PLoS ONE: Genomisk profilering Submukøs-Invasiv mavekræft ved Array-Based Comparative Genomic Hybridization

Abstrakt

Genomisk kopi nummer afvigelser (CNA’er) i gastrisk cancer er allerede blevet grundigt karakteriseret ved matrix komparativ genomisk hybridisering (array CGH) analyse. Imidlertid stadig dårligt forstået inddragelse af genomiske CNA’erne i processen submukøst invasion og lymfeknudemetastaser i tidlig gastrisk cancer. I denne undersøgelse, at løse dette problem, vi samlet alt 59 tumorprøver fra 27 patienter med submukøse-invasiv gastrisk kræft (SMGC), analyserede deres genomiske profiler med vifte CGH, og sammenlignet dem mellem parrede prøver af slimhinden (MU) og submukøse (SM) invasion (23 par) og SM invasion og lymfeknude (LN) metastase (9 par). I første omgang, vi hypotese, at erhvervelse af specifikke CNA (er) er vigtigt for disse processer. Men observerede vi ingen signifikant forskel i antallet af genomiske CNA’erne mellem parret MU og SM, og mellem parret SM og LN. Desuden kunne vi ikke finde nogen CNAs specifikt forbundet med SM invasion eller LN metastaser. Blandt de 23 analyserede sager, 15 havde nogle lignende mønster af genomisk profilering mellem SM og MU. Interessant, 13 af de 15 sager viste også nogle forskelle i genomiske profiler. Disse resultater antyder, at størstedelen af ​​SMGCS er sammensat af heterogene subpopulationer afledt fra den samme klonal oprindelse. Sammenligning af genomiske CNA’erne mellem SMGCS med og uden LN metastaser afslørede, at gevinst på 11q13, 11q14, 11q22, 14q32 og forstærkning af 17q21 var hyppigere i metastatiske SMGCS, hvilket tyder på, at disse CNAs er relateret til LN metastaser af tidlig mavekræft. Som konklusion vore data antyder, at dannelsen af ​​genetisk forskellige subkloner, snarere end erhvervelse af specifikke CNA på MU, er en integreret del af processen submukøst invasion, og at subkloner, der erhverver gevinst på 11q13, 11q14, 11q22, 14q32 eller amplifikation af 17q21 er forventes at blive metastatisk

Henvisning:. Kuroda A, Tsukamoto Y, Nguyen LT, Noguchi T, Takeuchi i, Uchida M, et al. (2011) Genomisk Profilering af submukøst-invasiv mavekræft ved Array-Based Comparative Genomic Hybridisering. PLoS ONE 6 (7): e22313. doi: 10,1371 /journal.pone.0022313

Redaktør: Giuseppe Novelli, Tor Vergata-universitetet i Rom, Italien

Modtaget: Februar 25, 2011; Accepteret: 19. juni 2011; Udgivet: 21 Jul 2011

Copyright: © 2011 Kuroda et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev delvist understøttet af Ministeriet for uddannelse, videnskab, sport og kultur i Japan, og Grants-in-Aid for Unge Forskere (B), nr 20.790.286 (https://www.mext.go.jp), og den Forskning Fund ved skøn formand, Oita University (https://www.oita-u.ac.jp/english/index.html). Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er stadig en af ​​de mest dødelige sygdomme, trods sin støt faldende tendens i hele verden. Samlet set er dødeligheden på grund af mavekræft skønnes at være 700.000 tilfælde årligt (10,4% af alle kræftrelaterede dødsfald), ranking 2nd først efter lungekræft [1]. Kliniske resultater er bedre, når tumorcellerne er begrænset til slimhinden. Men når tumorcellerne passere gennem muscularis mucosa, det kliniske resultat bliver værre, da risikoen for lymfeknudemetastase, som er en af ​​de vigtigste prognostiske faktorer i gastrisk cancer, øger til 18% eller mere, sammenlignet med mindre end 4%, når tumorcellerne begrænses til slimhinden [2], [3]. Derfor er en bedre forståelse af de involverede i processen med submukøse invasion mekanismer påkrævet.

Det er i øjeblikket anerkendt, at flertrins ophobning af genetiske abnormiteter er ansvarlig for debut og progression af forskellige kræftformer [4]. Faktisk er det blevet rapporteret, at det samlede antal af genomiske aberrationer stiger med tumorprogression i forskellige typer af tumorer [5]. Vi fandt også, at frekvenserne af gevinster på 20Q, 20p12, 1q42, 3q27 og 13q34 og tab på 4q34-qter, 4p15, 9p21, 16q22, 18q21 og 3p14, som var blevet hyppigt påvist i gastrisk kræft, var hyppigere i AGC end i EGC [6]. I mellemtiden er det for nylig blevet rapporteret, at i løbet af tumorprogression, en enkelt tumorcelle for oprindelse udvikler sig til flere genetisk forskellige subpopulationer gennem købet af en lang række genomiske aberrationer. Den resulterende tumormasse, som er sammensat af genetisk heterogene subpopulationer, anses for at blive resistente over for en række forskellige udvalg tryk miljømæssige [7], [8], [9], [10].

Array-baseret komparativ genomisk hybridisering (array CGH) indeholder oplysninger om genomiske kopi nummer afvigelser (CNA’er) på tværs af hele genomet [11]. Desuden CGH gælder også for studiet af intratumoral genomisk heterogenitet [12], [13], [14], [15]. Selv om flere grupper har brugt vifte CGH til at identificere områder huser onkogene eller tumor-undertrykkende gener i gastrisk kræft [6], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22 ], [23], [24], [25], CNAs relateret til submukøst invasion og den tidlige fase af lymfeknudemetastase er endnu ikke bestemt. Da de fleste tidligere undersøgelser af CNAs i mavekræft har analyseret én prøve for hver tumor, har detaljer af heterogenitet af genomiske profiler inden for en enkelt mavekræft stort set uklar.

I denne undersøgelse undersøgte vi inddragelse af genomiske CNA’erne i processen submukøst invasion og lymfeknudemetastaser i tidlig gastrisk cancer. Til dette formål har vi samlet tumorprøver fra forskellige dele af den samme tumor separat, analyserede deres genomiske profiles som matrix CGH, og sammenlignet de genomiske profiler mellem parrede prøver af mucosal (MU) og submukøse (SM) portioner og SM del og lymfe node (LN) metastase. Desuden ved at sammenligne CNA’er mellem metastatisk og ikke-metastatiske submukøse-invasiv gastrisk kræft (SMGC) identificerede vi, at kandidaten CNA’er relateret til LN metastaser af tidlig mavekræft.

Materialer og metoder

etik Statement

Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i Oita Universitetshospital (Godkendelse P-05-04). Informeret skriftligt samtykke blev opnået fra alle patienter og /eller deres familier.

Patienter, prøver og udvinding af genomisk DNA væv

Tyve syv SMGCS blev kirurgisk resektion ved Oita Universitetshospital. Vævssnit blev skåret fra formalinfikseret, paraffinindlejret væv, og farvet med hematoxylin-eosin (HE) til histologisk analyse og med toluidinblåt (Wako, Osaka, Japan) til ekstraktion af genomisk DNA (figur 1A). Ved hjælp af laser-capture mikrodissektion, vi hentet 1 til 3 prøver fra MU, SM og /eller metastatisk LN del af samme SMGC væv separat. Som følge heraf har vi kunnet opnå i alt 59 prøver fra 27 patienter (tabel 1). Alle prøver indeholdt en andel af tumorceller over 70% af totalen. Genomisk DNA blev ekstraheret i henhold til standarden proteinase K-fordøjelse metode efterfulgt af phenol /chloroform ekstraktion. Ikke-neoplastisk gastriske væv fra de samme patienter blev anvendt som en normal kontrol.

(A) HE (a, c og e) og toluidinblåt (b, d og f) farvning af kasse 18 i lav- (a og b) og høj (c, d, e og f) magt synspunkter. Vævssnit efter mikrodissektion er vist i (d) og (f). (B) Oversigt over den eksperimentelle design. Først blev genomiske profiler af 23 MU prøver (a) sammenlignet med de parrede 23 SM prøver (b). Derefter blev de genomiske profiler af 9 SM prøver (c) sammenlignet med dem af de tilsvarende parrede 9 LN prøver (d). Endelig blev genomiske profiler sammenlignet mellem SM af 12 tilfælde med LN metastase (e) og SM 15 sager uden metastase (f). De enkelte prøver af (a) – (b) er angivet med hævet skrift i tabel 1.

Array CGH og dataanalyse

Array-CGH-analyse blev udført ved hjælp af 44 K-oligonukleotid CGH arrays (Agilent Technologies Inc., Palo Alto, CA). Mærkning og hybridisering blev udført i overensstemmelse med den protokol, som Agilent Technologies Inc. Kort fortalt 0,85-2 ug tumor-DNA og et tilsvarende beløb af kontrol-DNA blev fordøjet med Alu I og Rsal (Promega, Madison, WI, USA) i 24 timer ved 37 ° C. Det fordøjede tumor og kontrol DNA blev mærket med Cy5-dUTP og Cy3-dUTP, henholdsvis anvendelse af et genomisk DNA Labeling Kit Plus (Agilent), oprenset med Microcon YM-30 filtre (Millipore, Billerica, MA, USA) og koncentreret 80,5 pi. Ens mængder af tumor og kontrol-DNA’er blev efterfølgende samlet og blandet med humant Cot-1-DNA, opløst i hybridiseringspuffer (Agilent Oligo aCGH Hybridisering Kit; Agilent Technologies), denatureret og hybridiseret til CGH arrayet ved 65 ° C i 24 timer. Objektglas blev vasket og derefter scannet i overensstemmelse med producentens anvisninger. Salg

Microarray billeder blev analyseret under anvendelse feature extraction v.9.5.3.1 (Agilent Technologies) med lineær normalisering (protokol CGH-v4_95_Feb07), og de resulterende data blev importeret i DNA Analytics v.4.0.81 (Agilent Technologies). Efter normalisering af rådata blev log2ratio af Cy5 (tumor) til Cy3 (Control) beregnet. Afvigende regioner blev bestemt ved ADM-2 algoritme ved en tærskel på 8,0. For at detektere gevinster og tab, vi har sat værdierne af parametrene for aberration filtre som: mindste antal sonder i region 2, minimum absolut gennemsnitlige log2ratio for region 0,26, maksimalt antal afvigende regioner 10000, og procentdelen penetrans pr funktionen 0. Tilsvarende vil opdage opformeringer og sletninger, vi satte værdierne af parametrene for aberration filtre som: mindste antal sonder i region 2, minimum absolut gennemsnitlige log2ratio for område 1.0, maksimalt antal afvigende regioner 10000, og procentdelen penetrans pr funktionen 0. data genereret af sonder kortlagt til X- og Y-kromosomer blev elimineret. Genomiske positioner af prober og afvigende regioner var baseret på UCSC marts 2006 humane referencesekvens (hg18) (NCBI bygge 36 referencesekvens). Alle data er MIAME kompatibel (https://www.mged.org/Workgroups/MIAME/miame.html) og de rå data er blevet deponeret i MIAME-kompatibel GEO database (http: //www.ncbi.nlm.nih .gov /geo /, tiltrædelse nummer GSE26800). En oversigt over det eksperimentelle design er vist i figur 1B. Til sammenligning af CNAs mellem parrede MU og SM portioner, valgte vi 23 sager fra de i alt 27 (figur 1B, a og b), da de genomiske profiler af begge dele i disse sager var blevet analyseret med succes. Tilsvarende for sammenligning af CNAs mellem parrede SM og LN portioner, valgte vi 9 af de 12 sager med en LN del (figur 1B, c og d). Endvidere sammenlignede vi frekvenser af CNAs mellem tilfældene med og uden LN metastase (figur 1B, e og f).

Immunhistokemi

Immunhistokemi blev udført som tidligere beskrevet [21] ved brug af anti- EGFR (1:100, Dako, Glostrup, Danmark), anti-CTTN (1:200; Abcam, Cambridge, MA, USA) og anti-ErbB2 (1:800; cellesignalering Technology, Berverly, MA, USA) antistoffer.

Statistisk analyse

parret t-test og Fishers eksakte test blev anvendt. Forskelle på

P

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Genomisk klonalitet og heterogenitet i slimhinder og submukøse dele af SMGC

For at undersøge inddragelse af genomiske CNA’erne i processen submukøst invasion, vi først sammenlignet antallet af CNA’er mellem parrede MU og SM prøver fra de 23 SMGCS (figur 2A). Elleve af de 23 tilfælde viste en øget antal CNA’erne i SM delen i forhold til MU portion 11 viste en nedsat antal, og de resterende ét tilfælde viste ingen ændring (figur 2A). Som følge heraf var der ingen statistisk signifikant forskel i antallet af CNA’er mellem parrede MU og SM portioner (figur 2A, ikke signifikant i parret t-test). Desuden at identificere CNAs specifikt forbundet med submucosa invasion, vi sammenlignet de gennemsnitlige hyppighed af CNAs i MU del med dem i den parrede SM del (figur 2B), men var ude af stand til at finde nogen.

(A) sammenligning af antallet af CNA’er i MU og SM portioner. Til denne analyse blev prøverne angivet ved “a” og “b” i tabel 1 anvendes. (B) Genome-wide frekvenser af CNAs i MU og de tilsvarende parrede SM i 23 tilfælde. Vandrette linjer: oligonukleotidprober er vist i rækkefølge fra kromosom 1 til 22. Inden for hver kromosom, er kloner vist i rækkefølge fra p telomer til q telomer. Lodrette linjer: frekvens (%) af gevinster (positive akse) og tab (negativ akse) er vist for hver probe. (C-F) Repræsentant genomisk profil MU og SM portioner SMGC. Hele genomiske profiler af den parrede MU (ovenfor) og SM (nedenfor) portioner fra case 4 er vist i (C). Detaljerede genomiske profiler af Chr9, Chr7 og CHR11 er vist i (D), (E) og (F) hhv. Vandrette linier over midten repræsenterer regioner af gain, og dem under midten repræsenterer regioner af tab. Både MU og SM viser lignende genomiske mønstre i kromosom 9p (D). Men amplifikation af 7p12, hvor EGFR-genet er placeret, detekteres kun i MU del (E), og forstærkningen af ​​11q13, hvor CTTN genet er lokaliseret, detekteres kun i SM del (F).

for at undersøge forskellen på CNA’er mellem MU og SM fra samme tumor, vi sammenlignet de genomiske profiler af parrede MU og SM i hvert enkelt tilfælde. En repræsentativ tilfælde er vist i figur 2C, D, E og F. Den parrede MU og SM prøver delte et lignende mønster af genomisk aberration i kromosom 9p (figur 2D). Der var imidlertid tydelige genomiske afvigelser i kromosomer 7P og 11 i samme sag, som vist i figur 2E og F. Amplifikation af 7p12 blev kun observeret i MU, men ikke i SM (fig 2E), og blev observeret gevinst på kromosom 11 kun i SM, men ikke i MU (figur 2F). Disse resultater antydede, at tumorceller i MU og SM af denne sag var klonbeslægtede, men består af genetisk heterogene subpopulationer.

Dernæst at bestemme, om tumorcellerne viser forstærkning af 7p12 og dem viser gevinst på 11q13 af tilfælde 4 blev virkelig begrænset til MU og SM henholdsvis analyserede vi vævssnit fra case 4 ved immunhistokemi med antistoffer mod EGFR, som blev amplificeret kun i MU del (fig 2E), og CTTN, som først blev opnået i SM del (Figur 2F). Som vist i figur 3, blev positive immunreaktivitet for EGFR begrænset til MU del (figur 3D, E og F), mens kun SM portion udviste kraftig immunreaktivitet for CTTN (figur 3G, H og I). Disse resultater antydede, at i tilfælde 4, tumorcellerne med 7 p amplifikation i MU kunne ikke har invaderet SM, mens personer med kromosom 11 gain måske har invaderet SM.

HE farvning (A-C), og immunohistokemi med antistoffer mod EGFR (D-F) og CTTN (G-i) er vist i lav- (A, D og G) og høj (B, C, E, F, H og i) power synspunkter. EGFR, som blev amplificeret kun i MU del (se figur 2E), er stærkt positiv kun i MU del (D, E og F). I mellemtiden udtryk for CTTN, som blev vundet kun i SM (se figur 2F), viser højere positivitet i SM end i MU (G, H og I).

Dernæst analyserede vi genomisk klonalitet og heterogenitet i MU og SM andre sager. Blandt de øvrige 22 sager, 14 viste et lignende mønster af genomisk aberration i MU og SM (Tal S1 (6 tilfælde) og S2 (8 tilfælde)), hvilket tyder på, at kræftceller i MU og SM af disse tilfælde var klonbeslægtede . Interessant, 12 af de 14 tilfælde viste en signifikant forskel i de genomiske profil mønstre mellem MU og SM (Tal S1 (6 tilfælde) og S2 (6 tilfælde)), hvilket tyder på, at disse sager også var sammensat af genetisk heterogene subpopulationer.

Genomisk klonalitet og ujævnheder i primær (SM) og metastatisk (LN) portioner SMGC

Dernæst at undersøge inddragelsen af ​​CNA’er i processen med lymfeknudemetastase af tidlig mavekræft, sammenlignede vi antallet af CNA’er mellem parrede primær (SM) og metastatisk (LN) portioner af 9 SMGCS (figur 4A). Tre af de 9 tilfælde viste en øget antal CNA’erne i LN portion, hvorimod de resterende 6 tilfælde viste et fald (figur 4A). Som følge heraf var der ingen signifikant forskel i antallet af CNA’er mellem de parrede SM og LN portioner (figur 4A, ikke signifikant i parret t-test). Desuden at identificere CNAs specifikt forbundet med LN metastase, vi sammenlignet de gennemsnitlige hyppighed af CNAs i SM med dem i den parrede LN del (figur 4B), men var ude af stand til at finde nogen.

(A) Sammenligning af antallet af CNA’er i SM og LN portioner. Til denne analyse blev prøverne er angivet med »c« og »d« i tabel 1 anvendes. (B) Genome-wide frekvenser af CNAs i SM og den tilsvarende parrede LN i 9 tilfælde. Vandrette linjer: oligonukleotidprober er vist i rækkefølge fra kromosom 1 til 22. Inden for hver kromosom, er kloner vist i rækkefølge fra p telomer til q telomer. Lodrette linjer: frekvens (%) af gevinster (positive akse) og tab (negativ akse) er vist for hver probe. (C, D og E) repræsentant genomisk profil af SM og LN portioner SMGC. Hele genomiske profiler af parrede SM (ovenfor) og LN (nedenfor) portioner fra tilfælde 9 er vist i (C). Detaljerede genomiske profiler af CHR8 og Chr14 er vist i (D) og (E), henholdsvis. Vandrette linier over midten repræsenterer regioner af gain, og dem under midten repræsenterer regioner af tab. Både SM og LN viser lignende genomiske mønstre i kromosom 8 (D). Imidlertid er gevinst på kromosom 14q opdaget kun i SM del (E).

For at undersøge forskellen på CNA’er mellem SM og LN af samme tumor, vi sammenlignet de genomiske profiler af parrede SM og LN prøver i hvert tilfælde. En repræsentativ tilfælde er vist i figur 4C, D og E. Den parrede SM og LN prøver delte et lignende mønster af genomisk aberration i kromosom 8 (figur 4D), hvilket antyder, at begge dele blev afledt fra den samme klonal oprindelse. Imidlertid gevinst på kromosom 14 blev kun observeret i SM, men ikke i LN (Figur 4E). Disse resultater antydede, at tumorcellerne i SM og LN dele af denne sag var klonbeslægtede, men består af genetisk heterogene subpopulationer.

Vi analyserede også genomisk klonalitet og heterogenitet i SM og LN dele fra andre sager. Blandt de øvrige 8 tilfælde, 5 viste et lignende mønster af genomisk aberration i både SM og LN (fig S3), hvilket antyder, at de parrede SM og LN portioner fra disse tilfælde var klonbeslægtede. Endvidere 4 af de 5 tilfælde viste en signifikant forskel i de genomiske profil mønstre mellem SM og LN (fig S3), hvilket antyder, at disse tilfælde også var sammensat af genetisk heterogene subpopulationer.

Sammenligning af genomiske profiler mellem metastatiske og ikke-metastatisk SMGC

da ingen statistisk signifikante forskelle blev påvist i frekvenserne af CNAs mellem parrede SM og LN dele (figur 4B), vi den hypotese, at subpopulationer bærer metastase-relaterede CNAs kan være til stede i SM samt som LN delen af ​​metastatisk SMGC. Derfor vi næste sammenlignet hyppigheden af ​​CNAs i SM delen af ​​metastatiske SMGCS (12 tilfælde) med de ikke-metastatiske SMGCS (15 tilfælde), og fandt, at gevinster på 11q13, 11q14, 11q22 og 14q32 blev fundet oftere i metastatisk SMGCS end i ikke-metastatiske SMGCS (figur 5A og tabel 2). Vi sammenlignede også frekvenserne af højt niveau kopital aberrationer, såsom amplifikation og deletion, mellem de to grupper, og fundet, at amplifikation af 17q21 blev detekteret hyppigere i metastatiske SMGCS end i ikke-metastatiske SMGCS (tabel 3 og tabel S1) . Disse resultater antydede, at gevinster på 11q13, 11q14, 11q22, 14q32 og forstærkning ved 17q21 er involveret i LN metastase af SMGCS.

(A) Frekvens (%) af gevinster (positive akse) og tab (negativ akse ) i 12 SMGCS med lymfeknudemetastaser (LN (+) 12 tilfælde) og 15 SMGCS uden lymfeknudemetastaser (LN (-) 15 sager) er vist. Til denne analyse blev prøverne er angivet med “e” og “f” i tabel 1 anvendes. (B) Immunhistokemi med anti-ErbB2-antistoffet. Primær SM (a, b og c) dele er immunfarvet med antistoffet mod ERBB2. Sager med forstærkning på 17q21 viste stærk immunoreaktivitet for ERBB2 (a og b), mens tilfælde uden sådan forstærkning ikke gjorde (c). Vejviser

Den minimale fælles region af forstærkning på 17q21 indeholdt 5 gener, der er anført i tabel 3. Da ERBB2, en velkendt onkogen [26], [27], [28], blev optaget på listen, vi udført immunhistokemisk analyse af ERBB2 overekspression i alle 27 tilfælde. Som vist i figur 5B, tilfælde med 17q21 forstærkning udstillet stærk farvning for ERBB2 i SM, mens et tilfælde uden forstærkning ikke gjorde. Endvidere blev ERBB2 overekspression signifikant associeret med 17q21 forstærkning (tabel 4), tyder på, at ERBB2 forstærkning og overekspression kan være involveret i LN metastase af en del af SMGCS.

Diskussion

det er almindeligt accepteret, at en tumor består i en enkelt celle. Men hvordan det udvikler sig til et fremskredent stadium stadig debatteres. Tidlige studier af kolorektal og pancreascancer førte til en forestilling om, at udviklingen og progressionen af ​​disse kræftformer er forbundet med ophobning af kromosomafvigelser, benævnt flertrins tumorgenese model [29], [30]. For eksempel er genomiske aberrationer af APC, KRAS, Smad4 og TP53 gener involveret i adenom-carcinom-sekvensen i colon [29]. Men sådanne undersøgelser fokuseret på kun en del af tumor-relaterede gener, og forsømt rolle fleste andre gener. Desuden er denne model ikke var i stand til at vurdere betydningen af ​​intratumoral genomisk heterogenitet for tumor udvikling og progression. I mellemtiden har de seneste undersøgelser førte til oprettelsen af ​​en anden model, benævnt klonal evolution model [7], [9], [10]. I denne model en enkelt klon udvikler sig til flere forskellige subpopulationer gennem akkumulering af forskellige genetiske abnormiteter. Den fremherskende population kan erstattes af særskilte subpopulationer i en enkelt tumormasse gennem virkningerne af selektionstryk miljø- og /eller den fase af tumorprogression. Som følge heraf kan flere genetisk heterogene cellepopulationer sameksistere i en enkelt tumormasse. Bevis for intratumoral genetisk heterogenitet forbundet med klonal evolution er blevet opnået for en række solide tumorer, herunder prostatacancer [14], Barretts øsofagus [31], ovariecancer [32], [33], livmoderhalskræft [34], brystcancer [15], [35], neuroblastom [36], pancreascancer [13], [37], og kolorektal cancer [38]. Interessant, i en undersøgelse af dødbringende metastatisk prostatacancer, ingen CNAs specifikt relateret til stedet for metastaser blev fundet [14]. Tilsvarende i en undersøgelse af høj kvalitet serøs ovariecarcinom, var der ingen evidens for en sammenhæng mellem erhvervelsen af ​​cisplatin modstand og specifikke CNAs [39]. Disse resultater antyder, at flertrins tumorigenese model, hvor specifikke aberrationer spiller vigtige roller i tumorudvikling og progression, ikke altid repræsenterer den måde, hvorpå tumorer erhverver deres maligne karakter. I den foreliggende undersøgelse, vi oprindeligt antaget, at erhvervelse af specifikke CNA (er) kan være vigtig for submukøs invasion. Men vi kunne ikke finde nogen CNAs, der var hyppigere i SM end i den parrede MU prøven. Desuden har vi også observeret nogen signifikant forskel med hensyn til antallet af CNA’erne i de parrede MU og SM portioner. Vi fandt imidlertid, at størstedelen af ​​SMGCS var sammensat af klonalt-relaterede, men genetisk distinkte subpopulationer, hvilket antyder, at klonal evolution kan forekomme under forløbet af gastrisk cancer. Tilsammen selv om antallet af undersøgte sager var begrænset, vores resultater antydede, at generering af genetisk forskellige subpopulationer snarere end erhvervelse af specifikke CNA’erne i MU del kan være vigtig for processen submukøst invasion. På grundlag af disse resultater, foreslår vi en hypotetisk model for processen med SM invasion og LN metastase af tidlig gastrisk cancer (figur 6). For at bekræfte denne hypotese, vil yderligere undersøgelser med større prøver være påkrævet.

Den vandrette linie i midten af ​​figuren angiver muscularis mucosa. Grå cirkler indikerer tumorceller. Farvede små cirkler indikerer genomiske afvigelser. Gastriske tumorer opstår fra en enkelt celle med en (eller få) genomisk aberration (a). Den enkelt klon breder derefter mere effektivt end dets naboer (b). Under processen med proliferation i maveslimhinden, nogle tumorceller erhverve nye mutationer tilfældigt. Efterfølgende hver af genetisk forskellige subkloner danner en unik undergruppe (c og d). Blandt disse subpopulationer, kan kun én (r) med kapacitet til invasionen passere gennem muscularis mucosa og formere sig under submucosa (d og d ‘). Vigtigt er det, kan andre kloner ikke invadere ind i submucosa (c), men kan proliferere og danne subpopulationer genetisk forskellige fra invasive én. Efter invasion, en (eller nogle få) subpopulation igen udvikler yderligere genetisk forskellige subpopulationer gennem klonal evolution (e og f), og en med kapaciteten for metastase kan sprede sig til lymfeknuder (F og F ‘). Således er den primære tumormasse bliver heterogen som følge af klonal evolution.

Vores data indikerer, at SMGCS er sammensat af genetisk heterogene subpopulationer er vigtige i forbindelse med mavekræft forskning og behandling, fordi tumor heterogenitet gør udviklingen af ​​effektive lægemidler vanskelig. Da genomiske CNAs have en indvirkning på genekspressionsprofiler i forskellige cancere [16], [21], [40], [41], [42], [43], er det muligt, at hver af de genetisk forskellige subpopulationer i en enkelt tumor kan variere i både biologisk adfærd og respons på lægemidler mod cancer, herunder molekylær målretning agenter. Cooke et al. har foreslået, at afklaring af forskellige genetiske subpopulationer inden for en enkelt tumor ville muliggøre en effektiv terapi ansætte en bestemt middel rettet mod en fælles genomisk afvigelse eller kombinerede agenter målrettet unikke genomiske afvigelser i hver af de forskellige subpopulationer [39]. Denne strategi kan også anvendes til behandling af mavekræft.

Blandt de 23 sager, vi analyserede, 15 viste en klonslægtskab mellem MU og SM portioner. Endvidere 13 af de sidstnævnte 15 tilfælde viste også forskelle i CNAs mellem de to regioner, hvilket tyder på, at klonal evolution ofte forekommer i den tidlige fase af gastrisk carcinogenese. Forholdet mellem de parrede MU og SM prøver i de øvrige 8 tilfælde uden fælles CNAs forblev uklart. kan blive foreslået to mulige forklaringer på dette. Den ene er, at tumorer i de parrede portioner, som ikke har fælles CNAs, udviklet uafhængigt. Den anden er, at de parrede dele delt andre typer af genetiske afvigelser, såsom mutationer og omplantning, som ikke kan påvises ved opstilling CGH. I sidstnævnte tilfælde kan næste generation sekventering være nyttig for vurdering af sådanne relationer.

I denne undersøgelse gevinster ved 11q13, 11q14, 11q22, og 14q32, og forstærkning på 17q21, var hyppigere i SM delen af metastatiske SMGCS end i de ikke-metastatiske SMGCS. Interessant, er gevinster på 11q13 og 14q32 angiveligt involveret i levermetastaser for tyktarmskræft [38]. Derfor er disse data, at forstærkningen ved 11q13 og 14q32 kan være involveret i metastasen af ​​gastrointestinale cancere. Kromosom 17q21 huser et potent onkogen, ERBB2. Foreningen af ​​ERBB2 udtryk med de klinisk-patologiske træk af mavekræft er blevet undersøgt i flere undersøgelser [44], [45], [46], [47], [48], [49]. Men indflydelsen af ​​ERBB2 overekspression på LN metastase forskelligt for disse undersøgelser [44], [46], [47]. I den foreliggende undersøgelse, trods det begrænsede antal SMGCS undersøgt alle af dem med ERBB2 amplifikation og overekspression viste lymfeknudemetastase. Yderligere undersøgelse med et større antal SMGCS vil være forpligtet til at vurdere betydningen af ​​denne tendens.

Støtte Information

Figur S1.

Sager viser både fælles og forskellige genomiske afvigelser mellem MU og SM portioner. De venstre paneler viser almindelige mønstre af genomiske aberrationer i MU og SM for hvert enkelt tilfælde. Centret og højre paneler viser forskellige mønstre af genomisk aberration mellem de to dele i hvert tilfælde

doi:. 10,1371 /journal.pone.0022313.s001

(TIF)

Figur S2.

Sager viser både fælles og forskellige genomiske afvigelser mellem MU og SM portioner. Fælles og forskellige mønstre af genomisk aberration mellem MU og SM for hver enkelt sag, er vist

doi:. 10,1371 /journal.pone.0022313.s002

(TIF)

Figur S3.

Sager viser både fælles og forskellige genomiske afvigelser mellem SM og LN portioner. De venstre paneler viser fælles mønstre af genomisk aberration mellem SM og LN for hvert enkelt tilfælde. Centret og højre paneler viser forskellige mønstre af genomisk aberration mellem de to dele i hvert tilfælde

doi:. 10,1371 /journal.pone.0022313.s003

(TIF)

tabel S1.

Tilbagevendende amplifikationer og deletioner i SMGCS.

doi:. 10,1371 /journal.pone.0022313.s004

(DOC)

Tak

Vi takker Misuzu Taguchi, Yoko Miyanari og Tsuyoshi Iwao for deres fremragende teknisk bistand