PLoS ONE: Følsom Påvisning af kolorektal cancer i perifert blod ved Septin 9 DNA-methylering Assay

Abstrakt

Baggrund

Kolorektal cancer (CRC) er den næststørste årsag til kræft dødsfald på trods af, at påvisning af denne kræft i tidlige stadier resulterer i over 90% overlevelsesrate. I øjeblikket mindre end 45% af udsatte personer i USA er screenet regelmæssigt, udsætte et behov for bedre screeningstest. Vi udførte to case-kontrol undersøgelser for at validere en blod-baserede test, der identificerer denatureret DNA i plasma fra alle faser af CRC.

Metodologi /vigtigste resultater

Ved hjælp af en PCR-analyse til analyse af

Septin 9

(SEPT9) hypermethylering i DNA ekstraheret fra plasma, blev klinisk ydeevne optimeret på 354 prøver (252 CRC, 102 kontroller) og valideret i et blindet, uafhængig undersøgelse af 309 prøver (126 CRC, 183 kontroller). 168 polypper og 411 ekstra kontroller sygdom blev også evalueret. Baseret på den uddannelse studie SEPT9-baserede klassifikation opdaget 120/252 CRC’er (48%) og 7/102 kontroller (7%). I testen studie 73/126 CRC’er (58%) og 18/183 kontrolprøver (10%) var positive for SEPT9 validering træningssættet resultater. Optagelse af et ekstra måling replikere øget følsomhed for analysen i sættet test til 72% (90/125 CRC’er fundne) og samtidig opretholde 90% specificitet (19/183 for kontroller). Positive satser for plasmaer fra andre kræftformer (11/96) og ikke-kræft betingelser (41/315) var lave. Hastigheden af ​​polyp detektion ( 1 cm) var ca. 20%

Konklusioner /Betydning

Analyse af SEPT9 DNA methylering i plasma repræsenterer en ligetil, minimalt invasiv metode til at påvise alle faser af. CRC med potentiale til at tilfredsstille udækkede behov for øget overholdelse i screeningen befolkning. Yderligere klinisk afprøvning er påkrævet

Henvisning:. Grützmann R, Molnar B, Pilarsky C, Habermann JK, Schlag PM, Saeger HD, et al. (2008) Følsomme Påvisning af kolorektal cancer i perifert blod ved Septin 9 DNA-methylering analysen. PLoS ONE 3 (11): e3759. doi: 10,1371 /journal.pone.0003759

Redaktør: Joseph Najbauer, City of Hope Medical Center, USA

Modtaget: 4. august, 2008; Accepteret: 21 Oktober 2008; Udgivet: November 19, 2008

Copyright: © 2008 Grützmann et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev sponsoreret af Epigenomics AG, Berlin. Undersøgelsen sponsor deltog i undersøgelsen design og analyse af prøverne. Fortolkning af data og skrivning af papiret samt beslutningen om at sende det til offentliggørelse blev udført af alle forfattere, herunder forfatterne ansat af sponsoren

Konkurrerende interesser:. Fabian Model, Volker Liebenberg, Theo Devos, Xiaoling Song, Robert H. Day, Andrew Z.Sledziewski og Catherine Lofton-Day er ansat på Epigenomics, sponsor af undersøgelsen.

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de mest almindelige neoplasmer fundet hos mænd og kvinder i USA. The American Cancer Society havde anslået, at ville forekomme 154.000 nye tilfælde af CRC i 2007, hvilket resulterer i mere end 52.000 dødsfald. Screening programmer til identifikation af tidlige stadium CRC og præ-neoplastiske tilstande kan forbedre betydeligt udfald sygdom på grund af behandlingen gavn af tidlig [1] afsløring. Aktuelle ikke-invasive screeningsprocedurer er ikke særlig effektive, da de kræver patientefterlevelse til selv collect afføringsprøve analyseres årligt for tilstedeværelse af okkult blod (FOBT) [2]. Til dato, forbedringer i afføring-baserede tests ved at gøre dem mere følsomme og mere brugervenlig har ikke øget overholdelse i CRC-screening. Invasive screeningstest såsom koloskopi eller sigmoideoskopi, skønt mere effektiv, kræver omfattende tarm forberedelse, krænkelse af privatlivets fred, og sedation, og ikke overvinde aktuelle overholdelse spørgsmål i CRC-screening. Der er stigende forventning om, at den nye generation af screening tests baseret på molekylære biomarkører til stede i blodet bør forbedre patientens overholdelse i CRC-screening som det fremgår af den succes, andre screeningsprogrammer såsom kolesterol /lipider og prostata specifikt antigen (PSA) [5] – [7].

Bestemmelse af epigenetiske begivenheder er en stærk kandidat til tidlig påvisning af sygdom, da regulering af genekspression ved afvigende DNA methylering er en velkarakteriseret begivenhed i tumor biologi [8], [9], og er udførligt beskrevet for CRC [10] – [12]. Forøgede niveauer af frit cirkulerende methyleret DNA i blodet hos cancerpatienter sammenlignet med raske kontroller er blevet rapporteret [13], [14]. Flere laboratorier rapporteret også lovende DNA-methylering baseret markør kandidater til påvisning af CRC [15] – [19]. Oversætte sådanne markør kandidater i klinisk validerede og kommercielt levedygtige tests har været overordentlig langsom og utilstrækkelig. For at lette forbedringer i biomarkør oversættelse medicin Pepe

et al.

Foreslået en systematisk proces for biomarkør validering for tidlig påvisning af kræft med 5 forskellige faser, der giver hver fase øget niveau af dokumentation for markør validering [20]. I en indledende undersøgelse præsenterede vi det første niveau af beviser for, at SEPT9, en DNA methylering-baserede biomarkør, effektivt diskriminerer CRC fra normale prøver [21]. Den Septin 9 genet tilhører en klasse af GTPaser involveret i talrige cellulære proces [22] .Den genet har vist sig at have flere alternativt splejsede transkripter koder for mindst 5, kendetegnet polypeptider betegnet v1-v5 [23], hvoraf nogle har været forbundet med kræft. Forholdet mellem v4 og v4 * ekspression, identiske proteiner kodet af forskellige transkripter, er blevet vist at blive ændret i ovariecancer med v4 er den fremherskende form udtrykt i normale celler og v4 * udtrykt i tumorer [24]. Nylige undersøgelser af v1 isoformen antyder, at overekspression af dette polypeptid kan fremme tumorudvikling i brystvæv [25]. Vores tidligere arbejde beskriver afvigende methylering i promotorregionen af ​​v2 transkript indikerer, at methylering i denne region er associeret med colorectal cancer [21]. Bevæger sig fremad i den af ​​Pepe

proces et al

, i denne rapport giver vi det andet niveau af beviser ved at præsentere resultater fra validering af klinisk assay for SEPT9 i to store uafhængige plasma-apparater viser potentialet i denne markør for tidlig påvisning af CRC. Forøgelse af antallet af analysen replikater resulterede i høj følsomhed for CRC med fremragende specificitet hos raske kontroller. Specificitet blev yderligere vurderet i en række af sygdomsbekæmpelse. Endelig er SEPT9 methylering af præmaligne læsioner rapporteret.

Metoder

Patienter

700 patientprøver indsamlet på 9 lokaliteter blev målt i uddannelsen studiet. Den omfattede patienter med alle stadier af tyktarmskræft, personer uden sygdomme i tyktarmen, som verificeret af koloskopi, yderligere kontroller sygdom og en række patienter med adenomatøs polypper (tabel 1). En delmængde på 354 prøver (kun CRCs og normals med komplet SEPT9 måling) blev anvendt til at generere træningssættet algoritme. Testen Undersøgelsen bestod af 547 patientprøver (en delmængde af 309 CRCs og normaler med komplet SEPT9 måling blev anvendt som en test-sæt) opsamlet på 14 anlæg og omfattede lignende kliniske kategorier af prøver som anvendt i træningen undersøgelsen. Yderligere kontroller sygdom blev indsamlet fra personer med ikke-kolorektal kræft og forskellige ikke-kræft sygdomme for yderligere specificitet test. Ikke alle disse emner blev verificeret med koloskopi som CRC-og /eller adenom-fri. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle undersøgelsens deltagere klæber til de lokale etiske retningslinjer.

Alle kræftpatienter og raske kontrolpersoner indskrevet i begge undersøgelser var mindst 40 år med en præference for patienter på 50 og ældre og som hovedsageligt er afledt af de samme klinikker. Alle emner deltagende hverken havde en personlig historie af HIV, HBV eller HCV eller forrige historie af kræft, med undtagelse af basalcellekræft eller symptomer på alvorlig akut eller forværret kronisk sygdom.

Blod fra alle fag er udarbejdet enten før eller mere end 2 dage og op til 6 måneder efter koloskopi og før du starter enhver kræft specifik behandling. Kræft Diagnosen blev bekræftet histologisk fra de kirurgiske prøve og kun adenokarcinomer blev inkluderet i denne undersøgelse.

Prøve behandling workflow

En 3-del workflow blev udviklet til SEPT9 test (Figur 1). DNA ekstraktion: Frit flydende cirkulerende DNA blev ekstraheret fra plasma ved hjælp af Total Nucleic Acid Large Volume DNA-ekstraktion kit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) og Roche MagNaPure enhed. Otte eller 16 ml plasma blev fordelt i MagNaPure brønde (1 ml pr brønd), ekstraheret efter kit-protokol, og DNA blev elueret i 100 pi prøver. Eluater fra hver patient blev poolet og koncentreret til et endeligt volumen på 100 pi under anvendelse Microcon YM-30 filtre (Millipore). En 5 pi alikvot af hver prøve blev bibeholdt til måling af total genomisk DNA under anvendelse af real-time PCR assay (CFF1) beskrevet i supplerende tabel S1. Bisulfitbehandling: Koncentreret DNA-prøver blev bisulfit behandlet ved metoder til at opnå maksimal omdannelse og DNA recovery [35]. En 5 pi alikvot af hver prøve blev bibeholdt til måling af total bisulfitbehandlet DNA under anvendelse af real-time PCR assay (HB14) som beskrevet i supplerende tabel S1. Real Time PCR Analyse: SEPT9 real time PCR assay er designet omkring transkriptionsstartstedet af v2 transkript. Den realtid assay sekvenser, cykelforhold og kvalitetskontrol proces er beskrevet i den supplerende tekst S1 og supplerende Figur S1. For totale genomiske og total bisulfit omdannet DNA målinger, blev PCR udført på en 1:10 fortynding (i elueringsbuffer) af de respektive materialer. For SEPT9 målinger på prøver, blev reaktionerne udført på 10-12.5 uL af ufortyndet DNA afhængig eksperiment. PCR blev udført under anvendelse af Roche LightCycler 2.0-enhed med FastStart DNA Master HybProbe Master Mix (Roche Applied Science). Hver PCR-kørsel omfattede en DNA standardkurve fremstillet ved anvendelse af bisulfit behandlede CpGenome Universal Methyleret DNA (Millipore (Chemicon), Billerica, MA) ved koncentrationer mellem 50 pg /rxn-20 ng /rxn. Hver kørsel omfattede også en ingen skabelon kontrol, som blev efterladt reducerede hele processen for at kontrollere for forurening, og 3 no-skabelon kontroller, som blev brugt til at etablere grundlinjen af ​​PCR-reaktionen. Prøver blev kørt som enkelte kapillærer på hver PCR-kørsel, og gentagelser blev udført i separate PCR kører. Forstærkning kurver for hver reaktion blev manuelt verificeret af 2 uafhængige anmeldere.

Diagrammet viser de store prøve forarbejdning og laboratorie workflow trin. Den viser, proces kontrolprøver indføres i arbejdsprocessen, og hvilke assays blev anvendt til måling af produktionen af ​​hver proces trin. Grå felter angiver test sæt specifikke workflow trin.

Dataanalyse

Patient prøver til træning og test studiet blev grupperet efter diagnose og køn og randomiseret til DNA-ekstraktion partier. Desuden blev test undersøgelsesprøver blindet før bearbejdning i laboratoriet og dataanalyse. Kvantitativ real-time PCR-analyse af plasmaprøver blev udført som beskrevet tidligere, og gentagne målinger blev beregnet. [21] Chi square test blev anvendt til at sammenligne detektionsrater mellem forskellige placeringer af tumor, alder, tumor stadium og køn. Wilcoxon-Mann-Whitney testen og Kruskall-Wallis test blev anvendt til kvantitativt at sammenligne methylerede Septin 9 DNA-koncentrationer mellem forskellige placeringer af tumor, alder, tumor stadium og køn. Konfidensintervaller for andele af detekterede prøver blev fastsat til 95% og baseret på binomialfordelinger. Alle P-værdier er tosidet.

Resultater

Formålet med denne undersøgelse var at validere brugen af ​​SEPT9 hypermethylering som biomarkør for tarmkræft ved at bestemme den optimale klassificeringen ved hjælp af et sæt prøver (uddannelse undersøgelse) og bekræfter den valgte klassificeringen i en uafhængig prøve sæt (test undersøgelse). Hver plasma prøve blev behandlet på en tre-trins arbejdsgang skitseret i figur 1. arbejdsgang blev omhyggeligt overvåget med tillæg af positive og negative kontroller på hvert procestrin og individuelle prøver blev accepteret til endelige analyse efter passage kvalitetskontrol specifikationer (se supplerende tekst S1).

uddannelse studier

de demografiske og kliniske parametre af de emner, der indgår i uddannelsen undersøgelsen er skitseret i tabel 1. Tre hundrede fire og halvtredsindstyve kolorektal cancer og normale kontrolprøver blev inkluderet i den primære dataanalyse. Uddannelsen undersøgelse data blev analyseret kvalitativt, hvor en SEPT9 reaktion blev kaldt positivt, hvis en særskilt PCR kurve blev opdaget. Hver plasma prøve blev målt i tre uafhængige PCR-reaktioner og er baseret på analyse af klinisk ydeevne, blev patientprøver klassificeret som positive, hvis to ud af tre PCR replikater blev kaldt positive. Baseret på denne kvalitative algoritme målte vi en følsomhed på 48% for tarmkræft og en specificitet på 93% for ikke-kolorektale sygdom koloskopi-verificerede prøver. Alternativt vi bestemt optimale tærskler baseret på kvantitativ analyse af SEPT9 markør. Disse kvantitative algoritmer ikke forbedre den samlede markør ydeevne (se supplerende tabel S2). Brug af den kvalitative analyse analyserede vi korrelationer mellem påvisning af kolorektal cancer og forskellige kliniske parametre. Der var ingen signifikant forskel i opdagelse sats efter placeringen af ​​tumor, alder eller køn. Tidlig stadie kolorektal kræft blev opdaget ved lidt lavere (43%) end senere stadier kræftformer (55%), men forskellen var ikke signifikant. Der var heller ingen signifikant kvantitativ forskel mellem mængder af methyleret SEPT9 DNA mellem forskellige stadier (figur 2A). Den SEPT9 markør opdaget også 22% af polypper større end 1 cm.

Box-percentil plots af træningssæt methylerede SEPT9 DNA-koncentrationer i plasma er vist for koloskopi-verificerede normale patienter (Normal) og patienter med kolorektal cancer ( CRC). Median DNA-koncentrationer er røde vandrette linjer; 25. og 75. percentiler er blå vandrette linjer. Bredden af ​​kassen-percentilen plot til enhver given højde er proportional med procent af observationer, der er mere ekstrem i retningen fører bort fra medianen. Individuelle måleværdier er plottet som grå cirkler. B) Box-percentil plots af test sæt methylerede SEPT9 DNA-koncentrationer i plasma.

Test Study

For at bekræfte den kliniske ydeevne SEPT9 uddannelse algoritme vi samlet plasmaprøver fra en uafhængig patient sæt (test sæt – tabel 1). I forhold til uddannelse indstille test sæt indeholdt signifikant færre tidlige stadie kræft og kræftpatienter var lidt ældre. Brug af SEPT9 tærsklen fastlagt i uddannelsen studiet var vi i stand til at bekræfte markør præstationer i testen sæt af 309 kolorektal kræftpatienter og raske kontrolpersoner med følsomhed på 58% og specificitet på 90% (tabel 2).

Der var ingen signifikant forskel i opdagelse sats efter placeringen af ​​tumor, alder eller køn. Tidlige stadie kolorektal kræft blev opdaget ved lavere satser (36%) end senere stadier kræftformer (73%), men forskellen i opdagelse sats var ikke signifikant. Imidlertid var der en signifikant kvantitativ forskel mellem mængder af methyleret SEPT9 DNA mellem forskellige stadier (P 0,002; Figur 2B). Store polypper ( 1 cm). Blev påvist med en sats på 18%

Forbedret proces giver bedre SEPT9 ydeevne

Under vores rutine kvalitetskontrol vi observerede sporadisk hæmning af PCR-reaktionen (se Supplerende Figur S2). Derfor analyserede vi en ekstra SEPT9 kopiere hjælp 10 fold-fortyndede prøver til rådighed fra de originale samlede bis-DNA målinger. Korrelationen plot af standard SEPT9 måling (gennemsnit af tre standard replikater) og en enkelt måling af den fortyndede prøve er vist i figur 3.

X-aksen – koncentration af SEPT9 i standard test sæt prøver (gennemsnit af tre standard gentagelser) Y-akse – koncentration af SEPT9 i 1:10 fortyndet test sæt prøver (enkelt replikat). mDNA – methyleret DNA. Gruppe 1 – prøver med det samme SEPT9 forstærkning i standard og fortyndet koncentration, gruppe 2 – prøver med SEPT9 forstærkning kun i standard koncentration, gruppe 3 – prøver med SEPT9 forstærkning kun i fortyndet koncentration. Grønne trekanter – sund kolon, røde cirkler – kolorektal cancer, sorte firkanter – polypper

Der er tre grupper af prøver:. GROUP1 hvor SEPT9 forstærkning var identisk i standard og fortyndede prøver, gruppe 2 i hvilke kun standard koncentration prøver forstærket og gruppe 3, hvor kun de fortyndede prøver forstærkes. Gruppe 2 består af prøver ved hvilken der skete intet PCR-inhibering, men indeholdt niveauer af tumor-DNA utilstrækkelig til amplifikation af SEPT9 efter fortynding. Gruppe 3 prøver viste PCR hæmning i standard koncentration, men når fortyndet viste SEPT9 forstærkning. Vi indarbejdet resultatet af denne yderligere målinger i en ny algoritme, hvor en patientprøve klassificeres positiv, hvis enten to ud af tre standard-PCR replikater er positive (træningssættet algoritme) eller måling af den fortyndede prøve er positiv. Reanalyse af test sæt resultater ved hjælp af denne algoritme dramatisk forbedret ydeevne SEPT9 analysen (tabel 2).

Samlet kolorektal cancer afsløring nåede 72%, samtidig med at meget høj specificitet på 90%. Særligt imponerende var lettere at opdage tidligt stadium kræft (fase I /II – følsomhed 62%). Bekræfter den potentielle værdi af SEPT9 som en tidlig påvisning biomarkør for tarmkræft

Ikke kolorektal cancer (NCC) og ikke kræft sygdomme (NCD) prøveanalyse

Vi har også indsamlet og analyseret en undergruppe af plasmaprøver fra patienter diagnosticeret med ikke-kolorektale cancere (NCC), herunder blære, bryst, lunge, lever, bugspytkirtel og prostatacancer samt ikke -cancerous sygdom, der kan have forstyrrende virkninger på SEPT9 markør ydeevne. Som vist i tabel 3, SEPT9 er usædvanligt specifik med hensyn kolorektal cancer sammenlignet med detektion NCCer: kun få plasmaprøver fra leverkræft (2 ud af 8 prøver), lungecancer (4 ud af 13) og blærecancer (4 ud af 19) patienter var positive for markøren. Den lave andel af SEPT9 stede i flere ikke-kræft sygdomsgrupper, f.eks kronisk nyresvigt, gastritis, og kroniske luftvejsinfektioner (se tabel 3) peger på den høje specificitet for kolorektal cancer malignitet.

Diskussion

I denne rapport fastlægges vi udførelsen af ​​en reel -tid PCR assay for methylerede SEPT9 DNA først i en uddannelse studie og derefter i et blindet uafhængig test undersøgelse. Samlet følsomhed for tarmkræft var sammenlignelig i begge undersøgelser som identificeret ved hjælp af den oprindelige uddannelse algoritme. Følsomhed steg til 72% med en yderligere SEPT9 gengivelse af den fortyndede plasmaprøve 10 gange. Markøren viste sig at være følsom over for debuterende tarmkræft identificere 62% af Stage I /II CRCs. Der var en tendens til tidlige fase kolorektal kræft, der skal detekteres ved lidt lavere priser end senere stadier kræftformer i både træning og test undersøgelse, men forskellene var ikke signifikante på grund af utilstrækkelig antal prøver for hver enkelt fase af kræft. Følsomhed CRC detektion var fuldstændig uafhængig af tumor placering i colon. Dette kan være et generelt træk ved methylering biomarkører siden Chen

et al.

Bemærkede en lignende mangel på korrelation til fase eller placering i en nylig undersøgelse i afføringen af ​​patienter med kolorektal cancer [26]. Andre fækale tests såsom FOBT og iFOBT har vist sig at have en nedsat følsomhed for både proksimale kolorektal kræft og kræft early stage [27]. Endelig vores resultater viser, at biomarkør er også yderst specifik (90-93%) hos raske individer.

Vi udviklede en meget følsom PCR-assay til påvisning af methyleret v2 promotor fra SEPT9 i plasmaprøver. Effektiv validering af en sådan test afhænger så meget på kvaliteten af ​​biomarkør som på kvaliteten og sammenhængen i de workflow trin, herunder den endelige markør måling. Vi kontrollerede vores workflow på hvert trin; vurdere variabiliteten af ​​dna-ekstraktion, bisulfit konvertering og PCR-amplifikation og på grund af en sådan kvalitetskontrol var vi i stand til at identificere sporadisk PCR hæmning i testen sæt. At overvinde dette problem ved at fortynde PCR-reaktionen 10 gange og kombinere denne måling med ufortyndet måling gav den sande ydeevne SEPT9 markør. Brugen af ​​fire assay gentagelser (3 standard gentagelser og 1 fortyndet) tillader alternative analyse med fokus på enten sensitivitet eller specificitet af markøren analysen. Ved at kræve SEPT9 at være til stede i alle standard replikater eller en fortyndet gentagelse før en prøve er klassificeret positiv, testen opnår en meget høj specificitet (97%) og stadig bevarer betydelig følsomhed (65%). Når kun 1 af 4 replikater (enten en standard eller en fortyndet) er forpligtet til at være positivt for en positiv opkald (høj følsomhed) følsomhedskoefficienterne stiger til 77%, mens specificitet er stadig respektable 75% [se Supplerende Tabel S3].

de kontrol patientgrupper i vores undersøgelser omfattede en primær sæt individer uden sygdomme i tyktarmen, som verificeret af koloskopi, men nogle betingelser kan være til stede i CRC screening befolkning. Vi gjorde alt for at undgå patient selektionsbias i undersøgelsen ved at kræve kontrol for at være i samme aldersgruppe som CRC’er og at være afledt hovedsageligt fra de samme klinikker som vores CRC patienter. På trods af disse bestræbelser nogle fordomme forblev: størstedelen af ​​CRC patienter i træning og test sæt er mænd (57% og 60%), og test sæt patienter er lidt ældre end træningssæt patienter. Men da vi fandt, at påvisning af CRC er uafhængig af alder og køn den rapporterede SEPT9 ydeevne bør være upåvirket. Vores primære analyse sammenligner effektiviteten af ​​markøren i plasma fra patienter med kolorektal cancer vs. emnerne uden kolorektal sygdom. Vi udførte supplerende analyser ved hjælp af ikke-kræft sygdom kontroller og plasma fra andre end kolorektal kræft for at identificere potentielle specificitet problemer. Antallet af patienter med disse betingelser ikke er vægtet i forhold til deres forekomst, og ikke kan bestemmes derfor sande specificitet vedrørende disse sygdomme for målet screening befolkning. Da den observerede positive sats af markøren er meget lav i kontrolprøverne, mener vi, at SEPT9 markør vil klare sig godt i fremtidige prospektive kliniske studier målt i CRC screening befolkning.

SEPT9 test sigter mod at afsløre asymptomatisk kolorektal cancer tilfælde. Vi opnåede også foreløbige data om polyp detektion med SEPT9 analyse, som indikerer nogle præmaligne forandringer er identificeret med vores test. Den ultimative CRC screening bør også være rettet mod adenomer, der vil fremme til kræft, og at kunne fjernes i løbet af opfølgende koloskopi. Mens vi i dag endnu ikke fuldt ud forstår den naturlige historie adenomer, og kan ikke forudsige, hvilke der ville udvikle sig til kræft, er det fristende at spekulere, at epigenetiske markører, ligesom SEPT9 kan hjælpe med sådan polyp lagdeling.

Septin 9

gen, også kaldet MSF, koder et pattedyr septin protein involveret i mange cellulære processer. Forstyrrelse af virkningen af ​​

Septin 9

resultater i ufuldstændig celledeling [28].

Septin 9

og andre proteiner har vist sig at være fusionspartnere af proto-onkogenet

MLL

antyder en rolle i tumorigenese [29], [30].

Septin 9

har også vist sig at være i en hyppigt deleteret område i bryst- og ovariecancer i tab af heterozygositet (LOH) undersøgelser, en konstatering, at yderligere implicerer genet som en mulig tumor suppressor [31]. Burrows

et al.

Rapporterede en dybtgående undersøgelse af ekspressionen af ​​de mange isoformer af

Septin 9

gen i æggestokkræft og viste væv specifikt udtryk for forskellige udskrifter [32]. Ekspression af v4 udskrift af

Septin 9

viste sig at være fraværende eller formindsket i flere cellelinjer og kunne reaktiveres ved behandling med 5-azacytidin, giver indledende tegn på potentiel regulering af genet ved DNA methylering. Yderligere beviser for methylering kontrol over v2 udskrift blev leveret i en nylig kvantitativ analyse i væv og plasma fra patienter med tyktarmskræft [21]. Desuden en nylig undersøgelse fra Bennett

et al.

Indikerer, at methylering af Septin 9 genet forekommer også i hoved og hals kræft, men det område af methylering begivenhed er ikke beskrevet [33]. Over-ekspressionen af ​​

Septin 9

isoformer er også blevet påvist i en række tumorvæv. En tidligere undersøgelse af over 7000 normale og tumorvæv indikerer, at vævsspecifik ekspression af Septin 9 transkripter forekommer i en lang række cancertyper [23] Forfatterne spekulere, at genet er sandsynligvis et type II cancer gen hvor ændringer i RNA-transkript forarbejdning kontrolforordning forskellige proteinprodukter, og niveauet for disse ændrede protein isoformer kan give svar på genets rolle i malignitet. Denne hypotese er i overensstemmelse med nylige undersøgelser, der viser Septin 9 isoform over-ekspression er forbundet med en onkogen fænotype [24], [25] og beviser, at Septin 9 v1 overekspression er associeret med tumor resistens over for lægemidler, som forstyrrer mikrotubulusdannelse [34 ].

Indtil videre nuværende CRC screening strategier undladt at forbedre overholdelsen patient og til lavere dødelighed af kolorektal cancer. De fleste eksperter forventer en forbedret patient CRC screening overholdelse blod-baserede test, som det var tilfældet for prostatakræft screening med PSA eller hjertesygdomme med kolesterol /lipider test. Denne rapport beskriver den første validering af et plasma-baserede DNA-methylering test i to store velkontrollerede case-kontrol studier bekræfter klinisk potentiale SEPT9 biomarkør for CRC screening ansøgning. Vi mener, at en sådan en let administreret blod-baseret test til tidlig opdagelse af tyk- og endetarmskræft efterfulgt af koloskopi for positive individer har potentialet til at være et meget effektivt redskab til at reducere dødeligheden af ​​denne sygdom. De SEPT9 markør assay garanterer yderligere evaluering som en test til tidlig CRC påvisning og prospektive undersøgelser er planlagt til at bestemme den kliniske præstation i screening vejledende støtteberettigede screening befolkninger.

Støtte oplysninger

Tekst S1.

supplerende metoder

Doi: 10,1371 /journal.pone.0003759.s001

(0,03 MB DOC)

tabel S1.

Primer, probe og blokker sekvenser af markøren SEPT9 real-time PCR-analyse, og kontrollen CFF1 og HB14 real-time PCR-analyser

doi: 10.1371 /journal.pone.0003759.s002

(0,02 MB DOC)

tabel S2.

SEPT9 markør præstationer i uddannelse sæt – alternative algoritmer

doi: 10,1371 /journal.pone.0003759.s003

(0,02 MB DOC)

tabel S3..

SEPT9 markør præstationer i test sæt – alternativ analyse

doi: 10,1371 /journal.pone.0003759.s004

(0,03 MB DOC)

Figur S1.

herunder Shewhart kontrolkort af total genomisk DNA opsving (øvre) og SEPT9 markør DNA (lavere) til behandling af kontrol i træningssættet

doi:. 10,1371 /journal.pone.0003759.s005

(0,08 MB DOC )

Figur S2.

herunder Shewhart kontrolkort af total genomisk DNA opsving (øvre) og SEPT9 markør DNA (lavere) til behandling af kontrol i testen sæt

doi:. 10,1371 /journal.pone.0003759.s006

(0,08 MB DOC )

tak

forfatterne vil gerne takke de diagnostiske screening teknologi og udviklingsgrupper på Epigenomics til at udføre de kliniske studier. Præsenteres i del: Abstract # LB165 AACR Annual Meeting 2007, Los Angeles CA