Abstrakt
hepatocellulært carcinom (HCC) er den næsthyppigste årsag til kræft dødelighed på verdensplan. De fleste tilfælde af HCC er forbundet med cirrose relateret til kronisk hepatitis B virus eller hepatitis C-virus infektioner. Hypermethylering af promotorområder er den vigtigste epigenetiske mekanisme gendæmpning og har været involveret i HCC udvikling. Formålet med denne undersøgelse var at bestemme, om afvigende methylering af
RASSF1A
DOK1
genpromotorer er forbundet med progression af leversygdom i brasilianske patienter. Methylering niveauer blev målt ved pyrosekventering i 41 (20 HCC, 9 cirrhotisk, og 12 ikke-cirrose) lever vævsprøver. Mean satser methylering i
RASSF1A
DOK1
var 16,2% og 12,0% i ikke-cirrotisk, 26,1% og 19,6% i cirrotisk, og 59,1% og 56,0% i HCC væv, henholdsvis , der viser en gradvis stigning ifølge progressionen af sygdommen, med signifikant højere niveauer i tumorvæv. Desuden hypermethylering af
RASSF1A
DOK1
blev fundet i langt de fleste (88%) af HCC tilfælde. Interessant,
DOK1
methylering niveauer i HCC prøver var signifikant højere i gruppen af yngre ( 40 år) patienter, og højere i moderat differentieret end i dårligt differentierede tumorer (
s
0,05). Vores resultater styrke den hypotese, at hypermethylering af
RASSF1A
DOK1
bidrager til hepatocarcinogenese og er forbundet til klinisk-patologiske karakteristika.
RASSF1A
DOK1
promoter hypermethylering kan være et værdifuldt biomarkør for tidlig diagnose af HCC og et potentielt molekylær mål for epigenetisk-baseret behandling
Henvisning:. Araújo OC, Rosa AS, Fernandes A, Niel C, Villela-Nogueira CA, Pannain V, et al. (2016)
RASSF1A
DOK1
Promoter methylering Niveauer i hepatocellulært carcinom, Cirrotisk og ikke-syge lever, og korrelation med leverkræft i brasilianske Patienter. PLoS ONE 11 (4): e0153796. doi: 10,1371 /journal.pone.0153796
Redaktør: Isabelle A. Chemin, CrCL-INSERM, FRANCE
Modtaget: Februar 11, 2016 Accepteret: April 4, 2016; Udgivet: 14 April, 2016
Copyright: © 2016 Araújo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret
Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (https://cnpq.br/) indrømme nummer 444.071 /2014-8, til NMA, og Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (https://www.faperj.br/), tildele nummer E-26 /111,528 /2013, til NMA. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Leverkræft er den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald, med en anslået 700.000 dødsfald hvert år på verdensplan [1]. Hepatocellulært carcinom (HCC) er langt den mest almindelige form for primær leverkræft og en af de få kræftformer med veldefinerede væsentlige risikofaktorer. Ca. 80% af alle HCC tilfælde er forbundet med kronisk hepatitis B-virus (HBV) eller hepatitis C-virus (HCV) -infektioner [2], selv om kronisk alkoholisme og alkoholiske steatohepatitis (NASH) er også vigtige årsager [3, 4]. Disse risikofaktorer inducerer kronisk leverskade ofte fører til skrumpelever, som er til stede i 80-90% af patienter med HCC [4, 5]. Da HCC prognose afhænger af tumor scenen på diagnose, lavere overlevelsesrater er observeret blandt patienter på et fremskredent stadium [6], der fremhæver betydningen af identifikation af biomarkører for tidlig leverkræft opdagelse og terapeutiske indgreb.
molekylære mekanismer bag hepatocarcinogenese fortsat uklare. I lighed med andre tumorer, udviklingen og progressionen af HCC skyldes en flertrinsproces herunder akkumulering af genetiske og epigenetiske ændringer i regulatoriske gener, som fører til aktivering af forskellige onkogener og inaktivering af tumorsuppressorgener. Hypermethylering af promotor- CpG-øer er en epigenetisk mekanisme af gendæmpning involveret i en lang række humane cancere, herunder HCC [7, 8]. Aberrant DNA-methylering er også blevet påvist i præmaligne tilstande, såsom dysplastiske knuder eller syge lever [9-11], hvilket tyder på at det er en tidlig begivenhed i hepatocarcinogenese og en værdifuld markør for risikovurdering. Ras association domæne familie 1A (
RASSF1A
) og nedstrøms for tyrosinkinaser 1 (
DOK1
) er tumorsuppressorgener ofte til tavshed gennem epigenetisk mekanisme i en række humane maligniteter [12, 13] . Afvigende methylering af disse gener er blevet foreslået at spille en vigtig rolle i den maligne transformation af hepatocyt [10, 14]. Især hypermethylering af disse gener i HCC er blevet rapporteret at vise geografiske forskelle, tyder på, at etnicitet kan påvirke DNA methylering niveauer [10].
brasilianske folk er resultatet af en intens blanding mellem europæiske kolonisatorer eller indvandrere, afrikansk slaver, og indfødte indianere. I Brasilien blev næsten 9.000 dødsfald tilskrevet HCC i 2013 [15], og kronisk HCV-infektion er den største risikofaktor, der tegner sig for mere end 50% af tilfældene [16]. Så vidt vi ved, er ingen rapport blevet hidtil offentliggjort på de epigenetiske faktorer forbundet til HCC i Brasilien.
I denne undersøgelse har vi udført en kvantitativ DNA-methylering analyse ved pyrosekventering i brasilianske patienter på HCC, cirrose og ikke -cirrhotic stadier og vurderede forholdet mellem methylering niveauer og klinisk-patologiske karakteristika, med det formål at undersøge relevansen af hypermethylering af
RASSF1A
DOK1
som en molekylær markør for HCC.
Materialer og metoder
Etik Statement
undersøgelsen protokollen blev godkendt af Research Ethics Committee for Clementino Fraga Filho Universitetshospital (godkendelsesnummer 139/10) og udført i overensstemmelse med erklæringen fra Helsinki. På grund af den tilbagevirkende kraft af undersøgelsen den etiske komité konkluderede, at der ikke skriftligt informeret samtykke var påkrævet fra patienterne.
Patienter og vævsprøver
Arkiverede formalin-fikseret paraffinindlejrede væv blokke var opnået ved Patologisk Institut for Clementino Fraga Filho Universitetshospital, Rio de Janeiro, Brasilien. Leverprøver fra 20 patienter med HCC, fire med cirrose uden HCC, og 12 med kronisk hepatitis (non-cirrotisk) blev analyseret (tabel 1). Endvidere blev det omgivende cirrotisk væv analyseret for fem HCC patienter (total = 41 prøver). Histologisk analyse viste funktioner er kompatible med kronisk hepatitis (betændelse med eller uden fibrose) i alle ikke-cirrotiske levervæv. HCC og cirrotiske vævsprøver blev opnået fra lever eksplantater eller kirurgisk resektion, mens væv fra patienter med kronisk hepatitis blev opnået ved perkutan leverbiopsi. Alle HCC patienter inkluderet i dette studie havde cirrhotiske lever.
Demografiske og klinisk-patologiske data blev indhentet fra journaler for at vurdere sammenslutningen af alder, køn, histologi, og HBV og HCV-infektioner med DNA methylering . Den virale status af patienterne blev etableret som følger: HBV-infektion, HBsAg positiv; HCV-infektion, anti-HCV og HCV-RNA positive; ingen virus, HBsAg, anti-HCV og HCV-RNA negative.
Den gennemsnitlige alder af patienterne var 57 (spændvidde mellem 19-78) år, med 47% af dem i alderen ≥ 60 år. Seksogtyve (72%) af patienterne var mænd. HCV-infektion var den vigtigste ætiologiske faktor leversygdom (56% af tilfældene), efterfulgt af HBV (19%). Fjorten (70%) HCC patienter havde en moderat differentieret tumor, og ti (50%) havde en tumor størrelse . 5 cm (tabel 1)
DNA-isolering og natriumbisulfit konvertering
fem sektioner på 10 um blev skåret fra hver blok, deparaffineret i 1 ml absolut xylen og rehydratiseret i 1 ml 96% ethanol. Genomisk DNA-ekstraktion blev udført ved hjælp af QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA) ifølge fabrikantens protokol. Ca. 500 ng genomisk DNA blev underkastet bisulfit modifikation behandling for at konvertere alle ikke-methylerede cytosiner til thyminer. Dette blev udført ved anvendelse af EZ DNA-methylering-Lightning Kit (Zymo Research, Irvine, CA). Det modificerede DNA blev opbevaret ved -20 ° C til yderligere analyse.
DNA methylering analyse ved pyrosekventering
DNA methylering niveauer af
RASSF1A
DOK1
promotorregioner blev målt ved den meget følsomme pyrosekventering teknologi (PyroMark Q96 ID, Qiagen) ved flere CpG sites. Bisulfit-behandlet DNA blev PCR-amplificeret i et volumen på 50 pi reaktion, som indeholdt 1U of Platinum Taq DNA Polymerase, High Fidelity (Invitrogen, Carlsbad, CA) og 0,2 pM af hver oligonukleotidprimer [10], på følgende betingelser: 94 ° C i 30 sek; 35 cykler ved 94 ° C i 30 sek, 55 ° C i 30 sekunder, og 68 ° C i 1 min, efterfulgt af en afsluttende forlængelsestrin ved 68 ° C i 7 min. Ti mikroliter af PCR-produkt blev analyseret på agarosegel ved elektroforese. De resterende 40 pi af biotinylerede PCR-produkt blev indfanget på streptavidin-coatede kugler (GE Healthcare, Milwaukee, WI) og pyrosekventering reaktionen blev oprettet ved hjælp af PyroMark Gold Q96 (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. Sættet af sekventeringsprimere er tidligere blevet udviklet [10]. Procentdelen af methylering blev målt ved seks og fem CpG steder i
RASSF1A
og
DOK1
initiativtagere, henholdsvis og udtrykt som middel til alle CpG’er analyseret på et givet gen. For at vurdere DNA hypermethyleringsassocierede frekvenser i HCC og cirrhotiske prøver, cut-off værdier for
RASSF1A
DOK1
blev opnået fra fraktil repræsenterer den øverste 95% af methylering niveauerne i ikke-cirrotiske prøver, som tidligere defineret [10]. Derfor blev frekvenserne af DNA hypermethylering repræsenteret som procentdelen af HCC og cirrhotiske prøver med methylering niveauer over afskæringsværdien for hvert gen.
Statistisk analyse
Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse af SPSS 20.0 software (IBM, Armonk, NY). Kruskal-Wallis test (eller Wilcoxon Rank Sum, når det er hensigtsmæssigt) blev anvendt til at sammenligne methylering niveauer i HCC, cirrose og ikke-cirrotiske leverprøver, samt at teste sammenhænge mellem methylering niveauer og klinisk-patologiske karakteristika. Type 1 fejl blev korrigeret for multiple sammenligninger. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant for
s
værdier mindre end 0,05.
Resultater
DNA methylering niveauer i ikke-cirrhotisk, cirrose og HCC vævsprøver
Pyrosequencing analyse blev positivt resultat i 41 (20 HCC, 9 cirrose og 12 ikke-cirrose) og 31 (17 HCC, 7 cirrose og 7 ikke-cirrotiske) vævsprøver til
RASSF1A
DOK1
hhv. Resultaterne af den kvantitative analyse af DNA-methylering, udtrykt som middelværdien procentdel af alle CpG’er analyseret på et givet gen, er vist i figur 1. Generelt methylering var lavere i ikke-cirrotisk, moderat cirrose, og højere i HCC væv for begge gener. Mean satser methylering i
RASSF1A
DOK1
var som følger: 16,2% og 12,0% i ikke-cirrotisk, 26,1% og 19,6% i cirrotisk, og 59,1% og 56,0% i HCC væv (tabel 2). Ingen statistisk forskel i methylering niveauer blev påvist mellem cirrhotiske og ikke-cirrotiske væv (
RASSF1A
,
s
= 0,165;
DOK1
,
s
= 1,000). Imidlertid observerede vi en meget signifikant forskel på methylering niveauer mellem HCC og ikke-HCC væv for begge gener (tabel 2). Methylering niveauer i cirrhotiske væv fra patienter uden HCC og tilstødende cirrhotiske væv fra patienter med HCC blev også sammenlignet. Forskellene mellem disse to grupper var ikke statistisk signifikant (
RASSF1A
,
s
= 0,652;
DOK1
,
s
= 0,231). En korrelation af
DOK1
methylering niveauer blev observeret mellem HCC- og cirrhotiske parret prøver, med HCC /cirrhotiske parrede væv viser samtidig den højeste eller den laveste niveauer af methylering. Imidlertid blev en sådan sammenhæng ikke observeret for
RASSF1A
methylering (data ikke vist).
methylering niveauer blev målt ved pyrosekventering ved forskellige CpG sites og udtrykt som den gennemsnitlige procentdel af alle CpG’er analyseret på et givet gen. Den statistiske signifikans for DNA methylering niveau i ikke-cirrotiske og cirrotiske væv blev beregnet ved sammenligning med HCC prøver.
DNA methylering status og klinisk-patologiske parametre
De associationer mellem klinisk-patologiske karakteristika (alder , køn og histologiske) og risikofaktorer (HBV og HCV-infektioner) på den ene side og methylering niveauer i HCC væv på den anden side, er vist i tabel 3. Generelt
RASSF1A
DOK1
udviste lignende methyleringsmønstre ifølge de analyserede parametre. Vi fandt en statistisk signifikant forskel i
DOK1
methylering niveauer fra en aldersgruppe til en anden (
p
= 0,036), med højere methylering niveauer i gruppen af yngre ( 40 år) patienter . Desuden betydeligt højere niveauer (
s
= 0,005) af
DOK1
methylering blev observeret i moderat differentiated- end i dårligt differentierede HCCs. Selvom
RASSF1A
DOK1
methylering niveauer var højere hos kvinder og i HBV-positive tumorer, ingen statistisk forskel kunne observeres. Desuden blev ingen sammenhæng fundet mellem tumor størrelse og methylering niveauer (tabel 3).
DNA hypermethyleringsassocierede frekvenser i cirrhotiske og HCC væv
Analyse af DNA hypermethyleringsassocierede frekvenser viste, at
RASSF1A
DOK1
gener blev hypermethyleret i langt de fleste (15/17, 88%) af de HCC væv (tabel 4). Desuden blev den samtidige hypermethylering af begge gener påvist i 14/17 (82%) HCC væv. Imidlertid blev lavere frekvenser af hypermethylering observeret blandt cirrhotiske væv (2/7, 29% i
RASSF1A
, 3/7, 43%
DOK1
, og 2/7, 29% begge gener ). Med hensyn til viral status, viste alle HBV positive HCCs hypermethylering i
DOK1
. Samtidig hypermethylering af disse gener blev observeret hyppigere i HBV (3/4, 75%) og HCV (8/9, 89%) positive tumorer end HBV og HCV negative (1/2, 50%). Tilsvarende blev samtidig hypermethylering detekteret i 2/3 (67%) HCV positive cirrotiske væv, men i ingen (0/4) af HCV negative (tabel 4). Frekvensen af hypermethylering var ens mellem cirrhotiske væv fra patienter uden HCC og tilstødende cirrhotiske væv fra patienter med HCC (data ikke vist).
Diskussion
I den foreliggende undersøgelse, vi har analyseret kvantitativt methylering profil
RASSF1A
DOK1
promoter gener i ikke-cirrotiske og cirrotiske lever uden HCC, samt i HCC og cirrhotiske parrede prøver. Begge gener har tumor suppressor egenskaber og er involveret i flere vigtige cellulære processer.
RASSF1A
er impliceret i Ras-signalvejen, som spiller en central rolle i cellecykluskontrol, stabilisering mikrotubuli, cellulær adhæsion, celle motilitet, og apoptose [17].
DOK1
udtrykkes i B- og T-celler samt i myeloide celler (makrofager og neutrofiler), og er involveret i en lang række immunoreceptorfusionsmolekyler signalveje [18]. Heri
RASSF1A
DOK1
methylering niveauer viste en gradvis stigning i henhold til udviklingen af sygdommen, med betydeligt højere niveauer i tumorvæv. Derudover observerede vi meget høje
RASSF1A Hotel (88%) og
DOK1 Hotel (88%) hypermethylering i HCC prøver, med en samtidig hypermethylering på 82%. Tidligere studier med anvendelse af forskellige metoder samt forskellige sæt CpG’er, også har fundet høj (76-100%) frekvenser af
RASSF1A
hypermethylering i HCC [10, 19-21]. På den anden side, er tilgængelige på methylering profil
DOK1
i leverkræft få data. Et studie rapporterede forekomst af hypermethylering i størstedelen (62%) af HCC væv [10]. Vores resultater styrker dermed hypotesen om en sammenhæng mellem epigenetisk inaktivering af disse centrale cellulære gener og hepatocarcinogenese. Notatet, fandt vi samtidig
RASSF1A
DOK1
hypermethylering i næsten 30% af de cirrotiske analyserede væv. Aberrant methylering blev fundet ikke kun i cirrotiske prøver fra patienter med HCC, men også hos dem uden HCC, hvilket antyder, at forøgelsen af methylering niveauer i en undergruppe af cirrotiske væv på grund af tilstedeværelsen af visse tumorceller er usandsynlig. Disse resultater er i overensstemmelse med forestillingen om, at afvigende methylering i ikke-transformerede hepatocytter kan gå forud for deres onkogen transformation og fremme udviklingen af leverkræft.
Den potentielle indflydelse af etnicitet i DNA methylering er ikke blevet grundigt undersøgt. Imidlertid har tidligere rapporter beskrevet betydelige forskelle i den globale genomisk DNA methylering efter etnicitet [22, 23]. Det er blevet foreslået, at nogle genetiske polymorfier, såsom dem af folat enzymer, kan bidrage til de etniske forskelle i DNA-methylering [24]. Lambert et al. [10] har vist en sammenhæng mellem methylering niveauer i flere gener og geografisk område, med HCCs udstiller
RASSF1A
DOK1
methylering niveauer lavere i Thailand end i Frankrig. Vores undersøgelse har påberåbt sig et sæt CpG’er analyseret tidligere, og målte DNA methylering niveauer ved den kvantitative pyrosekventering metoden [10]. Interessant, vi observerede højere
RASSF1A
DOK1
methylering niveauer i brasilianske HCC prøver sammenlignet med dem fra Thailand (2,7 og 3,1 gange) og Frankrig (1,9 og 1,8 gange), hhv. Disse resultater bekræfter forestillingen om, at genetiske og /eller miljømæssige faktorer kan bidrage til de etniske /geografiske forskelle i DNA-methylering blandt HCC tilfælde.
Flere undersøgelser har undersøgt mulige sammenhænge mellem risikofaktorer (HBV og HCV-infektioner) eller klinisk funktioner (alder, køn og histologi) og DNA-methylering i HCC [9, 10, 19-21, 25]. Promotor-associerede CpG ø methylering er blevet betragtet som en af de mest fremtrædende molekylære ændringer, der kan observeres i aldrende [26]. Bemærkelsesværdigt, har en tidligere undersøgelse vist, at alle patienter over 40 år havde
RASSF1A
promotor methyleret i ikke-neoplastiske celler i leveren [27]. Men vi observeret højere niveauer af
RASSF1A
DOK1
methylering i HCC væv af den yngre gruppe ( 40 år), med en statistisk signifikant forskel mellem
DOK1
methylering og alder (
s
= 0,036). Heri blev alle HCC patienter under 40 år kronisk inficeret med HBV, og man kan formode, at disse patienter blev inficeret længe siden, sandsynligvis gennem vertikal overførsel. Flere undersøgelser har vist, at HBV X-proteinet (HBx) stiger total DNA methyltransferase (DNMT) aktiviteter ved opregulering af DNMTs, fremme hypermethylering af specifikke tumorsuppressorgener [28]. Derfor kan virale status af de yngste patienter har bidraget til de højere methylering observerede niveauer i vores undersøgelse. Ikke desto mindre har tidligere undersøgelser også fundet højere niveauer af
RASSF1A
DOK1
methylering i HCC prøver i de yngre grupper, selvom forskellene ikke var statistisk signifikante [9, 10]. Desuden betydeligt højere niveauer af
DOK1
methylering i cirrhotiske væv i aldersgruppen 40 år har været tidligere rapporteret [10]. Endelig fandt vi, at niveauer af
RASSF1A
DOK1
methylering var højere i moderat differentiated- end i dårligt differentierede HCCs, med en signifikant forskel i
DOK1 Hotel (
s
= 0,005). Ingen af HCC patienter indgår i vores undersøgelse havde godt differentierede tumorer, så der ikke kunne opnås en bedre sammenligning mellem DNA methylering og tumor kvalitet af differentiering. I et tidligere arbejde,
RASSF1A
methylering var næsten lige uanset HCC differentiering [9], mens der er ingen rapporter om
DOK1
methylering og HCC kvalitet af differentiering til dato.
Som konklusion, dette er den første rapport om de epigenetiske faktorer forbundet til HCC i Brasilien. Vores resultater bekræfter, at hypermethylering af
RASSF1A
DOK1
bidrager til hepatocarcinogenese og er en tidlig begivenhed i cancer udvikling, sandsynligvis forbundet til kliniske karakteristika samt større risikofaktorer. Derfor
RASSF1A
DOK1
afvigende methylering kan være et værdifuldt biomarkør for tidlig diagnosticering af HCC og et attraktivt molekylære mål for epigenetisk-baseret behandling. Ikke-invasive metoder, såsom dem måling hypermethylering af det cirkulerende celle-frit DNA i serum /plasma, bør fremmes.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.