PLoS ONE: Forhøjet Tolerance til Aneuploidi i cancerceller: Estimering af Fitness Virkninger af kromosom nummer Ændringer af In Silico Modellering af somatiske Genome Evolution

Abstrakt

Et ubalanceret kromosomtal (aneuploidi) er til stede i de fleste maligne tumorer og er blevet tilskrevet mitotiske mis-segregering af kromosomer. Imidlertid har nyere undersøgelser vist en relativt høj kromosomal mis-segregation også i ikke-neoplastiske humane celler, mens frekvensen af ​​aneuploide celler fortsat lav gennem hele livet i de fleste normale væv. Dette indebærer, at nyligt dannede aneuploide celler er underlagt negativ selektion i sundt væv, og at dæmpning af dette valg kan bidrage til aneuploidi i cancer. For at teste dette, modelleret vi cellulær vækst som diskrete tid forgrening processer, hvorunder kromosom gevinster og tab blev genereret, og deres værtsceller udsat for udvælgelse pres af forskellige størrelser. Vi derefter vurderes eksperimentelt frekvensen af ​​kromosomale mis-segregation samt forekomsten af ​​aneuploide celler i humane ikke-neoplastiske celler og i cancerceller. Integrere disse data i vores modeller tillod estimering af fitness nedsættelse, der skyldes en enkelt kromosom kopiantal ændring til gennemsnitlig ≈30% i normale celler. Til sammenligning udviste cancerceller en gennemsnitlig fitness reduktion på kun 6% (p = 0,0008), der indikerer aneuploidi tolerance. Simuleringer baseret på den kombinerede forekomst af kromosomal mis-adskillelse og aneuploidi tolerance gengivet fordelinger af kromosomafvigelser i 400 kræfttilfælde med en højere kvalitet end modeller baseret på kromosomal mis-segregation alene. Reverse engineering af aneuploid kræftcelle udvikling

i silico

forudsagde, at aneuploidi intolerance er en stærkere begrænsende faktor for klonal udvidelse af aneuploide celler end kromosomal mis-segregation sats. Afslutningsvis vores resultater viser, at ikke kun en forhøjet kromosomale mis-segregation sats, men også en generaliseret tolerance hidtil ukendte kromosomale ubalancer bidrage til den genomiske landskab af humane tumorer

Henvisning:. Valind A, Jin Y, Gisselsson D (2013) Forhøjet Tolerance til Aneuploidi i cancerceller: Estimering af Fitness Virkninger af kromosom nummer Ændringer af

i Silico

Modelling of Somatic Genome Evolution. PLoS ONE 8 (7): e70445. doi: 10,1371 /journal.pone.0070445

Redaktør: Daniela Cimini, Virginia Tech, USA

Modtaget: Marts 21, 2013; Accepteret: 18 juni 2013; Udgivet: 24 Juli 2013

Copyright: © 2013 Valind et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Finansiering: Svensk Childhood Cancer Foundation, svensk Cancer Society, Svensk Forskningsråd, Gunnar Nilsson Cancer Foundation, og Biocare Strategisk forskning. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i det seneste årti har en række af molekylære mekanismer der forårsager genomiske ændringer i kræftceller blevet beskrevet. Strukturelle ændringer af kromosomer, såsom deletioner, duplikationer og genamplifikationer, ofte forårsaget af telomer dysfunktion eller andre udløsere af DNA dobbelt-strengbrud, efterfulgt af mitotiske brud-fusion-bridge cyklusser [1] – [3]. En ubalanceret antal hele kromosomer (antalsafvigelser; aneuploidi), på den anden side, er i vid udstrækning skyldes mitosespindelen defekt såsom merotelic vedhæftede kromosom [4], [5] eller spindel multipolaritet kombineret med cytokinetic svigt [6]. For nylig har det også vist sig, at kromosomer, der mis-Holdes adskilt kan beskadiget under cytokinese, hvilket fører til DNA dobbelt streng pauser og ubalancerede translokationer i datterceller, hvilket antyder en overlapning mellem de ruter, der fører til numeriske og strukturelle ændringer [7]. En forudsætning for etablering af komplekse strukturelle kromosomafvigelser er tolerance over for DNA dobbelt strengebrud, mest især inaktivering af p53-afhængige respons [1], [8]. Alt i alt synes en tolerance over for DNA-brud til at være en meget almindelig funktion i tumorceller sammenlignet med ikke-neoplastiske celler, hvilket tillader de mekanismer, der giver anledning til genomiske ændringer at etablere sig i tumorer og øge sandsynligheden for tumorigene mutationer at forekomme [9] .

et resterende spørgsmål er, om kræftcellerne også reagere på nye ændringer i kromosom nummer, såsom monosomier og trisomier, på en måde, der adskiller dem fra normale celler. Hvis det er tilfældet, kunne denne faktor være lige så vigtig som mitosespindelen defekter til generering af aneuploidi i kræft. Nogle indicier er blevet præsenteret for en øget tolerance over for nye kromosomafvigelser i kræftceller. Ikke neoplastiske humane celler er blevet vist at udvise en betydelig forøgelse af kromosom adskillelse fejl ved mitose [6]. Fordi forekomsten af ​​aneuploide celler imidlertid begrænset for de fleste somatiske celler over menneskets levetid, indikerer dette tilstedeværelsen af ​​en endogen negativ selektion tryk mod (reduceret egnethed) aneuploide celler i humane væv, som er blevet fundet i flere modelorganismer [10 ], [11]. Denne negative udvalg kan teoretisk blive reduceret i kræft til at tillade aneuploidi på en bred skala. At eukaryote celler kan faktisk udvikle en sådan tolerance mod aneuploidi er for nylig blevet rapporteret for en gær model-system, hvor aneuploidi-tolerere mutationer fandtes at påvirke mest fremtrædende ubiquitin-proteosomal nedbrydningsveje [12]. Tilsammen disse data tigge spørgsmålene (1) om en generel tolerance over for aneuploidi er til stede i humane cancerceller, (2), hvad størrelse ville en sådan tolerance har i kræftceller sammenlignet med normale celler, og (3) hvordan ville selektive kræfter handler på aneuploidi påvirke den genomiske landskab af tumorer?

til vores viden, få eventuelle eksperimenter har behandlet disse spørgsmål ved hjælp af primære humane celler med sammenligninger til humane cancerceller. En grund til dette er, at det er vanskeligt at kvantificere samtidigt kromosomal ustabilitet, aneuploidi og cellulær proliferation parametre i voksende humane celler. En alternativ fremgangsmåde er at omhyggeligt vurdere satserne for kromosomale mis-segregation samt nøjagtige forekomst af aneuploide celler i både cancer og normale cellepopulationer, efterfulgt af inkorporering af disse data til en robust computermodel af evolution på det cellulære niveau. Ved hjælp af en sådan beregningsmæssige tilgang, har vi undersøgt, om kræftcellerne har en højere tolerance over for nye hel-kromosom ændringer sammenlignet med ikke-neoplastiske celler og i hvilket omfang en sådan reduceret tolerance kunne forklare den globale mønster af kromosom ændringer i neoplasi.

Resultater

Konstruktion Algoritmer til at anslå Virkningen af ​​aneuploidi på proliferativ Cell Survival

det vigtigste mål for den aktuelle undersøgelse var at vurdere konsekvenserne af aneuploidi på langsigtet cellulære overlevelse i en humane system, herunder både normale og cancerøse celler. For at opnå dette, konstruerede vi en algoritme, der simulerede væksten af ​​en flercellet population fra en enkelt celle som en diskret tid forgrening proces sammenhængende Mitoser, hver med en konstant sandsynlighed for kromosom adskillelse fejl (figur 1 og 2). Den vigtigste algoritme blev gennemført som software Chiron (figur S1, Protokol S1, Software S1 og S2), hvor følgende parametre kunne sættes vilkårligt: ​​(1) hyppigheden af ​​hele kromosom adskillelse fejl pr kromosom pr mitose; (2) indvirkningen på proliferative overlevelse enhver autosomal hel kromosomafvigelser (monosomi, trisomi, tetrasomy etc.), med undtagelse af nullisomy (0 kopier af et autosom). Komplet autosomal nullisomy blev uvægerligt anset dødelig, fordi denne type aberration observeres meget sjældent i levende humane celler. De negative konsekvenser af aneuploidi blev angivet af udvælgelsesparameter 0 ≤

s

≤ 1, i forhold til den gennemsnitlige proliferative overlevelse af normale diploide celler. Hvis

s =

0 for et bestemt kromosom aberration, så den proliferative overlevelse af en celle der bærer denne aberration (

dvs.

være aneusomic) ville være lig med den af ​​de omgivende diploide celler, simuleret som en lige stor sandsynlighed for at undergå en anden mitose. Hvis

s =

1, hvilket indebærer maksimal negativ udvælgelse, den aneuploide celle ville blive udelukket fra alle fremtidige mitotiske generationer. Værdier på

s

under 1, men større end 0 indebære en relativ reduktion af proliferativ overlevelse. F.eks

s

= 0,4 svarer til en 40% sandsynlighed for permanent forlader mitotiske cyklus inden næste celledeling, eftersom sandsynligheden for en anden mitose for diploide celler er 100%,

dvs.

en reduktion på 60% af proliferativ overlevelse.

Baseret på tidligere eksperimentelle data [6] mis-segregation blev simuleret som følge af søster-kromatid non-disjunktion resulterer i en monosomic og én trisomic datter celle (øverste panel) og kromatid halter resulterer i monosomi i en datter kerne (nederste panel). Hver af disse begivenheder var ca. i hyppighed, i alt resulterer i et gennemsnit på 75% aneuploid datterceller (rød og grøn baggrund) pr mis-segregation begivenhed.

Aneuploidi genereres ved en bestemt hastighed (

s

) af mitotiske mis-segregation, hvor trisomic (røde cirkler) og monosomic celler (grønne cirkler) har visse probabilites (

s

t og

s

m henholdsvis) permanent proliferativ anholdelse /død (sorte vandrette bjælker) ved hver mitotiske cyklus. To eller flere aneusomies vil resultere i øgede sandsynligheder for anholdelse /død som eksemplificeret ved celler mærket ++ og + -.

For at overvåge de iboende egenskaber af denne model, vi uropført simuleringer med en sats på mitotiske adskillelse fejl fastgjort til størrelsesorden findes i ikke-neoplastiske humane celler. I en tidligere undersøgelse [6], rapporterede vi en median mis-segregation på 4 × 10

-4 /kromosom /mitose (interval 3,3-4,1 × 10

-4) i primære humane lav passage fibroblastceller , med et 02:01 forhold mellem symmetrisk nondisjunction af kromatider og kromatid halter (figur 1). Denne mis-segregation sats var ens i størrelse til tidligere rapporterede for ikke-neoplastiske immortaliserede humane cellelinier, der stammer fra føtale eller postnatal fibroblaster og /eller epithel [4], [13], [14]. Ved hjælp af en konstant mis-segregation på 4 × 10

-4 /kromosom /mitose, forekomsten af ​​aneusomic celler blev undersøgt som en funktion af forskellige grader af negativ selektion mod aneusomy for enhver kromosom i en celle population ekspanderet i 500 generationer . Som forventet, forekomsten af ​​celler med aneusomy var omvendt proportional med graden af ​​negativ udvælgelse. Efter cirka 25 generationer simuleringer med

s

≥ 10% nåede et plateau, hvilket indikerer, at en tilstand af dynamisk ligevægt var blevet indgået mellem generation af aneusomic celler og deres afskaffelse af negativ selektion (figur 3A). Fordi 25 post-zygotiske generationer vil generere højst 3,36 × 10

7-celler (ikke medregnet celledød og dannelse af ekstra-embryonale væv), som igen svarer til en fast biomasse i området fra kun 18 til 140 pi ( under forudsætning af en celle diameter vifte af 10-100 um), kan antages dynamisk ligevægt at have fremlagt godt før fødslen for udvælgelse niveauer ≥ 10%. Dermed for en somatisk celle afstamning med et nogenlunde konstant niveau af kromosom mis-segregation, hyppighed af aneusomic celler kan anvendes til at estimere graden af ​​aneusomy-afhængige negativ selektion for en bestemt kromosom medmindre dette valg værdi er meget lille (figur 3B ).

(a) Chiron-baserede simulering (20 parallelle kørsler) af en voksende celle population med en mis-segregation på 4 × 10

-4 hvor forskellige grader af selektion (

s

) mod pålægges aneuploide celler. De resulterende gennemsnitlige prævalens værdier af celler aneusomic (ikke-disomic) i en vis kromosom er givet som aneusomy indeks (AI) på y-aksen. AI reduceres med højere

s

værdier og når en dynamisk ligevægt omkring 25 generationer, selv ved udvælgelse værdier så lave som 10%. (B) Forbindelser af gennemsnitlig AI i en vis kromosom og negativ selektion virker på celler med aneusomy for dette kromosom. Røde linjer svarer til skøn over udvælgelsen fremstillet af eksperimentelle data for kromosom 1 og 17 i F1 og F2. Fejlsøjler svarer til standardafvigelser i 20 simuleringer. (C) Fluorescens

in situ

hybridisering (FISH) blev anvendt til at estimere AI i humane normale fibroblaster, eksemplificeret ved F1-celler disomic (2n) og trisomic (3n) hvor kromosom 17 (rød, q arm probe signal; blå, centromere signal). (D) Udbredelsen af ​​monosomic og trisomic celler samt den samlede AI anslået af FISH i de to fibroblast linjer F1 og F2. (E) Chiron-baserede skøn over graden af ​​negativ udvælgelse handler på celler aneusomic for kromosomer 2 og 17 i F1 og F2, udledes ved at sammenligne FISH-data (AI) med modellering af AI som en funktion af

s

(figur 3B). Max og min værdier svarer til ± 2 standardafvigelser.

Estimering aneuploidi Niveauer og Aneuploidi Tolerance i normale celler

For at estimere graden af ​​nedsat fitness følge af autosomal aneusomy i almindelig post -Natal humane celler ved probabilistisk modellering, vi derefter fastsat forekomsten af ​​aneusomic celler i fibroblast befolkninger fra to præpuberteten individer (F1 og F2), hvor mis-segregation satser havde tidligere været anslået [6]. Tidligere undersøgelser af aneuploidi prævalens i humane celler fra raske væv har vist meget forskellige resultater, selv inden for samme celletype [15] – [19]. Disse variationer kan til en vis grad tilskrives den relativt høje baggrund af falske positiver til den type analysemetode (fluorescens in situ hybridisering, FISH), når der anvendes en enkelt sonde til at vurdere et kromosom, hvortil aneusomy er kun til stede i et lille antal af celler. For at adskille det formentlig lave aneusomy i normale celler fra baggrunden forårsaget af uspecifik hybridisering, vi brugte to forskelligt mærkede FISH prober for hver undersøgt i F1 og F2 kromosom, målrettet centromeren og et kromosom arm hhv. Denne fremgangsmåde gjorde ikke blot identifikation af falske positiver på grund af cross-hybridisering af en enkelt sonde, men også subtraktion af baggrundsniveauet som følge af fejlagtig hybridisering af to forskelligt mærkede prober (dobbelt falske positiver, figur S2). For at kontrollere for potentielle forskelle i effekt mellem aneusomies til kromosomer med forskellig størrelse og gen-indhold [15], valgte vi kromosomer 2 (≈243 Mb; 10,496 udskrift linjeføringer) og 17 (≈81 Mb, 6.330 udskrift linjeføringer) som indeks kromosomer til evaluering ved interfase FISH (Figur 2C).

Skøn over forekomsten af ​​celler aneusomic for kromosomer 2 og 17 i F1 og F2 af denne fremgangsmåde resulterede i en gennemsnitlig forekomst af aneusomic celler på 1,5 × 10

-3 pr kromosompar efter baggrundssubtraktion (figur 2D). Dette svarede til en prævalens på aneuploide celler på ca. 3%, når ekstrapoleres til alle kromosomer (= 23 kromosompar). Der var ingen signifikant forskel i aneusomy prævalens mellem fibroblast populationer eller mellem de to indeks kromosomer. De observerede aneusomies var begrænset til monosomier og trisomier, hvor den tidligere var mindst to gange mere udbredt end de sidstnævnte. Dette var i overensstemmelse med tidligere undersøgelser [6] viser, at mitotiske mis-segregation i normale celler består hovedsageligt af søsterkromatid non-disjunktion (3-1 adskillelse) og kromatid halter (2-1 adskillelse), samlet resulterer i frembringelsen af ​​en relativt højere andel af monosomier end trisomier til en tilnærmet 2:01 ratio. Den dobbelte farve FISH tilgang resulterede i et betydeligt lavere forekomst skøn over aneusomy end tidligere single-probe FISH undersøgelser, som viser aneusomy satser på 1-20% pr kromosom par [16] – [19], hvilket indikerer, at vores tilgang reduceret antallet af falske positiver. Vores estimater var i samme størrelsesorden som tidlige undersøgelser udført af kromosom banding på lymfocytter og amniocyter [20]. For yderligere at validere vores tilgang, vi udførte cytogenetiske analyser på flere primære humane fibroblastkulturer herunder F1 og F2 (tabel S1 og S2), alle viser en aneusomy prævalens på ca. 1 × 10

-3. I modsætning hertil single-probe skøn over udbredelsen af ​​aneusomic celler i F1 og F2 i gennemsnit var ni gange højere. Tilsammen finder vi, at de fleste tidligere undersøgelser har givet overvurdering af forekomsten af ​​aneuploidi i ikke-neoplastiske humane celler, mens en dobbelt farve tilgang forudsat en mere robust vurdering.

Forekomsten af ​​aneusomies i F1 og F2 var derefter sammenlignet med Chiron-genererede data at udlede graden af ​​fitness reduktion /negativ selektion for monosomic og trisomic celler sammenlignet med diploide celler (figur 3B). Simulering monoklonalt ekspansion med en normal mis-segregation sats (4 × 10

-4), blev den negative selektion som følge af monosomi fundet at være i gennemsnit 28%, og at der fra trisomi 31%, med ingen signifikante forskelle mellem dem (Figur S3). Hverken var der nogen signifikante forskelle mellem de to indeks kromosomer. For at estimere den største mulige fejlmargen for disse beregninger, vi så også tog hensyn til (1) variabiliteten i skønnede fibroblast mis-segregation på 3,3-4,1 × 10

-4 og (2) den kendsgerning, at variationer eksisterede til indeks kromosomer. Dette resulterede i et spænd på negativ selektion på 19% til 50% (afspejler middelværdi ± 2 standardafvigelser). Den maksimale grad af negativ selektion i disse estimater var uvægerligt langt under 100%, hvilket indebærer, at fjernelsen af ​​aneuploide celler fra en voksende normal cellepopulation er typisk en proces tager flere mitotiske generationer. Fordi der var ingen signifikant forskel mellem trisomi og monosomi, vi estimeret den samlede negative selektion mod aneusomy hjælp Chiron, hvilket resulterer i et gennemsnit på 29% på en relativ skala (figur 3B, E). Det betyder, at i en stadigt voksende befolkning med 100% sandsynlighed for re-indtastning mitose for diploide celler, ville en nyligt genererede aneuploid celle en chance på omkring 49% for proliferativ overlevelse op til to generationer, men kun en 3% chance for overlevende op til 10 generationer.

humane cancerceller kan have øget tolerance over aneuploidi

for at gøre en lignende vurdering af graden af ​​cellulære fitness reduktion som følge af aneuploidi i kræftceller, brugte vi fire kræftcelle linjer (LoVo, DLD1 og SW480 stammer fra kolorektal cancer, CRC, WiT49 stammer fra Wilms tumor, WT), hvor vi havde tidligere anslået antallet af kromosom mis-segregation [6]. Mens DLD1 og WiT49 havde mis-segregation renter tæt på dem af fibroblaster, LoVo og SW480 viste en høj grad af mitotisk ustabilitet (tabel 1). Mens stemline af DLD1 var pseudo-diploid, de andre linjer udviste betydelig aneuploidi med en kopi nummer ≠ 2 for flere kromosomer i stemline [3], [21]. For at estimere forekomsten af ​​aneuploide celler i disse linjer, FISH analyser med baggrund subtraktion blev igen udført. Fordi vores mål var at studere løbende dannelse og fjernelse af aneusomies blev aneusomy indekset i cancer cellelinjer defineret som forekomsten af ​​celler med en ikke-modal kopi nummer for målet kromosomet [22]. For at kunne overvåge mulige forskelle i negativ selektion mellem celler skiftende antal kopier fra disomi og dem skiftende antal kopier fra en allerede eksisterende tilstand af stemline aneusomy blev sonder udvalgt til at dække kromosomer viser disomi, trisomi og tetrasomy i stemlines i de forskellige cellelinjer (tabel 1).

Som forventet, forekomsten af ​​celler med ikke-modale kromosom tal var betydeligt (≈10-300 gange) højere i kræftcellerne linjer med forhøjede kromosomale mis-segregation satser (LoVo og SW480) end i de tidligere undersøgte normale celler. Men også i cancer celle populationer med en tæt på normal mis-segregation sats (DLD1 og WiT49), forekomsten af ​​celler med ikke-modal kopiantal var mindst 10 gange højere end den gennemsnitlige værdi i fibroblaster (tabel 1). Dette gav indirekte bevis for dæmpning af aneuploidi-afhængige negativ selektion i cancerceller sammenlignet med normale humane celler. Men analysen ikke

per se

udbytte relative værdier af proliferativ overlevelse, der kunne sammenlignes mellem normale celler og cancerceller. At opnå dette, har vi indarbejdet det kromosomale mis-segregation for hver cellelinie i Chiron algoritme og anvendes med større intensitet af negativ selektion mod hidtil ukendte aneusomies på en måde svarende til analysen af ​​fibroblaster. Dette blev gjort under den antagelse, at forskellige kromosomer varierer lidt med hensyn til deres individuelle mis-segregation satser, hvilket er i overensstemmelse med tidligere data [4], [6]. Negativ selektion værdier for cancercellelinier blev estimeret for hvert kromosom, ved at tilpasse aneusomy niveau til et punkt af dynamisk ligevægt mellem mis-segregation og eliminering ved selektion (figur 4). Bortset WiT49 blev den dynamiske ligevægt nås, før 500 mitotiske generationer. Derfor ligevægtspunkterne fra 500 generationer blev brugt til estimering af negativ selektion. WiT49 nåede ikke ligevægt indtil ≈1800 generationer til negative udvælgelse værdier 0,5%, og derfor blev ligevægtspunkterne på 2000 generationer benyttes ved vurderingen af ​​negativ selektion. Et monoklonalt tumor celle population afledt fra et kontinuerligt regenererende stamceller befolkning kan estimeres til at have undergået mindst 2000 generationer før afsløring [23]. Således er det rimeligt at antage, at WiT49 celler, der repræsenterer en kontinuerlig sub-dyrkes etableret cellelinje, har gennemgået mindst 2000 generationer forud for de udførte her analyser.

(A-B) En dynamisk ligevægt med respekt til aneusomy indeks (AI) er nået før 500 generationer selv med meget lave negative udvalg tryk i kræft celle populationer med lav mis-segregation sats (eksemplificeret med 1% for DLD1 have en næsten normal mis-segregation sats). Begge grunde er fra enkelte simulering kørsler. (C-F) I alle fire analyserede kræft cellelinjer simuleringer forudsagt en nær-lineær negativ sammenhæng mellem anusomy indeks (AI) og graden af ​​negativ selektion (

s

) på en log-log skala. Fuld linjer angiver middelværdier AI værdier og brudte linjer minimum og maksimum værdier for hver simulering af AI for en vis

s

. Grå linjer svarer til simuleret AI for normale fibroblaster og grå cirkler angiver AI kvantificeret ved FISH for kromosomer 2 og 17 i fibroblaster. Farvede linjer svarer til simuleret AIs for kromosomer af forskellige modale numre og farvede cirkler de FISH-anslået AI-værdier for de analyserede kromosomer i kræft cellelinjer. Med undtagelse af en kromosom i LoVo, de negative selektionstryk virker på aneusomic celler er lavere i cancercellelinier. Den fulde data beregnet ud fra disse AI-

s

estimater er vist i tabel 1 og opsummeret i figur 5.

Vurdering af de negative udvælgelse pres mod nye aneusomic celler i kræftcellen populationer afslørede, at LoVo udviste en større interchromosomal variation i aneuploidi tolerance end de andre tre cellelinjer, med en tendens til overlapning med normale celler (figur 4 og 5; tabel 1). De andre tre cancercellepopulationer udviste mindre diversitet med op til 30 gange lavere aneuploidi-afhængig negativ selektion end de normale celler. Taget sammen viste cancerceller en gennemsnitlig risiko for dødsfald /arrest fra en nyligt vedvarende aneusomy på kun 5,8% (p = 0,0008 sammenlignet med normale fibroblaster), der indikerer aneuploidi tolerance. Især var dette findes ikke kun i WiT49 og SW480, der massive stemline aneuploidi, men også i DLD1 med en pseudo-diploid stemline og aneuploidi kun til stede ved subclonal [3] niveau. Disse data viste, at intercellulære mangfoldighed i kromosom nummer i cancerceller afhænger ikke kun af en forhøjet mis-segregation på kromosomer, men også på en forhøjet tolerance over for nyerhvervede aberrationer.

Mean aneusomy-afhængige negativ selektion (

s

) anslås af Chiron-simuleringer. Den enkelt stjerne angiver p 0,05 og dobbelt stjerner p. 0,001 (Students

t

-test) ved sammenligning mellem hver kræft cellelinje og normale fibroblaster (F1 + F2)

kombineret mitotisk ustabilitet og aneuploidi tolerance Forudsige Scenario af aneuploidi i Human kræft

Vores resultater antydede, at numeriske kromosomforandringer i kræft kan skyldes en kombination af øget mitotisk fejlprocent og øget aneuploidi tolerance. I modsætning hertil har det store flertal af tidligere modeller af aneuploidi i kræft indarbejdet kun genomisk ustabilitet forårsaget af forhøjet mis-segregation sats [3], [4], [6], [7], [22]. For at teste, om vores kombinerede model forklarede den epidemiologiske scenario af kromosomafvigelser i kræft bedre end modeller baseret på kromosomal ustabilitet alene, analyserede vi udgivet distributioner af numeriske ændringer i tumortyper for der var blevet opnået vores eksperimentelle kræft data,

dvs.

. CRC og WT. Sådanne overordnede fordelinger af kromosomafvigelser har tidligere vist sig at være meget informative med hensyn til tidsmæssige mønstre af klonal evolution og deres underliggende mekanismer [24] – [27]

At udforske specifikt fordelingen af ​​antalsafvigelser i CRC. og WT, blev cytogenetiske data importeret fra Mitelman Database of kromosomafvigelser og Gene Fusions i Cancer (https://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman), bestående af 346 og 463 tilfælde med abnorme karyotyper hhv. Efter at bortfiltrere karyotyper med ufuldstændige eller tvetydige cytogenetisk information (markører, ring kromosomer, ufuldstændige karyotyper, og diploide tilfælde), der forblev karyotyper fra 151 CRC’er og 269 WTS. Afbildning af de relative frekvenser af tumor sager efter deres samlede antal antalsafvigelser afslørede en yderst lignende log-lineær fordeling (figur 6A) for begge tumortyper, hvor forekomsten af ​​tilfælde med et vist antal aberrationer var omvendt proportional med antallet af afvigelser. Fordelingen var tydeligt adskiller sig fra de tidligere rapporterede samlede log-log forholdet aberrationer, herunder strukturelle ændringer [27]. Dette indikerer, at ingen af ​​de to teoretiske modeller foreslået før til akkumulering af kromosomafvigelser i kræft (multiplikativ udsving og fortrinsret tilknytning [27]) kan forklare mønsteret af antalsafvigelser /aneuploidi i CRC eller WT.

( a) rapporterede cytogenetiske data fra Mitelman Database of kromosomafvigelser og Gene Fusions i Cancer viser en log-lineær sammenhæng mellem den relative forekomst og antallet af antalsafvigelser pr tumor (Nnapt), med meget lignende fordelinger for Wilms tumor (WT) og colorectal cancer (CRC). (B) Modellering af et vist antal cancer stemlines opstår i det samme antal patienter. Hver stemline antages at stamme fra en diploid celle (med 0 antalsafvigelser) og får lov til at formere sig i højst 2.000 generationer (G), når den samlede fordeling af antalsafvigelser samples. Stemlines ophobes antalsafvigelser på et bestemt mis-adskillelse sats (

s

) og er underlagt aneuploidi-afhængige udvalg til en vis grad (

s

), hvilket igen kan resultere i opsigelse af den stemline (vandret dumbbell), svarende til afslutningen af ​​klonal ekspansion. Da dette kan resultere i regression af tumorigenese på et tidligt tidspunkt, var sager, hvor stemlines blev således afsluttet fjernet fra prøveudtagning. (C) Simuleret fordeling af tumor sager med et vist antal antalsafvigelser som tumor kohorte samples på generationer 1-2000 i en indstilling, hvor tumorer havnen en forhøjet mis-segregation sats i fravær af negative selektion mod aneuploide celler (se vigtigste tekst for detaljer). Dette vil resultere i en binomial-lignende fordeling allerede efter 100 generationer, den modale værdi stiger med tiden, i modsætning til den faktiske fordeling i humane tumorer (sammenlign til 6A).

På jagt efter andre forklaringsmodeller, vi oprettet en algoritme, der efterlignede den sideløbende udvikling i 500 tumor stemline karyotyper (kræft tilfælde) over 2000 generationer [23], hver starter med en normal diploid genom, hvortil forskellige betingelser for mitotisk ustabilitet og udvælgelse blev anvendt ( Figur 6B). Vi først testede standardmodel kromosomal ustabilitet i kræft, som ikke tager selektion mod nydannede aneuploide celler i betragtning, mens hastigheden af ​​mitotiske kromosom mis-segregation ofte er hævet. Fordi mitotiske mis-segregation sats er kendt for at variere udstrakt mellem tumorer, blev hver virtuel tumor stemline tildelt en tilfældig mis-segregation sats spænder fra normal (4 × 10

-4 /kromosom /mitose) til den højeste værdi rapporteret ( 36 × 10

-4 [6]). Det eneste udvælgelseskriterium pålagt var obligat udryddelse af stemlines har opnået nullisomies, baseret på den kendsgerning, at tumorer med fuldstændigt fravær af materiale fra en autosom er rapporteret meget sjældent (https://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman) . Disse betingelser resulterede i en fortsat stigning i det samlede antal kromosomafvigelser i prøven populationen med stigende mitotiske generationer (figur 6C og S4A), hvilket resulterer i en binomial-lignende fordeling med en form for 15 afvigelser efter 2000 generationer (figur 7A). Flere variationer i fordelingen af ​​mis-segregation satser blev også testet, med lignende resultater af en binomial-lignende fordeling.

De forventede fordelinger efter forskellige betingelser for kromosomale mis-segregation og udvælgelse blev forudsagt af simuleringer, som beskrevet i figur 6. i hver graf, er de rapporterede data for Wilms tumor (WT, sorte cirkler) og kolorektal cancer (CRC, røde cirkler) medtaget til sammenligning.