PLoS ONE: OncomiR miR-125b Undertrykker p14ARF at modulere p53-afhængige og p53-uafhængig apoptose i prostata Cancer

Abstrakt

MikroRNA’er er en klasse af naturligt forekommende små ikke-kodende RNA, der er målrettet protein-kodende mRNA på post-transkriptionel niveau og regulere komplekse mønstre af genekspression. Vores tidligere undersøgelser vist, at miRNA

MIR-125b

i human prostatacancer udtrykkes kraftigt, hvilket fører til en negativ regulering af nogle tumorsuppressorgener. I denne undersøgelse har vi yderligere udvide vores studier ved at vise, at

MIR-125b

undertrykker proteinproduktet af INK4a /ARF locus, p14

ARF, i to prostata cancer cellelinjer, LNCaP (wild type- p53) og 22R

v

1 (både vildtype og mutant p53), samt i PC-346C prostatacancer xenograft model, lentivirally overudtrykt

mIR-125b

. Vores resultater fremhæve, at

miR-125b

modulerer p53-netværket ved at hindre nedregulering af Mdm2 og dermed påvirke p53 og dets målgener p21 og Puma i en grad tilstrækkelig til at hæmme apoptose. Omvendt behandling af prostatacancer celler med en inhibitor af

miR-125b Hotel (anti-

miR-125b

) resulterede i forøget ekspression af p14

ARF, nedsat niveau af Mdm2, og induktion af apoptose. Desuden overekspression af

MIR-125b

i p53-deficiente PC3-celler induceret nedregulering af p14

ARF, hvilket fører til øget celleproliferation gennem en p53-uafhængig måde. Således konkluderer vi, at

miR-125b

fungerer som et onkogen, som regulerer p14

ARF /Mdm2 signalering, stimulere proliferation af prostata cancer celler gennem en p53-afhængig eller p53-uafhængig funktion. Dette styrker vores tro på, at

miR-125b

har potentiale som en terapeutisk mål for behandling af patienter med metastatisk prostatacancer

Henvisning:. Amir S, Ma AH, Shi XB, Xue L, Kung HJ, DeVere White RW (2013) OncomiR

miR-125b

Undertrykker P14

ARF at modulere p53-afhængige og p53-uafhængig apoptose i prostatakræft. PLoS ONE 8 (4): e61064. doi: 10,1371 /journal.pone.0061064

Redaktør: Matthew L. Anderson, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: 22 oktober, 2012; Accepteret: 6 marts 2013; Udgivet: April 9, 2013 |

Copyright: © 2013 Amir et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Støttet af NCI tilskud CA136597 og Department of Defense tilskud PC080488. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

metastatisk prostatacancer (CaP), ved at udvikle sig til kastrationsresistent CaP (CRPC), udgør en stor trussel mod livet i amerikanske mænd, hvilket resulterer i anslået 28,170 dødsfald af denne sygdom i 2012 [1]. Patienter med metastatisk CaP sædvanligvis behandlet med androgen deprivation terapi (ADT). Desværre, svigt af ADT uundgåeligt opstår og patientens tumor bliver CRPC. Det er kendt, at CaP-celler under CRPC progression bruger en række androgen receptor (AR) -afhængig og uafhængige veje til at overleve og trives i et androgen-udtømte miljøet [2]. Selvom flere forsøg er blevet gjort for at karakterisere den molekylære underskrift CRPC er de præcise mekanismer, der fører til CRPC ikke fuldstændigt forstået. I de senere år har opdagelsen af ​​microRNA (miRNA) afdækket et nyt lag af kompleksitet, der regulerer de mekanismer, der er involveret i regulering CRPC [3], [4].

MikroRNA’er er små ikke-kodende RNA, der fungerer som sekvensspecifikke regulatorer af genekspression gennem translationel undertrykkelse og /eller udskrift spaltning [5]. Undersøgelser har vist, at miRNA spiller nøgleroller i cellulære processer differentiering, proliferation, apoptose og metabolisk homeostase [6]. Desuden kan miRNA fungere som enten tumorsuppressorer eller onkogener, alt efter om de specifikt retter sig mod onkogener eller tumorsuppressorgener [7]. I denne henseende tumor undertrykkende miRNA er normalt under-udtrykt mens onkogene miRNA tendens til at være overudtrykt i cancer [8]. Undersøgelser har vist, at

miR-125b

er onkogen. Overekspression af

miR-125b

blev rapporteret i tyktarmskræft [9], blærekræft [10], ovariecancer [11] og leukæmi [12]. Vi har tidligere rapporteret, at kliniske CaP-tumorer udtrykker forøgede niveauer af

MIR-125b

sammenlignet med benigne væv [13]. Derudover har flere undersøgelser vist, at

miR-125b

er stærkt udtrykt i CaP, især i metastatiske og invasive CaP tumorer [14], [15]. For nylig undersøgte vi funktionen af ​​

miR-125b

observeret, at overekspression af

miR-125b

fremmet xenograft tumorvækst i både intakte og kastrerede mus [16]. Desuden viste vi, at

miR-125b

direkte retter sig mod flere tumor undertrykkende og proapoptotiske gener, herunder p53, BAK1 og Puma [13], [16].

Den cellulære niveau og aktivitet af p53 er vedligeholdes af et komplekst kredsløb bestående af p14

ARF /Mdm2 /p53 [17]. p14

ARF blev bekræftet at være en potent tumorsuppressor både

in vitro

in vivo

[18] og er blevet foreslået at være den vigtigste medlem af denne overvågning kredsløb. Ekspression af p14

ARF induceres som respons på aktiverede onkogener såsom Ras [19], c-Myc [20], Abl [21] og E2F-1 [22] samt under replikativ senescens [23]. p14

ARF medierer binding og efterfølgende nedbrydning af p53-antagonisten Mdm2 gennem ubiquitin /proteasom-vejen, hvilket resulterer i stabilisering (øget halveringstid) af p53 [17] og den deraf følgende aktivering af dens downstream target gener, såsom p21 (cyclin-afhængig kinase inhibitor 1A), Puma (p53-opreguleret mediator af apoptose), og Bax (BCL2-associeret X protein) [24], [25]. Da disse molekyler er centrale komponenter i p53 netværk, kan modulation af deres ekspression forstyrre den normale balance mellem apoptose og celleproliferation. Denne observation underbygges yderligere af vores undersøgelser viser, at inaktivering eller nedregulering af p53, Puma og BAK1 af

miR-125b

er associeret med CRPC [13], [16].

Til yderligere at belyse rollen af ​​

mIR-125b

i udviklingen af ​​CRPC og dens underliggende molekylære mekanismer, i denne undersøgelse undersøgte vi involvering af

mIR-125b

i modulering af p53-netværket ved at målrette p14

ARF, hvilket understøttes af vores identifikation af en potentiel

miR-125b

bindingssted i 3’UTR af

P14

ARF

gen. Vi forventer, at vores undersøgelser for at give ny indsigt i de molekylære mekanismer relateret til tumorigenese og kastrationsresistent vækst CaP og hjælp i at lette anvendelsen af ​​

miR-125b

som et mål for CaP behandling.

Materialer og metoder

Antistoffer og reagenser

For Western blotting-analyse, anti-P14

ARF (sc-8340), anti-Mdm2 (sc-965), blev købt fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA); anti-BAK1 (3814), anti-Mcl-1 (4572), anti-Bcl-X

L, anti-caspase 3 (9662), anti-SMAC (2954) og anti-p21 (DCS60) blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA); anti-Puma (PC686), anti-p53 (OP43) fra Calbiochem (Billerica, MA); anti-β-actin (klon AC-15) fra Sigma (St. Louis, MO). Syntetisk

miR-125b

efterligner (miR-125bm), miRNA negative kontrol (miR-NC), anti-

miR-125b

og anti-miRNA negative kontrol (anti-miR-NC) samt pMIR-RAPPORT Luciferase vektoren blev købt fra Ambion (Grand Island, NY). Begge

p14ARF

siRNA (sip14) og

BAK1

siRNA (siBak) blev købt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).

cellelinjer og transfektion

Humant CaP cellelinier PC3, 22R

v

1 og LNCaP blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Alle cellelinier blev rutinemæssigt opretholdt i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum indeholdende antibiotika og multivitaminer. For transient transfektion blev celler udpladet på plader med 6 brønde dagen før transfektion og opretholdt i serumholdigt medium uden antibiotika. Den følgende dag blev celler transficeret med enten miRNA eller siRNA anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Grand Island, NY) ifølge producentens instruktioner.

Western blot-analyse

Celler blev dyrket til 70-80 % konfluens og lyseret ved hjælp af cellen lysisbuffer (Cell Signaling Technology) suppleret med phenylmethylsulfonylfluorid (1 mmol /l). Efter 20 minutters inkubation på is blev lysater centrifugeret ved 13.000 RPM i 20 minutter og proteinkoncentrationer i supernatanten blev bestemt under anvendelse BCA kit (Pierce, Rockford, IL). Totalt protein (50 ug per prøve) i 3 × protein prøvepuffer [50 mmol /L Tris-HCI (pH 6,8), 2% SDS, 10% glycerol, 0,25% β-mercaptoethanol, bromphenolblåt (1 mg /ml)] blev separeret på SDS-polyacrylamidgel (Bio-Rad, Hercules, CA), og derefter overført til Immobilon PVDF-membran (Millipore, Billerica, MA). Efter blokering med 5% fedtfri tørmælk i Tris-bufret saltvand /0,05% Tween 20 (TBST) blev membranen inkuberet med et specifikt primært antistof efterfulgt af peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof. Proteinbånd blev vist ved forøget kemiluminescens. Ekspressionsniveauet af protein blev målt ved kvantitativ densitometrisk analyse.

Luciferase assay

menneskelige

p14

ARF

3′-UTR-sekvens indeholdende det formodede

mIR-125b

bindingssted blev amplificeret ved PCR fra LNCaP-cDNA og klonet ind i pMIR-RAPPORT luciferase vektor nedstrøms for luciferasegenet.

P14

ARF

3′-UTR mangler dette

miR-125b

bindingssted blev anvendt som kontrol. PCR-produkterne klonet i plasmidet blev verificeret ved DNA-sekventering. For luciferase assay celler (4 x 10

4 per brønd) blev podet i plader med 24 brønde og dyrket i 24 timer. Cellerne blev derefter co-transficeret med reporter plasmider og 100 nM syntetisk MIR-125bm eller MIR-NC. PRL-SV40 Renilla luciferase plasmid (Promega, Madison, WI) blev anvendt som en intern kontrol. To dage senere blev celler høstet og lyseret med passiv lysepuffer (Promega). Luciferaseaktivitet blev målt ved anvendelse af en dobbelt luciferase reporter assay (Promega). Luciferaseaktivitet blev normaliseret ved Renilla luciferaseaktivitet.

Co-immunopræcipitationsassay

Proteinet interaktion mellem p14

ARF og Mdm2 blev påvist ved co-immunopræcipitationsassay. Total proteinlysater fra MIR-125bm- eller MIR-NC-transficerede 22R

v Salg 1-celler blev fremstillet i cellen lysisbuffer. Protein (1,0 mg /0,5 ml) blev præ-blokerede ved blanding med 20 pi protein A perler og supernatanten blev immunopræcipiteret ved 4 ° C natten over med et kanin-anti-p14

ARF polyklonalt antistof eller normalt kanin IgG (Cell Signaling Teknologi). De udfældede proteiner blev fraktioneret i en 12% SDS-PAGE-gel efterfulgt af Western blotting påvisning af Mdm2 protein under anvendelse af anti-Mdm2 antistof.

TUNEL assay

TUNEL-assayet blev udført under anvendelse af en

in situ

påvisning celledød kit (Roche, Indianapolis, IN) ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt, p53-positive 22R

v

1 eller p53-nul-PC3-celler (1 x 10

5 /brønd) blev podet i individuelle brønde i 4-brønds kammerobjektglas. Efter 24 timer blev celler transficeret med 50 nM

miR-125b

, 50 nM anti-

miR-125b

100 nM sip14, alene eller i forskellige kombinationer. Ubehandlede og bestrålede celler blev anvendt som negative og positive kontroller. Mediet blev fjernet 72 timer efter transfektion og objektglas blev skyllet to gange med PBS, fikseret i en fiksering opløsning (4% paraformaldehyd i PBS, pH 7,4) i 1 time ved stuetemperatur. Efter fiksering blev objektglassene skyllet to gange med PBS og inkuberet i permeabilisering opløsning (0,1% Triton X-100) i 2 minutter på is. 50 pi af reaktionsblandingen TUNEL (50 pi enzymopløsning + 450 pi label opløsning) blev tilsat til hvert objektglas. For den negative kontrol blev kun 50 pi af etiketten opløsning tilsat. DAPI blev anvendt som et nukleart kontrastfarve. Slides blev inkuberet i en fugtig atmosfære i 60 minutter ved 37 ° C i mørke. Fluorescens mikroskopi blev udført for at visualisere celler og erhverve digitale billeder under anvendelse af en excitationsbølgelængde i området 450-500 nm og detekteres i intervallet 515-565 nm.

WST-1 assay

celler (4,5 x 10

3 /brønd) blev udpladet i plader med 96 brønde i RPM1 medium indeholdende 10% FBS. Efter at have været dyrket i 24 timer blev celler transficeret med 50 nM

miR-125b

eller anti-

miR-125b

. Efter fem timer blev celler behandlet med frisk medium. Tetrazolium-baseret celleproliferationsassay (WST-1, Promega) blev udført ifølge producentens protokol.

Colony assay

22R

v

1 (3 × 10

3 /brønd) og LNCaP (4 × 10

3 /brønd) blev separat udpladet i seks-brønds plader og transficeret med

mIR-125b

eller anti-

mIR-125b

ved en koncentration på 100 nM under anvendelse af lipofectamin 2000. efter to uger blev cellekolonier talt efter farvning i 20% methanol og krystalviolet.

Resultater

mIR-125b

nedregulerer P14

ARF i Cap celler

Tidligere undersøgelser viste, at tumorsuppressorgen p14

ARF er betydeligt nedreguleret i Cap væv [26]; Men hvordan P14

ARF nedreguleres forblev dårligt forstået. Brug af Targetscan algoritme, en potentiel

miR-125b

bindingssted blev identificeret i 3-‘UTR af

P14

ARF

mRNA. Vi undersøgte derfor effekten af ​​

miR-125b

om regulering af p14

ARF i Cap celler. For at gøre dette, LNCaP og 22R

v

1 celler blev transficeret med syntetisk miR-125bm at ophøje den cellulære

miR-125b

overflod, eller med anti-

miR-125b

at undertrykke

miR-125b

aktivitet. Som vist ved Western blot og kvantitativ densitometrisk analyser, sammenlignet med MIR-NC behandling, MIR-125bm induceret reduktion af p14

ARF ekspression med 80% i LNCaP-celler (figur 1A, øverste panel) og 60% i 22R

v

1 (figur 1A, bundpanel). Omvendt anti-

miR-125b

øget p14

ARF niveau med 40% i LNCaP (figur 1A, øverste panel) og 30% i 22R

v

1 (figur 1A, bundpanel) sammenlignet med anti-mIR-NC. Vores tidligere undersøgelse viste, at androgen opregulerer

miR-125b

i Cap celler [13]. Således blev LNCaP og 22R

v

1-celler behandlet med 5,0 nM R1881 androgen og ekspressionsniveauet af p14

ARF blev bestemt. Det konstateredes, at R1881 behandling inducerede en 80% reduktion af p14

ARF i LNCaP og 20% ​​fald i 22R

v

1 (figur 1A). Vi undersøgte også niveauet af p14

ARF i en

miR-125b

-overexpressed PC-346C mus xenograft tumor [16], og fandt, at niveauet af p14

ARF protein blev reduceret med 60 % i

miR-125b

-overexpressed tumor i forhold til miR-NC-kontrol tumor (figur 1B). For at bestemme, om den formodede

miR-125b

bindingssted i 3′-UTR af P14

ARF mRNA er ansvarlig for reguleringen af ​​p14

ARF af

miR-125b

, luciferase reporter vektorer indeholdende 3′-UTR-fragmentet af

p14

ARF

genet blev co-transficeret med mIR-125bm i LNCaP-celler. Som vist i figur 1C, cotransfektion resulterede i en reduktion på ca. 50% af enzymaktiviteten i LNCaP-celler. Vi udførte også luciferase assay 22R

v

1-celler og et lignende resultat blev observeret (data ikke vist). Tilsammen resultaterne vist i figur 1 validere reguleringen af ​​p14

ARF af

miR-125b

i Cap celler.

A

) Western blot analyse af ekspressionsniveauer for p14

ARF i LNCaP (

top

) og 22Rv1 celler (

bund

). Celler dyrket i 10% FBS medier blev transficeret med 50 nM miR-125bm eller anti-

miR-125b

(anti-125b) i 72 timer eller behandlet med 5,0 nM R1881 androgen i 48 timer. Derpå blev 50 ug protein per prøve analyseret. Både MIR-negativ kontrol (MIR-NC) og anti-miR negativ kontrol (anti-NC) blev anvendt som kontroller, og β-actin blev anvendt som en loading kontrol.

B

) Western blot analyse af ekspressionsniveauer af p14

ARF, MDM2 og p53 i lenti-

miR-125b

-overexpressed PC-346C xenograft tumor. Både ubehandlede xenograft (untreat.) Og Lenti-miRNA styrevektor-inficerede PC-346C xenograft (vektor) blev anvendt som kontroller. I begge

A

og

B

, tallene under geler er de gennemsnitlige fold ændringer i p14

ARF protein fra tre uafhængige geler i forhold til de tilsvarende kontroller. Fold ændringer blev beregnet ved at scanne P14

ARF bands og normalisering for p-actin bands.

C

) Luciferase assay af

miR-125b

binding til 3′-UTR af

P14

ARF

mRNA i LNCaP celler. Assayet blev gentaget tre gange med hver analyse udføres i tre brønde og lignende resultater blev opnået hver gang. De repræsentative resultater er vist som et gennemsnit ± SD (n = 3).

miR-125b

-p14

ARFsignaling regulerer p53 netværket

Undersøgelser har vist, at p14

ARF accelererer Mdm2 nedbrydning, hvilket resulterer i p53 opregulering [27]. Vi spurgte derfor: gør nedregulering af P14

ARF af

miR-125b

påvirke ekspressionen af ​​Mdm2 og p53 i Cap celler? For at løse dette problem, blev LNCaP og 22R

v

1 celler behandlet med miR-125bm og niveauerne af Mdm2 og p53 blev derefter undersøgt. Sammenlignet med MIR-NC, behandling LNCaP-celler med

MIR-125b

inducerede en dramatisk stigning i Mdm2 ekspression og en markant reduktion af p53-niveau (figur 2A, top panel). Tilsvarende i 22R

v

1 celler,

miR-125b

behandling forbedres også Mdm2 udtryk og reduceret p53 niveau (figur 2A, nederste panel). Som forventet, miR-125bm-medieret nedregulering af p53 induceret betydelig reduktion af to direkte p53 effektorer, p21 og Puma. Ligeledes i

MIR-125b

-overexpressed PC-346C xenograft tumor, Mdm2 ekspression blev forøget tre gange og p53-protein blev nedreguleret med 83% sammenlignet med vektorkontrol (figur 1B). For at bekræfte de efterfølgende resultater fra hæmning af p14

ARF, vi brugte

P14

ARF

siRNA (sip14) at lukke munden P14

ARF i LNCaP og 22R

v

1 celler. Som vist ved immunoblotting, sip14 behandling nedsatte signifikant ekspression af p14

ARF protein og efterfølgende opreguleres Mdm2 niveau og nedreguleret ekspression af p53 (figur 2B). Da p14

ARF direkte binder til C-terminalen af ​​Mdm2, undersøgte vi virkningen af ​​

MIR-125b

på protein-interaktion mellem p14

ARF og Mdm2 ved co-immunoudfældning i 22R

v

1 cap celler. Vi observerede, at Mdm2 kan detekteres fra anti-p14

ARF antistof-udfældede proteiner, ikke fra kontrol IgG-koblede proteiner, hvilket indikerer, at endogent p14

ARF er stand til at danne et kompleks med Mdm2. Behandling med

MIR-125b

nedreguleret p14

ARFprotein, hvilket resulterer i en reduktion af immunopræcipiteret Mdm2 (figur 2C). Tilsammen data vist i figur 2 dokumentere, at

miR-125b

regulerer p14

ARF /Mdm2 /p53 signalvej.

A

) Western blot-analyse af Mdm2 og p53 i miR-125bm-behandlede LNCaP (

top

) og 22R

v

1 celler (

bund

). Celler blev transficeret med 50 nM af MIR-125bm eller MIR-negativ kontrol (MIR-NC) i 72 timer. Lige store mængder protein (50 ug) blev anvendt til at detektere ekspressionsniveauerne af Mdm2, p53, p21 og Puma.

B

) Western blot analyse af p14

ARF, Mdm2 og p53 i

P14

ARF

siRNA (sip14) -behandlede LNCaP (

top

) og 22R

v

1 celler (

bund

). Celler blev behandlet med sip14 og cellulære niveauer af p14

ARF, p53 og Mdm2 blev analyseret. β-actin blev anvendt som en loading kontrol.

C

) Co-immunoprecipitation analyse af protein interaktion mellem p14

ARF og Mdm2 i 22R

v

1 celler. Celler blev transficeret med MIR-125bm og 1,0 mg protein blev immunpræcipiteret med anti-p14

ARF antistof eller kanin IgG. De resulterende immunecomplexes blev anvendt til at påvise niveauet af Mdm2 ved Western blot-analyse under anvendelse af anti-Mdm2 antistof. Input: 50 ug protein fra total cellelysat. IP: immunopræcipitation. IB:. Immunblotting

miR-125b

stimulerer proliferation af Cap celler

Efter at have fastslået reguleringen af ​​p14

ARF /Mdm2 /p53 signalvejen ved

miR-125b

, vi næste undersøgt effekten af ​​reguleringen af ​​p14

ARF af

miR-125b

på CaP celleproliferation. For at gøre dette, både LNCaP celler og 22R

v

1 celler blev transficeret med syntetisk miR-125bm og celledeling blev bestemt ved WST-1 analysen. Som vist i figur 3A og 3B, sammenlignet med MIR-NC behandling, transfektion med MIR-125bm resulterede i en 1,5 gange stigning i celleproliferation i begge testede cellelinier. Derudover udførte vi klon formation assays. Svarende til WST-1 resultater,

MIR-125b

stimulerede en 1,0 gange stigning i klonogene overlevelse LNCaP-celler og 2,5 gange forøgelse i 22R

v

1-celler, og tilsætningen af anti-

mIR-125b

forårsagede en dramatisk reduktion i antallet af kolonier i sammenligning med de ubehandlede og anti-mIR-NC-celler (data ikke vist). Disse data understøtter, at nedregulering af p14

ARF af

miR-125b

letter væksten af ​​Cap celler.

Celler blev transficeret med 50 nM miR-125bm eller 50 nM af miRNA negativ kontrol (mIR-NC) i 5 dage. Celleproliferation blev målt ved WST-1 assay.

P14

ARF

siRNA (sip14) blev anvendt som kontrol. Resultaterne er udtrykt som proliferation forhold til den for MIR-NC-behandlede celler, og vist som middelværdi ± SD (n = 4).

Anti

MIR-125b

induceret apoptose i Cap celler, der udtrykker funktionel p53

Da

miR-125b

regulerer p14

ARF /Mdm2 signalering og efterfølgende påvirker p53 netværk, vi evaluerede effekten af ​​nedregulering af P14

ARF af

miR-125b

på apoptose i p53-positiv CaP celler. Først testede vi udgivelsen af ​​mitokondrie SMAC (anden mitokondrier-afledte aktivator af caspase) og aktiveret caspase 3 (Cas-3) i LNCaP og 22R

v

1 cellelinjer, der udtrykker funktionel p53. Sammenlignet med miR-NC behandling, miR-125bm forårsagede 10% reduktion af SMAC og 40% reduktion af aktiverede Cas-3 i LNCaP celler, og reduktionen var 20% og 30% i 22R

v

1 celler henholdsvis (figur 4A). Disse cellelinier blev også behandlet med anti-

miR-125b

. Sammenlignet med anti-MIR-NC behandling, nedregulering af

MIR-125b

aktivitet induceret ca. en gange stigning i SMAC og aktiveret Cas-3 (figur 4A). Da anti-

miR-125b

opregulerer SMAC og aktiveret caspase 3, vi således analyseret anti-

miR-125b

induceret apoptotisk celledød ved hjælp af en TUNEL assay. 22R

v

1 celler blev transficeret med miR-125bm eller anti-

miR-125b

. Ingen apoptotisk celledød blev observeret i miR-125bm-behandlede 22R

v

1 celler. I modsætning hertil behandling af 22R

v

1-celler med anti-

MIR-125b

forårsagede 63% af cellerne til at undergå apoptose (figur 4B). For at validere, at

miR-125b

modulerer p53-afhængig apoptose gennem P14

ARF, 22R

v

1 celler blev behandlet med anti-

miR-125b

efterfulgt af

P14

ARF

lyddæmpning. Det blev konstateret, at antisense til

P14

ARF

(sip14) faldt dramatisk apoptotisk død i

miR-125b

-inactivated 22R

v

1 celler (figur 4C) . Som forventet,

P14

ARF

dæmpning stimuleret proliferation af disse 22R

v

1 celler (data ikke vist). Desuden blev ekspressionsniveauerne af flere pro-apoptotiske faktorer vurderes med Western blot-analyse. Faktisk behandling med anti-

miR-125b

inducerede en opregulering af p14

ARF protein i 22R

v

1 celler, mens tilsætning af sip14 resulteret i indlysende nedregulering af P14

ARF (60%), p53 (30%) og BAK1 (70%), sammenlignet med scramble siRNA behandling (figur 4D). Disse data tyder på, at

miR-125b-service /P14

ARF signalering mål p53 netværket, regulering p53-afhængig proliferation og apoptose i Cap celler.

A

) Påvisning af SMAC og aktiveret caspase 3 (Cas-3) i LNCaP (

venstre

) og 22R

v

1 (

højre

) celler. Celler blev transficeret med 50 nM miR-125bm eller 50 nM anti-

miR-125b

(anti-125b) i 5 dage, og niveauerne af SMAC og Cas-3 blev målt ved Western blot-analyse. p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. Tallene under geler er de gennemsnitlige fold ændringer i SMAC og Cas-3 fra tre uafhængige geler i forhold til de tilsvarende kontroller.

B

) Påvisning af anti-

miR-125b

induceret apoptose i 22R

v

1 celler. Celler blev transficeret under anvendelse af 50 nM anti-

MIR-125b

i 72 timer og apoptotisk celledød blev påvist under anvendelse TUNEL assay. Den grønne nukleare fluorescens angiver apoptotiske spaltning af kerne-DNA (

venstre

). Til kvantificering af apoptotisk celledød, blev 400 celler talt og apoptose udtrykkes som% apoptose (apoptotiske celler /400 x 100%). Kvantitativ analyse blev udført tre gange, og resultatet blev udtrykt som gennemsnit ± SE (n = 3) (

højre

). Celler behandlet med bestråling (IR, 6 Gy) blev anvendt som en positiv kontrol.

C

) TUNEL analyse af apoptotisk død 22R

v

1 celler, der blev behandlet med anti-

miR-125b

efterfulgt af

P14

ARF

antisense (sip14). Resultatet blev udtrykt som gennemsnit ± SE (n = 3).

D

) Western blot-analyser af p14

ARF, p53 og BAK1 niveauer i 22R

v

1 celler.

Venstre

: 22R

v

1 celler blev transficeret med anti-

miR-125

;

højre

: anti-

miR-125

transficerede 22R

v

1 celler blev behandlet med sip14. Både anti-miR-NC (anti-NC) og kapløbet siRNA blev anvendt som kontroller.

miR-125b-service /P14

ARF signalering medierer p53-uafhængig væksthæmning

i de ovennævnte forsøg, vi valideret, at

miR-125b-service /P14

ARF signalering er involveret i p53-afhængige mekanismer i Cap celler. undersøgelser viste imidlertid, at inaktivering af p53-funktion forekommer i en del af patienter med metastatisk CaP [28], [29]. Er

miR-125b-service /P14

ARF signalering regulere cellevækst og apoptose i disse p53-mangelfuld hætter? Vi brugte p53-nul PC3 CaP celler til at løse dette problem. Vi undersøgte indflydelsen af ​​ændrede

MIR-125b

aktivitet på ekspressionsniveauerne af p14

ARF og MDM2 proteiner. Svarende til, at der i p53-funktionelle LNCaP og 22R

v

1 celler, miR-125bm transfektion faldt udtryk for P14

ARF med 36% og øgede Mdm2 med 43% i PC3 celler, mens anti-

mIR-125b

inducere en indlysende opregulering af p14

ARF og en svag undertrykkelse af Mdm2 (figur 5A). Vi næste testede, om

miR-125b

påvirker spredning og apoptose af PC3 celler. Til dette formål blev PC3-celler behandlet med anti-

MIR-125b

og apoptotiske celler blev påvist med TUNEL-assayet. Det blev fundet, at behandling med anti-

MIR-125b

forårsagede 50% af disse celler til at undergå apoptose (figur 5B). Da BAK1 blev rapporteret at mægle P14

ARF-induceret apoptose i p53-mangelfulde celler [30], vi evaluerede effekten af ​​

BAK1

tavshed om spredning af miR-125bm-transfekterede PC3 celler. Det blev konstateret, at MIR-125bm inducerede en 1,6-fold stigning i overlevelse for PC3 celler (figur 5C), understøtter tidligere observation, at p14

ARF /Mdm2 signalering bidrager til en p53-uafhængig mekanisme [31]. For at bekræfte reguleringen af ​​p53-uafhængig apoptose ved

miR-125b-service /P14

ARF signalering,

miR-125b

aktivitet blev undertrykt med anti-

miR-125b

og

P14

ARF

blev bragt til tavshed af RNAi. Vi observerede, at

P14

ARF

lyddæmpning faldt betydeligt apoptotiske død

miR-125b

-inactivated PC3 celler (figur 5D), og også stimuleret deres proliferation (data ikke vist). Derudover ekspressionsniveauerne af p14

ARF og BAK1 blev analyseret. Man fandt, at

miR-125b

inaktivering inducerede en opregulering af p14

ARF, mens

P14

ARF

lyddæmpning vendt opregulering af p14

ARF (60%) og inducerede også en nedregulering af BAK1 (figur 5E). En tidligere undersøgelse rapporterede, at både Bcl-X

L og Mcl-1 middelbare p14

ARF-induceret p53-uafhængig apoptose. blev således analyseret Disse to anti-apoptotiske faktorer. Vi har ikke observere deres ændring i

miR-125b

-inactivated,

P14

ARF

-silenced PC3 celler (figur 5D). Tilsammen disse data viser, at

miR-125b-service /P14

ARF signalering er i stand til at regulere vækst og apoptose i p53-mangelfulde CaP celler.

A

) Påvisning af p14

ARF og MDM2 niveauer i p53-nul PC3 celler. Celler blev transficeret med 50 nM miR-125bm eller anti-

miR-125b

i 72 timer. Ekspressionsniveauerne for både p14

ARF og Mdm2 blev analyseret ved Western blot-assay. β-actin blev anvendt som en loading kontrol.

B

) Påvisning af anti-

miR-125b

induceret apoptose i PC3 celler. Celler blev transficeret under anvendelse af 50 nM anti-

MIR-125b

i 72 timer og apoptotisk celledød blev påvist under anvendelse TUNEL assay. Den grønne nukleare fluorescens angiver apoptotiske spaltning af kerne-DNA (

venstre

). Til kvantificering af apoptotisk celledød, blev 400 celler talt og apoptose udtrykkes som% apoptose (apoptotiske celler /400 x 100%). Kvantitativ analyse blev udført tre gange, og resultatet blev udtrykt som gennemsnit ± SE (n = 3) (

højre

). Celler behandlet med bestråling (IR, 6 Gy) blev anvendt som en positiv kontrol.

C

)

MIR-125b

fremmer væksten af ​​p53-nul,

BAK1

-silenced PC3 celler. Celler blev behandlet med 50 nM MIR-125m i 5 dage og celleproliferation blev målt under anvendelse WST-1 assay. Resultaterne er udtrykt som vækstinhibering forhold til den for MIR-NC (gennemsnit ± SD, n = 4). Indsat: BAK1 udtryk i

BAK1

-silenced PC3 celler.

D

) TUNEL analyse af apoptotisk død PC3 celler, der blev behandlet med anti-

miR-125b

efterfulgt af

P14

ARF

antisense (sip14). Resultatet blev udtrykt som gennemsnit ± SE (n = 3).

E

) Western blot-analyser af p14

ARF og BAK1 niveauer i PC3 celler.

Top

: PC3 celler blev transficeret med anti-

miR-125

;

bund

: anti-

miR-125

transficerede PC3 celler blev behandlet med sip14. Både anti-miR-NC (anti-NC) og kapløbet siRNA blev anvendt som kontroller.

Diskussion

De seneste observationer af afvigende miRNA udtryk i forskellige menneskelige kræftformer har understreget betydningen af miRNA i mange biologiske processer [5].

MIR-125b

er en bredt bevaret miRNA og viste sig at være forhøjet i flere typer af kræft, herunder CaP [14], [15]. Vi har tidligere rapporteret, at kliniske hætter med høje Gleason scorer højt udtrykkelige

miR-125b

[13], og at

miR-125b

direkte rettet mod p53, Puma og BAK1, viser en anti-apoptotisk effekt