30), kirurgisk ortotopisk implantation af subkutant dyrket tumorer (gruppe 3-SOI, n = 25), eller transpleural ortotopisk injektion (gruppe 4-TOI, n = 30) af A549-luciferase celler. Bioluminescent

in vivo

billeddannelse blev derefter udført ugentligt. Cirkulerende tumorceller (CTCs) blev ransaget hjælp Cellsearch® systemet i SC og TOI modeller.

Resultater

Gruppe 2-POI var forbundet med uventet direkte pleura spredning af den cellulære løsning i 53% af sagerne, der forbyder yderligere evaluering af enhver lokaliseret lunge tumor. Gruppe 3-SOI var præget af høj perioperative dødelighed, i første omgang lokaliserede lungetumorer, og lokal udvikling. Gruppe 4-TOI var forbundet med lav perioperativ mortalitet, i første omgang lokaliserede lungetumorer, loco regional udvidelse, og fjern metastaser. blev påvist CTCs i 83% af

nøgen

mus der bærer subkutane eller ortotopisk NSCLC tumorer.

Konklusioner

Transpleural ortotopisk injektion af A549-luc celler i

nøgen

mus lunge inducerer lokaliseret tumor efterfulgt af lymfe udvidelse og dødelighed, og tillod første gang identifikation af CTCs i en NSCLC musemodel

Henvisning:. Mordant P, Loriot Y, Lahon B, Castier Y, Lesèche G, Soria JC et al. (2011) selvlysende ortotopisk musemodeller af menneskelig Lokaliseret Ikke-småcellet lungekræft: Feasibility og Identifikation af cirkulerende Tumor Cells. PLoS ONE 6 (10): e26073. doi: 10,1371 /journal.pone.0026073

Redaktør: Wafik S. El-Deiry, Penn State Hershey Cancer Institute, USA

Modtaget: Juni 24, 2011; Accepteret: September 19, 2011; Udgivet: 11 oktober 2011

Copyright: © 2011 Mordant et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. PM har blevet støttet af den franske Society of thorax kirurgisk (SFCTCV). BL er blevet støttet af den franske Medical Research Foundation (FRM) og Generation Thorax. Dette projekt er blevet støttet af den franske Cancer Research Association (ARC til MCV og ED) og Gustave Roussy Foundation (Fondation Gustave Roussy til MCV og ED). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) er den hyppigste årsag til kræft-relateret dødelighed på verdensplan. Trods talrige kliniske forsøg med præklinisk lovende stoffer, har ingen større udbrud foretaget i NSCLC ledelse i de sidste årtier. Selv om der er stærk evidensbaseret medicin understøtter den kliniske anvendelse af cytotoksisk, omkring 3 typer af agenter har vist konsekvent men begrænset effekt (platin, taxaner, gemcitabin). For nylig er målrettede behandlinger givet afkald vigtige forhåbninger givet deres evne til direkte ramt specifikke overlevelsesmekanismer cancercellelinjer. I skarp kontrast til robustheden af ​​den underliggende biologiske rationelle, klinisk translationel af denne viden til kliniske fordele stadig udfordrende, da målrettede behandlinger viste kun en marginal overlevelse, når de overvejer hele NSCLC patienter befolkningen [1] – [4]. Efter disse indledende forsøg, retrospektive molekylære analyser af tumorvæv førte til definitionen af ​​undergrupper af patienter, der positivt reagerer på testpræparater behandlinger, med forvaltningen af ​​visse kræftformer bliver revolutioneret [5]. Blandt patienter med NSCLC, der modtager erlotinib, tilstedeværelsen af ​​en EGFR mutation forøget respons til agenten [6], [7], men vedrørte kun 16% af patienterne [8]. For nylig er inhiberingen af ​​anaplasic lymfom kinase (ALK) blevet rapporteret at resultere i tumorkrympning eller stabil sygdom hos de fleste patienter med NSCLC, der huser EML4-ALK fusionsgener, men vedrørte kun 2 til 7% af NSCLC [9]. Men i mellemtiden er blevet brugt i kliniske forsøg test aktive behandlinger på tumorer, betydelig indsats [2], [3], [10] – [12]

Forskellen mellem værdierne for de kliniske. rationale, mængden af ​​prækliniske data på den ene side og den lave produktion af deres overførsel i kliniske forsøg tyder på, at relevansen af ​​prækliniske modeller kan drages i tvivl. Især bør præklinisk testning have en mere skarpskåret positiv versus negativ prædiktiv værdi [13]. Nuværende in vivo prækliniske modeller ikke afspejler trinnene malign progression fra normalt væv til præcancer læsion og derefter til kræft (lokaliseret og derefter metastatisk). Ideel model bør efterligne den naturlige historie af human cancer, for at forbedre vores forståelse af kræft patogenese, forudsige effekten af ​​den undersøgte behandling og identificere, hvilken behandling vil passe til hvilken patient før udformningen af ​​kliniske forsøg. I denne sammenhæng xenografter modeller fortsat hjørnestenene i prækliniske forsøg og vil vinde ved hvilke tekniske forbedringer, sammen med den seneste udvikling af computer-assisteret drug design, computermodellering, og gensplejsede dyr [14]. Humane NSCLC xenotransplantater kan implanteres i immundefekte dyr enten subkutant (SC) eller orthotopisk. I den ene hånd, SC xenografter af lungekræft er nemme at udføre og at følge, men mangler relevans med hensyn til (i) den naturlige historie af kræft som følge af manglende lymfe eller metastatisk forlængelse, og (ii) forudsigelse af narkotika effekt i kliniske forsøg som bevidnet af den høje andel af negative kliniske forsøg [13]. I den anden side ortotopisk modeller af lungekræft er teknisk mere udfordrende, ikke altid efterligne den naturlige historie for lungekræft, men hæve betydelig håb om screening narkotika [15]. Den seneste stigning i vores forståelse i krydstale af tumor stroma [16] – [18] og dets inddragelse i resistens, metastase, immun flugt, angiogenese tyder stærkt på, at ortotopisk modeller skal give værdifulde oplysninger, som man ikke kunne få fra sub -cutaneous modeller.

i betragtning af thorax tumorer, den tekniske udfordring er at vokse “lunge tumorceller i brystet”. Flere teknikker kan anvendes til dette formål, herunder intra administration luftrør [19] eller perkutan ortotopisk injektion [20] af NSCLC-celler i opløsning, og kirurgisk ortotopisk implantation af subkutant dyrket tumor stammer fra NSCLC cellelinje [21]. Intratracheal administration er associeret med diffus indledende spredning af cellerne til begge lunger, forstyrrer progression og lunge metastase proces, derfor begunstige perkutan og kirurgiske modeller. Men teknisk gennemførlighed og naturhistorie af disse to modeller er aldrig blevet sammenlignet. Denne undersøgelse havde til formål at sammenligne og forfine disse to ortotopisk xenografter modeller af lungekræft, med det ultimative mål at gengive den menneskelige NSCLC progression, fra oprindeligt lokaliseret intraparenchymatous tumor, til metastase udvikling og generel forværring. Til dette formål har vi sammenlignet fire xenotransplantater modeller, herunder SC injektion anvendt som kontrol, perkutan ortotopisk injektion og kirurgisk ortotopisk implantation som tidligere beskrevet, og transpleural ortotopisk injektion som ny model. For at tillade langsgående opfølgning af tumor progression og yderligere evaluering af behandlingseffekt, brugte vi en cellelinje transfekteret med luciferase og udførte

in vivo

bioluminescerende billeddannelse. Feasibility blev vurderet ved perioperativ mortalitet og transplantation sats. Klinisk relevans blev vurderet ved initial intra parenkymvævet placering, loco-regional udvidelse, metastatisk forlængelse, median overlevelse og histologisk aspekt. I en eksplorativ analyse blev identifikation af cirkulerende tumorceller (CTCs) udføres ved hjælp af Cellsearch® assay (Veridex LLC, USA).

Materialer og metoder

Cell linje

human A549 lungeadenocarcinom cellelinje stabilt transficeret med luciferase (A549luc) blev indkøbt fra Caliper Lifesciences Corp. Celler blev dyrket i komplet medium bestående af 10% (v /v) føtalt bovint serum, 2 mmol L-glutamin og 50 enheder /ml penicillin-streptomycin i RPMI (alle fra Invitrogen). Celler blev dyrket ved 37 ° C og 5% CO2 i en inkubator, testet som mykoplasma fri anvendelse af et PCR mycoplasma detektion kit (MycoProbe, R 0,05 blev betragtet som signifikant. Alle data analyser blev udført med den gratis R software (https://www.r-project.org, R Foundation for Statistisk Computing, Wien, Østrig).

Resultater

Feasibility

Feasibility blev vurderet ved bestemmelse af perioperativ mortalitet og transplantation sats. Den perioperative mortalitet var null i gruppe 1-SC anvendt som kontrol, og signifikant højere i gruppe 3-SOI (60%, p 0,001), men ikke i gruppe 2-POI (6%, p = 0,79) eller 4- TOI (3%, p = 0,72). Vurdering af virkningen af ​​en læreproces på det perioperative dødelighed af gruppe 3-SOI, observerede vi en ikke-signifikant fald i dødeligheden mellem de første 10 dyr og de tidligere 15 dyr (dødelighed 80% vs 47%, p = 0,21 ). Ingen signifikant forskel blev observeret mellem grupperne 2-POI og 4-TOI vedrørende perioperative dødelighed (p = .99, tabel 1). Engraftment rate var 100% i gruppe 1-SC anvendt som kontrol, og signifikant lavere i gruppe 2-POI (68%, p = 0,037), gruppe 3-SOI (60%, p = 0,034) og gruppe 4 -TOI (65%, p = 0,027). Ingen signifikant forskel blev observeret mellem de 3 forsøgsgrupper vedrørende engraftment rate (p = .90, tabel 1).

Klinisk relevans

Klinisk relevans blev bedømt ved placering af den oprindelige tumor, billeddannelse af tumor forlængelse, overlevelse analyse og histologisk undersøgelse. Den oprindelige tumor blev begrænset til SC væv i gruppe 1-SC og lungeparenkymet i gruppe 3-SOI. I gruppe 2-POI, 53% af de dyr, undergik pleural såning under perkutan ortotopisk injektion og udviklet indledende loco regional udvidelse til begge lungehinder. Da målet med denne undersøgelse var at få en intrapulmonale lokaliseret NSCLC model, denne umiddelbare pleural såning diskvalificeret teknikken. I gruppe 4-TOI, tumoren blev oprindeligt begrænset til lungeparenkymet (tabel 1, figur 2a og 2b). Bioluminescent billeddannelse fundet uregelmæssige kurver i gruppe 1-SC og 3-SOI, med høj inter individuelle og kronologiske variationer. Intet dyr udviklede locoregional eller metastatiske udvidelser under opfølgning. I gruppe 2-POI, blev der ikke bioluminescens kurve plottet på grund af perioperativ pleural såning. Ét dyr udviklede knoglemetastaser. I gruppe 4-TOI, bioluminescerende billeddannelse fundet en regelmæssig, eksponentiel kurve efter dag 21. Syv procent af dyrene udviklede locoregional udvidelse til homolateral lungehinden som en videreudvikling af den primære tumor. Et dyr udviklede knoglemetastaser (tabel 1, figur 2a). Overlevelse analyse viste, at mediane overlevelse ikke blev opnået efter en opfølgning på 2 måneder i gruppe 1-SC og 3-SOI. I gruppe 2-POI, blev der ikke overlevelse kurve plottet på grund af perioperativ pleural såning. I gruppe 4-TOI, median overlevelse var 40 dage (tabel 1, figur 2C). Histologisk undersøgelse afslørede SC runde tumorer med en regelmæssig form, høj andel af udifferentieret carcinom, få kapsulære bristninger, og få vaskulære eller lymfatiske emboli i gruppe 1-SC. I gruppe 2-POI, regelmæssige intraparenchymatous tumorer blev opnået, med en lav andel af udifferentieret carcinom, et stort antal kapsulære bristninger, og vaskulære eller lymfatiske emboli. I gruppe 3-SOI, uregelmæssige intraparenchymatous tumorer blev opnået, med en lav andel af udifferentieret carcinom (+), kapsulære bristninger (++) og et stort antal vaskulære eller lymfatiske emboli. Resultaterne var ens i gruppe 4-TOI og gruppe 2-POI (Figur 3, tabel 2).

a. Udviklingen i de fotoner tæller (udtrykt som 10

6 fotoner /s) over tid, fra dag 0 (implantation) til dag 63 (slutningen af ​​bioluminescerende opfølgning). For hver gang, middel- og standardafvigelse af dyrene i live rapporteres. I gruppe 2-POI, perkutan injektion førte til pleural såning i 53% af tilfældene, som postoperativ røntgen viste kontrastmiddel i enten venstre pleurale rum, højre pleurale rum (anatomisk kontinuum), eller begge dele. b. Repræsentant evolution af bioluminescerende signal, fra dag 14 til dag 42. I gruppe 2-POI, pleural såning skabte et signal placeret på det rigtige grundlag af brystkassen, modsiger med det primære mål med denne undersøgelse. Ingen efterfølgende opfølgning som er udført for denne gruppe. c. Survival kurven fra tidspunktet for tumorimplantation til 2 måneder ved hjælp af Kaplan-Meier-metoden og 95% konfidensinterval barer. Overlevelsen 2 måneder er 100% i gruppe 1-SC, 40% i gruppe 3-SOI, og 65% i gruppe 4-TOI.

Kirurgisk ortotopisk implantation (Gruppe 3) resulterede i lokaliserede infiltrerende tumorer, hvorimod perkutan ortotopisk injektion (gruppe 2) og transpleural ortotopisk injektion (gruppe 4) resulterede i lokaliserede afrundede knuder. Histologisk undersøgelse afslørede en høj andel af udifferentieret carcinom i gruppe 1-SC tumor, men en lille andel i de 3 forsøgsgrupper. Desuden blev de 3 forsøgsgrupper forbundet med mere kapsel brud og vaskulær emboli end gruppe 1-SC.

Identifikation af CTCs

xenograft implantation satser var 100% i CTC gruppe 1 (SC, n = 6) og 60% i CTC gruppe 2 (TOI, n = 9). Tre Cellsearch® analyser blev udført i hver kontrolgruppe, og 6 Cellsearch® analyser blev udført i hver forsøgsgruppe. Negative kontroller demonstrerede ingen eller et CD45-, DAPI +, CKPE + celle pr assay (data ikke vist). Positive kontroller påvist en sammenhæng mellem antallet af tumorceller i opløsning, og Cellsearch® CTC count (figur 4a og 4b). I CTC gruppe 1-SC, 5 assays (83%) var positive for CTCs detektion (CTCs niveauområde 2-5, betyder 2,5 ± 1,76). I CTC gruppe 2-TOI, 5 analyser var positive for CTCs detektion (CTCs niveauområde 2-21, betyder 9,5 ± 9,35). Alt sammen, 3 uger efter tumor implantering, blev påvist CTCs i 83% af

nøgen

mus med enten SC eller ortotopisk NSCLC tumorer (Figur 4c og 4d). Når man sammenligner grupper, forskellen i CTC niveauer viste en tendens til statistisk signifikans (p = 0,058, figur 4c, tabel 2).

a. Repræsentation af farvning af cirkulerende celler under anvendelse af Cellsearch® assay. CTC er defineret som CD45-, DAPI +, og CKPE + celler. – Øvre linie: som en positiv kontrol blev 50 og 500 A549luc cellerne analyseret i en opløsning indeholdende 600 pi medium og 7 ml af sunde humant blod. Her, som et eksempel, både CD45-, DAPI +, CKPE + -celler er tumorceller. – Nederste linje: gengivelse af resultaterne af de eksperimentelle grupper. Her, som et eksempel, denne CD45-, DAPI +, CKPE + celle en CTC. b. Korrelation mellem Cellsearch ® CTC tælle og antallet af tumorceller i opløsning. Som kontroller, 0 (negativ kontrol), 50 og 500 (positive kontroller) A549luc celler blev analyseret i en opløsning indeholdende 600 pi medium og 7 ml sundt menneskeblod. Dette forsøg viste en korrelation mellem Cellsearch® CTC tælle og antallet af tumorceller i opløsning (R

2 = 0,99857). c. Antal CTC ifølge forsøgsgruppen, CTC gruppe 1 (SC) eller CTC gruppe 2 (orthotopisk). Den samlede positivitet af Cellsearch ® assayet er sammenlignelige i begge grupper (83%), med en tendens til mere CTC i orthotopisk snarere end i det subkutane model. d. Repræsentation af bioluminescerende signal og antallet af CTC påvist i hver af de 12 dyr.

Diskussion

Tumor implantationsstedet og metode virkninger tumor udvikling og kinetik

Sammenligning SC, perkutan ortotopisk injektion og kirurgiske ortotopisk implantation modeller med hensigt at forfine opfølgningen af ​​tumor progression hjælp selvlysende billeddannelse, vi står over for rammerne af disse modeller, herunder orgel uoverensstemmelse (SC), hyppig pleural såning (perkutan ortotopisk injektion) og høj perioperative mortalitet (kirurgisk ortotopisk implantation). Ingen af ​​disse modeller giver en pålidelig opfølgning af tumorudvikling hjælp bioluminescerende billeddannelse. Derfor har vi udviklet en transpleural ortotopisk indsprøjtning model, der kombinerer lav perioperative dødelighed, rimelig engraftment sats, knaphed på pleural såning, og tumor progression med metastaser, som der kan overvåges tumor progression af selvlysende billeddannelse. Desuden er denne undersøgelse muliggør identifikation af CTCs i murine modeller af NSCLC for første gang til dato. Vi mener, at ud over funktionel billeddannelse, vil ansøgningen på prækliniske in vivo etape af CTCs bidrager til at lægge biomarkører for tumor byrde og behandling effekt i efterfølgende kliniske forsøg.

SC xenografter modeller

SC xenografter fra human-afledte cellelinier til immundeficiente dyr har været guldstandarden af ​​prækliniske cancer eksperimenter i årtier [14]. Denne model præsenteret flere fordele, herunder teknisk gennemførlighed (fravær af anæstesi, nemme at udføre injektion) og tumor tilgængelighed (direkte måling af SC tumor tillader langsgående opfølgning). Imidlertid er SC-modeller begrænset af uoverensstemmelse mellem xenograft oprindelse og vært microenvironnement, herunder ekstracellulær matrix, parakrine signaler, og derfor ikke model Pagets “frø og jord” teori [22]. Denne forskel har vist sig at påvirke tumor respons på cytotoksiske midler og strålebehandling [23], [24] og bestemt påvirke responset hidtil ukendte anticancermidler. Denne uoverensstemmelse kan være af afgørende betydning i NSCLC, var hypoxi og neoangiogenese spiller en stor rolle i tumor progression [25], og forekommer forskelligt i SC og intrathorakale xenografter [26]. Sidste, kun et mindretal af SC modeller udbrede og fremskridt til metastatisk stadie, fraværet af progression fra lokaliseret til metastatisk stadie gennem loco-regional lymfeknude udvidelse er derfor en væsentlig begrænsning af SC-modeller, mens den største årsag (2/3) af cancer døden er metastatisk sygdom.

Disse forskelle har stor betydning med hensyn til tumor progression, med få cirkulerende tumorceller og ingen metastaser i vores eksperimenter, peger en stor grænse for evaluering stof, med to risici. Den første risiko er at skubbe ind på klinikken et molekyle eller en lægemiddelkombination med ringe eller ingen effekt. Som et eksempel, har kombinationen af ​​kemoterapi og EGFR-hæmmere bevist effekt i SC modeller af NSCLC [27], [28], men har aldrig nået signifikant effekt i kliniske forsøg herunder uselekterede NSCLC patienter upon EGFR status [3], [10] , [29]. Den anden risiko er at stoppe udviklingen af ​​lovende lægemidler. Som et eksempel, HIF-1alpha antagonist PX-478 viste ingen målbar aktivitet mod NSCLC SC xenografter, men hæmmet progression og spredning af orthotopisk human småcellet lungecancer og lunge adenocarcinom hos mus, og til slut testet i fase 1 forsøg [30].

alt i alt tyder disse data, at SC implanteret ikke er helt tilstrækkelige til præklinisk studie af NSCLC, og bør kun anvendes og analyseres omhyggeligt. Lignende konklusioner er draget fra SCLC prækliniske test af lægemidler [31].

Tidligere ortotopisk modeller

For at tage indflydelse orgel specificitet og tumor mikro environnement hensyn, ortotopisk modeller er blevet gradvist udviklet sig over de sidste 20 år, med det endelige mål at opnå en enkelt intraparenchymatous lunge tumor, der efterligner den kliniske situation og tillade langsgående opfølgning. Intravenøs [32], intrabronchial [33] – [35] og intrapleural administration [36], [37] for lungekræft cellelinier resulterede i pleural, lokalt fremskreden eller flere synkrone tumorer. Derfor kan disse modeller være interessant at studere disse særlige situationer, men kan ikke udvides til lokaliseret intrapulmonal NSCLC, der udgør størstedelen af ​​NSCLC-patienter og grundlaget for yderligere tumor progression.

Gensplejsede musemodeller (GEMMs) der er også udviklet til at studere NSCLC hos mus. Disse dyr er sædvanligvis p53 muteret, begunstige genetisk ustabilitet og tumordannelse, og udvikle lungetumorer drevet af EGFR [38], KRAS [39], PIK3CA [40], BRAF [41] onkogen aktivering eller tilstedeværelsen af ​​EML4-ALK-fusion onkogen [42]. KRAS muteret lungekræft kan observeres i musestammer bærer onkogene alleler af KRAS, som kun kan aktiveres på en spontan rekombination begivenhed i hele dyret [43], eller efter KRAS sporadisk aktivering via Cre-lox medieret somatisk rekombination efter adenoviral medieret levering af Cre-rekombinase i lunge epitel [39]. Begge modeller muliggøre udviklingen af ​​KRAS-muterede lungekræft i en kort periode. Men disse modeller begrænset af deres afstand til kliniske situation, som mutationer af en eller to onkogener eller tumorsuppressorgener er langt fra den flertrinsproces progression af lungekræft forekommer på underliggende kronisk inflammation. Desuden GEMM modeller resulterer i hundredvis af primær NSCLC i samme periode de er vanskelige at følge og at kvantificere under præklinisk afprøvning og ikke-invasiv billeddannelse. På trods af disse ulemper, GEMM har den fordel at gøre definitionen af ​​onkogener og tage immunrespons i betragtning. Nylige undersøgelser har rapporteret, at GEMM kan være af interesse, når man studerer virkningen af ​​fælles NSCLC behandlinger [44].

Kirurgisk implantation af NSCLC fragment i lungen af ​​immunsvækkede mus via torakotomi blev først rapporteret i 1992 [21], [45], [46].