PLoS ONE: Genetisk og Farmakologisk Målretning af CSF-1 /CSF-1R Hæmmer tumorassocierede makrofager og Forringer BRAF-induceret kræft i skjoldbruskkirtlen Progression

Abstrakte

Avancerede menneskelige skjoldbruskkirtelkræft er tæt infiltreret med tumor-associerede makrofager (Tams) og dette korrelerer med en dårlig prognose. Vi brugte

BRAF

induceret papillær kræft i skjoldbruskkirtlen (PTC) musemodeller at undersøge, hvilken rolle TAM’er i PTC progression. Efter betinget aktivering af

BRAF

V600E

i murine skjoldbruskkirtel der er en øget udtryk af TAM kemoattraktanter

Csf-1

og

Ccl-2

. Dette efterfølges af udviklingen af ​​PTC’er, der er tæt infiltreret med TAMs der udtrykker

Csf-1r

CCR2

. Målretning CCR2-udtrykkende celler under BRAF-induktion reduceret TAM densitet og forringet PTC udvikling. Denne strategi også inducerede mindre tumorer, nedsat proliferation og restaureret en skjoldbruskkirtlen follikulært arkitektur i etablerede PTC’er. I PTC’er fra mus, der manglede CSF-1, eller som har modtaget en c-FMS /CSF-1R-hæmmer, TAM rekruttering og PTC progression blev forringet, den gentog virkningerne af målretning CCR2-udtrykkende celler. Vores data viser, at TAMer er pro-tumorigen i avancerede PTC’er, og at de kan målrettes farmakologisk, som kan være potentielt nyttige for patienter med fremskredne skjoldbruskkirtelkræft

Henvisning:. Ryder M, Gild M, Hohl TM, Pamer E, Knauf J, Ghossein R, et al. (2013) Genetisk og Farmakologisk Målretning af CSF-1 /CSF-1R Hæmmer tumorassocierede makrofager og Forringer BRAF-induceret kræft i skjoldbruskkirtlen Progression. PLoS ONE 8 (1): e54302. doi: 10,1371 /journal.pone.0054302

Redaktør: Marian Ludgate, Cardiff University, England

Modtaget: 26 september, 2012; Accepteret: December 10, 2012; Udgivet: 23 Jan 2013

Copyright: © 2013 Ryder et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette projekt er finansieret delvist af K08 CA133183 og amerikanske Thyroid Association THANC award (MR), K08 AI071998 (TMH), RO1 CA50706 og R01 CA72597 (JAF), den Lefkovsky Family Foundation og Byrne fond. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tumor-associerede makrofager (Tams) har kapacitet til at hindre (M1 type) eller fremme (M2 type) tumorigenese [1]. Den iagttagelse, at en øget tæthed af TAM’er korrelerer med dårligt klinisk resultat i de fleste humane cancere tyder TAM’er er pro-tumorigene [2] – [5]. Desuden gen underskrifter fra stroma af humane brystcancere stammer fra patienter med dårligt resultat er uafhængige prognostiske markører og indeholder flere stærkt udtrykte TAM-relaterede gener [6]. Direkte bevis for den rolle, TAM’er i tumorigenese er observeret i brystcancer musemodeller, hvor kolonistimulerende faktor-1 (CSF-1) -afhængig TAM rekruttering er påkrævet for tumor initiering gennem stimulering af tumorangiogenese [7]. Ved metastatiske steder, CCR2

+ inflammatoriske makrofager (MO) letter brystkræft celle ekstravasation, såning og vækst [8].

Etapevis murine modeller af tumorigenese er velegnet til at undersøge den funktionelle rolle af stromale celler på tumor initiering og progression. Den bedst karakteriserede af disse er den RIP1-Tag islet cell carcinoma [9] og polyoma middle T-antigen (PyMT) brystkræft modeller [10]. Disse har givet værdifulde oplysninger, men velsagtens de ikke genetisk nøjagtige recapitulations af førere af tumorigenese i disse celletyper. Onkogene mutationer af

BRAF

er de mest almindelige genetiske begivenheder i melanomer [11] og papillære skjoldbruskkirtelkræft (PTC) [12], [13], og menes at være involveret i tidlige stadier af tumor udvikling, som de er til stede i godartede nævi [14] og mikropapillær skjoldbruskkirtelkræft [15], hhv.

BRAF

mutationer er også meget udbredt i avancerede former for kræft i skjoldbruskkirtlen [16], og er forbundet med større dødelighed [17]. Interessant, en øget tæthed af TAM’er korrelerer med lymfeknudemetastaser i PTC [18] og invasiv sygdom og nedsat overlevelse i dårligt differentierede skjoldbruskkirtelkræft (PDTC) [4]. Faktisk TAM’er omfatter mindst 50% af tumorvolumen fleste anaplastisk skjoldbruskkirtelkræft (ATC), en ekstremt virulent form af sygdommen, der er næsten uvægerligt dødelig [4], [19], [20].

Flere mus genetiske modeller af

BRAF

induceret kræft er blevet udviklet, enten ved aktivering af latente endogene mutant alleler [21], [22] eller gennem skjoldbruskkirtlen-specifikke overekspression [23]. Alle viser høj penetrans af kræft i skjoldbruskkirtlen, og progression til dårligt differentierede tumorer. Desuden betinget aktivering af BRAF i murine skjoldbruskkirtel inducerer PTC, der er helt omvendt ved de-induktion af BRAF [24].

I denne undersøgelse viser vi, at aktivering af onkogen BRAF i murine skjoldbruskkirtel resulterer i en forøget ekspression de kemoattraktanter CSF-1 og CCL2 og at dette er forbundet med en hurtig og robust rekruttering af TAMs der udtrykker de beslægtede receptorer

Csf-1r

CCR2

hhv. Selektivt målretning CSF-1 eller CCR2-udtrykkende celler under BRAF aktivering signifikant reduceret TAM densitet og forringet PTC udvikling og progression. Nedbrydningen af ​​TAMer under tidlig PTC udvikling forringet stromale udvidelse af cancer-associerede myofibroblaster (CAFS). I etablerede PTC’er, tumorer udvikler høje celle og dårligt differentieret foci, som er histologiske træk der er karakteristiske for avancerede humane skjoldbruskkirtelkræft. Målretning CCR2-udtrykkende celler i mus med avancerede PTC’er resulterede i en reduceret TAM tæthed samt mindre, mere differentierede skjoldbruskkirtelkræft med færre foci af høje celler og dårligt-opdelte områder. Farmakologisk målretning af BRAF-inducerede PTC’er med en selektiv c-FMS /CSF-1R kinase inhibitor opsummerede virkningerne af målretning CCR2-udtrykkende celler. Disse data antyder, at terapeutiske strategier rettet mod TAM’er kan være gavnlig i denne sygdom, og måske forbedre effektiviteten af ​​kinaseinhibitorer rettet mod cellen autonome onkogene førere af sygdommen.

Materialer og metoder

Mus modeller

følgende to modeller af

BRAF

induceret kræft i skjoldbruskkirtlen blev anvendt i denne undersøgelse:

1) Tg-rtTA /tetO-BRAF

V600E

mus udtrykker onkogen BRAF

V600E i thyreoideaceller i en dox-afhængig måde, og blev holdt i en FVB /N baggrund [24]. 2)

Tg-BRAF

transgene mus udtrykker det humane oncoprotein under kontrol af den bovine thyroglobulin genpromotoren [23].

CCR2-DTR

CCR2-GFP

mus udtrykker DTR eller grønt fluorescerende protein (GFP), henholdsvis under kontrol af monocyt /Mø-specifik

CCR2

genpromotoren, og blev holdt i en C57 /B6 baggrund [25].

CSF-1

– /-

mus (Jackson Lab, Bar Harbor, ME) er mangelfuld i omløb og væv monocytter /MO [26], [27]. Alle husdyrhold og eksperimentelle procedurer blev godkendt af Memorial-Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care og brug Udvalg.

Nedbrydning af TAM’er i BRAF-induceret kræft i skjoldbruskkirtlen musemodeller

Makrofag udtynding i knoglemarv (BM), blod, milt og bughulen blev undersøgt i

CCR2-DTR

mus efter behandling med difteritoksin (DT) 20 ng /g (List Biologicals, Campbell, CA) intraperitonealt (ip) på alternerende dage i 7 dage. Fireogtyve timer efter den sidste dosis af DT blev mus aflivet ved CO

2 indånding og vævsprøver opnået for flowcytometri og /eller immunhistokemi (IHC) som beskrevet nedenfor.

For at vurdere virkningerne af TAMer om PTC udvikling,

Tg-rtTA /tetO-BRAF /CCR2-DTR

mus blev fodret dox-imprægneret chow (2500 ppm; Harlan-Teklad) i 7 dage med eller uden DT ip på skiftende dage begyndende på dag 0. På dag 7 (24 timer efter den sidste dosis af DT), blev mus aflivet ved CO

2 indånding og skjoldbruskkirtel udvundet til IHC. For at undersøge, hvilken rolle TAM’er i etablerede BRAF-induceret skjoldbruskkirtelkræft vi behandlet

Tg-BRAF /CCR2-DTR

mus ved ca. 6 og 12 ugers alderen med eller uden DT på skiftende dage for 10 dage. Mus blev aflivet og skjoldbruskkirtel udvundet 24 timer efter den sidste dosis af DT for flowcytometri og IHC.

FACS analyse

Puljede skjoldbruskkirtel blev høstet efter intrakardielle PBS perfusion at nedbryder cirkulerende leukocytter. Skjoldbruskkirtel blev hakket i små fragmenter efterfulgt af enzymatisk fordøjelse til enkeltcelle-suspensioner med collagenase type 2 (Worthington, Lakewood, NJ) og dispase (Invitrogen, Carlsbad, CA) i 90 minutter i en rysteinkubator ved 37 ° C. Prøver blev derefter vasket tre gange med iskold medium suppleret med 10% FBS efterfulgt af rekonstituering i FACS-buffer (PSB /1% BSA). Prøver blev blokeret med muse Seroblock FcR (ABD Serotec, Raleigh, NC) i 10 minutter på is, efterfulgt af en 30 minutters inkubation med følgende fluorescens konjugerede antistoffer: CD45: PerCP Cy5.5, CD11b: APC, Gr-1: FITC, Ly6C: FITC, Ly6G: FITC (BD Pharmingen, San Diego, CA) F4 /80: FITC (ABD Serotec). Enkelt celle suspensioner af BM aspirater blev blodprøver, der blev ryddet af røde blodlegemer og peritoneale udskylninger blokeret og mærket som ovenfor. Dataindsamlingen blev opnået ved FACS Caliber flowcytometer gennem MKSCC Flow Core og dataanalyse blev udført ved hjælp af Flowjo 7.2.5 software.

TAMer fra skjoldbruskkirtelkræft af

TPO-Cre /LSL-BRAF

mus, der udtrykker endogene niveauer af BRAF

V600E [21], blev sorteret med CD11:. APC fra skjoldbruskkirtlen enkelt celle præparater som beskrevet ovenfor

Immunofluorescens /Immunhistokemi (IHC)

For immunofluorescens serielle snit blev opnået fra friske frosne, OLT indlejrede skjoldbruskkirtel og /eller milt. Thyroid 5 um snit fra mindst 3-4 niveauer, hver -150 um fra hinanden, blev opnået. Objektglas blev lufttørret, fikseret med iskold acetone i 30 minutter, re-tørret og derefter anbragt i PBS. Snit blev blokeret med DakoCytomation serum-frit protein blok (Dako, Carpinteria, CA) i 30 minutter efterfulgt af PNB blokerende reagens (Perkin Elmer, Waltham, MA) i 60 minutter. Følgende muse primære, blev ukonjugerede antistoffer anvendt: CD11b, CD68 og αSMA efterfulgt af inkubation med sekundære antistoffer af enten Alexa-Fluor 488 eller Alexa-564. Snit blev afbildet på en opretstående Zeiss Axio2Imaging mikroskop ved MSKCC Molecular cytologi Core Facility.

I IHC blev skjoldbruskkirtel fikseret natten over ved 4 ° C med frisk 4% paraformaldehyd ved hjælp kontinuerlig rotation. Væv blev vasket med 2 cykler af 30 min PBS inkubationer og derefter placeret i 70% ethanol. Væv blev forarbejdet til paraffinindlejrede blokke efterfulgt af seriel sektionering. Efter afparaffinering, H G: 10 × forstørrelse)

BRAF aktivering resulterer i en hurtig stigning i ekspressionen af ​​pro-tumorigen. /M2 typen MO kemoattraktanter

CSF-1 /CSF-1R og CCL2 (MCP-1) /CCR2 signalering i murine bryst og bugspytkirtlen neuroendokrine kræftformer inducerer TAM rekruttering og en pro-tumorigen M2-lignende fænotype [28] , [29]. En uge efter dox induktion i

Tg-rtTA /tetO-BRAF

V600E

mus, der var en 250 og 20.000 gange stigning i

Csf-1

og

c-fms /Csf-1R

mRNA, (fig. 2). Den enorme stigning i

Csf-1R

udtryk sandsynligvis afspejler den rigelige TAM rekruttering, da vi vise, at BRAF-induceret murine PTC celler ikke udtrykke denne receptor (fig. S1). Angivelse af

CCL2

dets receptor

CCR2

blev også steget, men i mindre grad (-4 gange) (fig. 2). Den forøgede ekspression af de to chemokiner blev øget i den ikke-TAM cellepopulation, bestående primært af thyroide follikulære celler (fig. S1). Dette er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der viser, at BRAF inducerer ekspression af Mo kemoattraktanter i PCCL3 celler, en rotte thyroid follikulær cellelinje [30]. Disse data antyder, at efter BRAF aktivering, thyrocytter udtrykkelig CSF-1 og CCL2, som er associeret med rekruttering af TAM’er udtrykker deres respektive receptorer.

Kvantitativ RT-PCR for de angivne kemoattraktanter og deres respektive receptorer i skjoldbruskkirtel vævsekstrakter fra T

g-rtTA /tetO-BRAF

V600E

mus uden (ingen dox) eller 7 dage efter dox. Ekspressionsniveauer blev normaliseret til

β-actin

. Bjælkerne repræsenterer middelværdien + SD fra thyroids af ingen dox (n = 4) og 7-dages DOX-induceret (n = 7) -mus. *** P. 0,001

Selektiv nedbrydning af TAM’er i PTC af Tg-rtTA /tetO-BRAF

V600E mus forringer PTC initiering og forsinker stromale udvidelse af CAF

for at undersøge den funktionelle rolle af TAM’er på PTC udvikling, krydsede vi

Tg-rtTA /tetO-BRAF

V600E

med

CCR2-DTR

mus, der udtrykker difteri toxin-receptoren (DTR) under kontrol af

CCR2

gen promotor [31]. Knoglemarv afledte monocyt (BMDM) forstadier kræver CCR2 signalering at forlade marv [31]. Perifer Mø udtrykker ikke CCR2, undtagen under forskellige inflammatoriske tilstande [32], [33]. Som vist i fig. S2A-B, BM og blod

CCR2-DTR

mus behandlet med DT i en uge havde en reduktion i Ly6C + monocyt-forstadier (fig. S2A) såvel som i CD11b

+ og F4 /80

+ cirkulerende monocytter (fig. S2B). Resident peritoneal og milt MO (fig. S2C, G) udviste også en komplet og /eller delvis reducering MO densitet (fig. S2E, H), hhv. Dette var ledsaget af et skift i Gr-1 + myelomonocytes forstadier fra BM (fig. S2A) og kredsløb (fig. S2B) i perifere sites (Fig. S2F).

Vi næste behandlet

Tg -rtTA /tetO-BRAF

V600E /CCR2-DTR

mus med DOX i 7 dage, og med DT ved IP injektion på dag 0, 3 og 6. som vist i figur 3A, dette resulterede i en næsten komplet udtømning af TAM’er i tumorstroma. Histologisk var dette ledsaget af reduktion i tumormasse med i det mindste en delvis genopretning af thyroid follikulær arkitektur (fig. 3B). Celleproliferation som målt ved Ki67-farvning var markant reduceret, som var mest tydelig i peri-tumorale og peri-follikulære stromale rum (fig. 3C). Eftersom CAF og TAM’er er de vigtigste celletyper i stroma, vi hypotesen, at reduktionen i spredningen primært afspejler en effekt på TAM’er og /eller CAF. Således som vist i figur 3D og E, i fravær af TAM’er, observerede vi en drastisk reduktion i αSMA positiv farvning i tumoren kapsel samt inden skjoldbruskkirtlen mellem reder af follikelceller. Behandling med DT påvirkede ikke BRAF-induceret MAPK-aktivering, som bestemt ved IHC med phospho-ERK (fig. S3). Vi gentog disse undersøgelser ved hjælp af en anden model af betinget TAM udtømning (

CD11b-DTR

). Vi observerede en reduktion i Tams og αSMA

+ CAF efter behandling af

Tg-rtTA /tetO-BRAF

V600E /CD11b-DTR

mus med DOX i 7 dage + DT, som beskrevet ovenfor ( data ikke vist). Derfor MO udtømning under BRAF-induceret tumor initiation resulterer i en dyb remodeling af tumor stroma, kendetegnet ved udtømning af CAF.

Repræsentative snit fra T

g-rtTA /tetO-BRAF

V600E /CCR2-DTR

mus behandlet med DOX i 7 dage med eller uden intraperitoneal DT hver anden dag: A) IHC med anti-Mac-2 viser tætte brun farvning i stroma omkring kræft i skjoldbruskkirtlen follikelceller i kontrol PTC’er (

venstre

), der er betydeligt svækket i DT-behandlede mus (

rigtige

). B) PTC’er fra DT-behandlede mus er mindre og har en mere konserveret follikulær arkitektur. C) IHC med Ki67 viser reduceret celleproliferation, primært inden for stroma, af PTC’er fra DT-behandlede mus. D, E) IHC med αSMA viste reduceret positivitet i tumor kapsel og intertumoral stroma. E) Højere forstørrelse (40 ×) viser markant udtynding af tumor kapsel og udtømning af αSMA positive celler i inter-tumorale rum af DT-behandlede mus. F) søjlediagram, der viser ændringer i Mac-2, αSMA og Ki67 i kontrol (n = 5) vs DT-behandlede (n = 6) mus. *** P 0,001, * p. 0,01

PTC’er af Tg-BRAF mus er stærkt infiltreret af inflammatoriske, M2 polariseret TAMer

Vi næste vendt til en musemodel af etableret PTC, for at undersøge den rolle, TAM’er i tumor vedligeholdelse og progression.

Tg

–

BRAF

musemodel tæt rekapitulerer avancerede humane BRAF mutant PTC’er, idet tumorcellerne udviser karakteristiske høje celle funktioner [23], og fremskridt til PDTC [23], [34 ]. Som vist i fig. S4, CD68

+ (fig. S4A), F4 /80

+ (fig. S4b) og CD11b

+ (fig. S4C) TAM’er surround og stærkt infiltrere PTC af 6-12 uger gamle

T

g-

BRAF

mus. For at bestemme om CCR2

+ TAM’er bidrage til denne celle population, genereret vi

Tg-BRAF /CCR2-GFP

mus. I vildtype

CCR2-GFP

mus, der er få CCR2-GFP

+ bosiddende MO (fig. S4D), mens der i

Tg-BRAF /CCR2-GFP

dyr, ca. 20% af den totale cellepopulation består af CCR2-GFP

+ TAMs der co-udtrykker CD45

+ (fig. S4 E, F).

Vi bestemmes næste fænotypen af ​​TAM’er opnået fra etablerede murine PTC’er (8 til 15 uger gamle) ved at sammenligne mRNA niveauerne af M1- vs M2-beslægtede gener sammenlignet med murint BMDM (fig. S4G). Berigelse af TAM’er sorteret fra PTC enkelt cellesuspensioner blev bekræftet ved høj ekspression af

Csf-1R

, som var sammenlignelig med BMDMs. Ekspression af M2-relaterede gener

CCR2

,

arginase1

,

Ccl22 og IL-10

var højere i TAM’er forhold til BMDMs. I modsætning til M1-specifikke markører

IL-12

og

ROS

ikke var signifikant forskellige mellem disse cellepopulationer (fig. S4G).

Selektivt nedbryder TAM’er under fremskredne stadier af PTC inducerer tumorregression: Vores data viser, at murine PTC’er er infiltreret af M2 polariseret TAMer

Vi næste genererede

Tg-BRAF /CCR2-DTR

mus til at undersøge, om TAM’er er nødvendige for tumor vedligeholdelse . Behandling af mus med DT i 10 dage resulterede i en 4-8 fold udtømning af TAM’er (fig. 4A, B, C, D, E, F). Der var en lille samtidig forøgelse af Gr1

+, Ly6G

+ -celler, i overensstemmelse med tumorinfiltrerende neutrofiler (dåser) (fig. 4D, E, F). TAM-udtømning var associeret med en reduktion -50% i tumorvægt (18 +/- 3 vs. 33 +/- 7 mg i DT vs kontrol, p = 0,0002, fig. 5A, B). Dette var forbundet med en 30% nedgang i Ki67-farvning (0,54% /mm

2 vs. 0,77% /mm

2 i DT vs kontrol, p = 0,04) (Fig 5C F.), Og en 4 fold stigning i TUNEL + celler (fig. 5 D, F), primært inden for områder, infiltreret af TAMer. Selv om det samlede blodkar tæthed var lavere i TAM-udtømte PTC’er sammenlignet med kontrol PTC (fig. 5E), var dette ikke statistisk signifikant, når korrigeret for tumor område. Avancerede fase PTC’er i kontrol mus havde prominente papillære strukturer med mange foci af høje celler (Fig. S5A) og PDTC foci (fig. S5B). Behandling af 6-12 uger gamle TG-

BRAF-service /

CCR2-DTR

mus med DT i 10 dage resulterede i skjoldbruskkirtlen med en fremherskende follikulært arkitektur bestående af kolloide-holdige hårsække, med færre tall celler og PDTC tumor reder (fig. S5C, D).

repræsentant IHC med Iba-1 i PTC af kontrol (A) og DT-behandlede (B) mus. C) Kvantificering af Iba-1 positiv farvning af celler fra skjoldbruskkirtlen sektioner af kontrol- og DT-behandlede mus under anvendelse Metamorph software. D, E) FACS-analyse med anti-CD11 og anti-Gr-1 på cellesuspensioner isoleret fra skjoldbruskkirtel kontrolmetoder (D) og DT-behandlede mus. I mangel af DT (D) der er rigelige CD11 + Gr1- TAM’er (øverst til venstre kvadrant). Efter en uge DT (E), er TAM’er dybt forarmet med en lille stigning i CD11 + Gr1 + neutrofiler. F) Repræsentant analyse fra FACS data for de angivne markører af TAM’er og neutrofile før og efter DT behandling.

A) Vægt af skjoldbruskkirtel kontrol- og DT-behandlede

Tg-BRAF /Ccr2- DTR

mus efter 10 dage behandling med intraperitoneal DT hver anden dag. * P 0,01. B-C) Repræsentative sektioner med de angivne pletter. F) Kvantificering af Ki67 og TUNEL positiv farvning under anvendelse Metamorph dataanalyse. Ki67 p 0,04; TUNEL p. 0,01

CSF-1 /CSF-1R signalering er nødvendig for TAM rekruttering og kan farmakologisk målrettes skade PTC initiering

Vi næste undersøgt, om CSF-1 er kræves til TAM rekruttering ved at generere

Tg-BRAF /CSF-1

– /-

mus.

CSF-1

– /-

mus er tidligere blevet beskrevet (36; 37) og har normal thyroid histologi. PTC’er fra

Tg-BRAF /CSF-1

– /+

mus tæt infiltreret med TAM’er (Fig 6B, venstre panel.). Fire ud af 5

Tg-BRAF /CSF-1

– /-

mus udviste et signifikant udtynding i TAM’er i PTC’er (Fig 6B højre panel.), Der var forbundet med en reduktion i tumorvægt (fig. 6A), og blev ledsaget af generaliseret bevarelse af den follikulære arkitektur (fig. 6C, højre panel). TAM densitet blev ikke udtømt i skjoldbruskkirtlen hos en

Tg-BRAF /CSF-1

– /-

mus, som udviste en tumor vægt (figur 6A.) Og histologisk fænotype sammenlignes med kontrol- PTC’er (data ikke vist). Disse data peger på en væsentlig rolle for CSF-1 signalering i TAM rekruttering i denne model, selv om alternative signaler i et mindretal af tilfælde kan omgå kravet CSF-1 for TAM rekruttering.

A) Thyroid vægt

Tg-BRAF /CSF-1

+/-

(kontrol) og

Tg-BRAF /CSF-1

– /-

(

CSF-1

null) mus ved 6-12 ugers alderen. B, C) Repræsentative snit farvet med anti-Mac-2 (B) og H /E (C) viser TAM udtømning og bevarelse af follikulært arkitektur i PTC af

CSF-1

null mus.

for at afgøre, om rekruttering og /eller aktivering af TAM’er kunne blokeres farmakologisk, vi fodres dox-induceret

tetO-BRAF

mus med imprægneret chow indeholder GW2580, en c-FMS Tg-rtTA //CSF-1R tyrosinkinasehæmmer (38) i 7 dage. Dox-induceret GW2580-behandlede mus havde PTC’er med en reduktion TAM’er (fig. 7B, F), som var forbundet med et signifikant fald i skjoldbruskkirtlen vægt (0,0163 +/- 0,0014 køretøj vs. 0,0126 +/- 0,0026 GW2580 ~62%, p = 0,029;. figur 7A) og en mere differentieret skjoldbruskkirtel follikulært arkitektur (figur 7A).. Stromale CAF, som målt ved αSMA, blev reduceret ~77% i GW2580-behandlede mus sammenlignet med kontroller (Fig. 7C, F). Tumor proliferation blev reduceret med 31% i GW2580-behandlede PTC’er og denne reduktion var tydeligst i det stromale rum (fig. 7B, F). Disse observationer opsummerede virkningerne af genetisk nedbryder TAMer (fig. 3), styrkelse af dokumentation for, at TAM’er letter kræft i skjoldbruskkirtlen progression og at TAM’er er et gyldigt mål for patienter med fremskreden sygdom.

A-D) Repræsentative skjoldbruskkirtlen sektioner for de angivne pletter fra syv dage DOX-induceret

Tg-rtTA /tetO-BRAF

mus behandlet med enten vehikel (n = 4) eller GW2580-imprægneret chow (n = 4): A) H /E; B) Iba-1; C) αSMA; D) Ki67. E) Thyroid vægte af DOX-induceret, køretøj vs. GW2580-behandlede mus (* p = 0,02). F) Kvantificering for de angivne pletter; * P 0,001, ** p. 0,01

Diskussion

Makrofager er meget alsidige og har kapacitet til at differentiere til Kupffer celler, osteoklaster og /eller pneumocytter i hjemmehørende væv eller i inflammatoriske Mo undertyper i mikrobielle infektioner (M1 type) eller efter vævsskade (M2 type). TAM’er medierer en vært reaktion på tumorigene proces, og kan inducere anti-tumor immunitet (M1 typen TAMs) eller paradoksalt nok kan forbedre tumorigenese (M2 typen TAM’er) [35]. De fleste korrelative data fra humane kræftformer tyder på, at TAM’er er protumorigenic, herunder kræft i skjoldbruskkirtlen [2] – [5]. I PyMT induceret brystkræft, TAM’er lette tumor angiogenese og lungemetastaser men har ingen effekt på primær tumor vækst [28]. I RIP1-Tag inducerede pancreas neuroendokrine tumorer (PNET), CSF-1 afhængige TAM’er lette overgangen fra hyperplastiske angiogene småøer til PNET, men har ingen effekt på den efterfølgende tumor fænotype [29]. I mutant APC tarm polypose modeller, CSF-1-afhængige TAM’er fremmer polyp vækst. Dog kunne deres rolle i malign transformation ikke evalueres i denne model af godartet sygdom [36]. Disse undersøgelser implicerer TAM’er som tumor initiativtagere, alvorligt dysmorphic fænotype af

CSF-1

banke mus anvendt i disse undersøgelser, og det faktum, at denne model ikke tillader TAM’er at være udtømt under definerede stadier af tumor udvikling begrænse de konklusioner, der kan udledes fra disse eksperimenter. Desuden fordi onkogener kan fremkalde distinkte inflammatoriske signaler, som differentieret påvirke fænotype af TAM’er, kræftmodeller induceret af oncoproteiner vides at være involveret i sygdom patogenese kan mere trofast rekapitulere funktionen af ​​TAM’er i human cancer.

oncogen

BRAF

inducerede skjoldbruskkirtelkræft er ideelt egnede til at studere biologi TAM’er i cancer progression fordi 1) human thyreoideacancer progression til PDTCs og ATC ledsages af en forøget infiltration af TAM’er, som omfatter næsten -50% af tumorvolumenet i ATC [4], [19]; 2)

BRAF

fremmer progression af humane WDPTCs til PDTCs og ATC [16] og 3) aktivering af BRAF-MAPK-vejen in vitro i thyreoideaceller inducerer ekspressionen af ​​TAM kemoattraktanter [30]. I denne undersøgelse anvendte vi murine modeller af BRAF-induceret PTC’er /PDTCs at undersøge, hvilken rolle TAM’er i kræft i skjoldbruskkirtlen progression. Betinget aktivering af BRAF i murine skjoldbruskkirtel er forbundet med en betydelig stigning i de store TAM kemoattraktanter,

Csf-1

og

CCL2

. Dette ledsages af en tæt infiltration af TAM’er og udvikling af PTC’er /PDTCs med en kort latenstid [24]. For at undersøge, om der er en årsagssammenhæng mellem TAM infiltration og PTC udvikling, vi betinget forarmet CCR2-afhængige TAM’er løbet BRAF induktion ved hjælp af en

CCR2-DTR

tilgang. Handel med monocytter fra marven i kredsløbet og væv kræver signalering gennem CCL2 /CCR2 vej og monocytter mangler CCR2 udtryk bliver fanget i BM [31]. En gang i cirkulationen og /eller væv, CCR2 udtryk på monocytter /Mø nedreguleres under hvilende tilstande, men er stadig opreguleret under inflammation [31].