PLoS ONE: Comparative 3UTR Analysis Tillader Identifikation af Regulatoriske klynger, der drev Ef /ephrin Expression i kræftceller

Abstrakte

Eph receptorer er den største familie af receptortyrosinkinaser. Sammen med deres ligander, de ephriner, de opfylder flere biologiske funktioner. Afvigende ekspression af Ephs /ephriner fører til øget Eph-receptor til ephrin ligand-forhold er en kritisk faktor i tumorigenese, hvilket indikerer, at stram regulering af Eph og ephrin ekspression er afgørende for en normal celle adfærd. De 3′-utranslaterede regioner (3’UTRs) af transkripter spiller en vigtig men med bred underappreciated rolle i kontrollen af ​​proteinekspression. Baseret på den antagelse, at paraloger af store gen familier kan udvise en konserveret organisering af regulatoriske elementer i deres 3’UTRs anvendte vi en roman bioinformatik /molekylærbiologi tilgang til 3’UTR sekvenser af Eph /ephrin udskrifter. Vi identificerede klynger af motiver, der består af cytoplasmatiske polyadenylation elementer (CPEs), AU-rige elementer (Ares) og HUR bindingssteder. Disse klynger binder flere RNA-stabiliserende og destabiliserende faktorer, herunder HUR. Overraskende, trods sin bredt accepteret rolle som et mRNA-stabiliserende protein, vi viser endvidere, at binding af HUR til disse klynger faktisk destabiliserer Eph /ephrin transkripter i tumorcellelinier. Følgelig knockdown af Hur spænder modulerer ekspression af multiple Ephs /ephriner på både mRNA og protein niveauer. Sammen vores undersøgelser viser, at overekspression af HUR som findes i mange progressive tumorer kan være sygdomsfremkaldende for disarranged Ef receptor til ephrin ligand nøgletal, der fører til en højere grad af væv invasiv

Henvisning:. Winter J, Roepcke S, Krause S , Müller EF, Otto A, Vingron M, et al. (2008) Sammenlignende 3’UTR Analysis Tillader Identifikation af Regulatoriske klynger, der drev Ef /ephrin Expression i kræftceller. PLoS ONE 3 (7): e2780. doi: 10,1371 /journal.pone.0002780

Redaktør: Thomas Preiss, Victor Chang Cardiac Research Institute, Australien

Modtaget: April 23, 2008; Accepteret: 25 juni 2008; Udgivet: 23 Juli 2008

Copyright: © 2008 Winter et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev finansieret af Deutsche Volkswagenstiftung og Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 577, projekt A6 til SS)

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

De 3′-utranslaterede regioner (3’UTRs) af mRNA spiller afgørende roller i posttranskriptionel regulering af genekspression, for eksempel ved at modulere mRNA lokalisering [1], [2], [3], stabilitet [4], og oversættelse [ ,,,0],5], [6]. Bortset fra at have bindingssteder for de nyligt opdagede microRNA’er, kan 3’UTRs havnen motiver, der interagerer med specifikke RNA-bindende proteiner. Disse motiver er normalt korte sekvenselementer, hvis aktivitet kan påvirkes af deres sekundære struktur [7]. Derfor er deres identifikation ved computer algoritmer er vanskelig og normalt producerer mange falske positiver

For at identificere 3’UTR motiver vi brugte en ny tilgang, der er baseret på to antagelser:. Først, ikke kun kodende regioner, men også elementer inden de 3’UTRs, der er afgørende for gen-funktion kan bevares mellem paraloger af store gen familier; sekunder, mRNA, der koder for proteiner, der funktionelt interagerer eller opfylde redundante funktioner kan udvise en bevaret organisering af regulatoriske elementer i deres 3’UTRs. For at undersøge dette, valgte vi familierne til ephrin ligander og Eph-receptorer. Familien af ​​Eph-receptorer er den største underfamilien af ​​receptortyrosinkinaser. Eph-receptorer er opdelt i to underklasser baseret på deres ligandspecificiteter. Generelt Ef klasse A (EphA) receptorer binder til glycosylphosphatidylinositol-forankrede ephrin A ligander (ephrinA) (med undtagelse af EphA4), hvorimod Ef klasse B (EphB) receptorer binder til transmembrane domæne-holdige ephrin B ligander (ephrinB) [ ,,,0],8]. nyere data tyder imidlertid på, at interaktioner også kan forekomme på tværs af klasserne [9]. Ved binding til deres beslægtede ephrin ligander, Ef receptorer autophosphorylere og aktivere nedstrøms signalering kaskader (fremad signalering). Selv om de ikke besidder katalytisk aktivitet selv begge klasser af ephrin ligander kan aktivere signaltransduktionsveje efter interaktion med Eph-receptorer (omvendt signalering) [10].

På det cellulære niveau, signalering gennem Eph-receptorer og ephriner kundeemner til enten øgede vedhæftning (tiltrækning) eller nedsat vedhæftning (frastødning) af de interagerende celler. Disse responser er vigtige ved mediering en bred vifte af biologiske aktiviteter, herunder angiogenese, celle adskillelse, cellevedhæftning, celle morfogenese, og cellemotilitet [11]. Flere af disse processer er ude af kontrol under tumorigenese, fremhæver en potentiel kritisk rolle for Eph /ephrin signalering i udviklingen af ​​mange humane cancere. I tråd med den patofysiologi, flere Ephs og ephriner, herunder EphA1, EphA2, EphA3, EphA4, EphB2, EphB3, og ephrin-A1, er overudtrykt i en række tumorer, og udviser meste tumorfremmende egenskaber [11], [12 ].

Expression mønstre af Ephs og ephriner er komplekse, og deres korrekte udtryk er afgørende for en korrekt funktion af mange af de ovenfor nævnte processer. Derfor ville en finjusteret regulering af Ef /ephrin udtryk både på transkriptionelle og posttranskriptionel niveauer synes at være uundværlig. På transkriptionsniveauet, har Eph-receptorer og ephrin ligander været impliceret som efterfølgende mål for mange forskellige transkriptionsfaktorer, herunder homeodomæneproteiner [13] og p53-proteinet familien [14], [15], [16], [17]. Meget mindre vides om posttranskriptionel regulering. Men der er tegn på involvering af 3’UTR:. Opregulering af EphA2 receptoren i axoner passerer midterlinjen medieres af en særdeles konserveret sekvens i transkriptet s 3’UTR, der indeholder en cytoplasmatisk polyadenylation element (CPE) [18]

Her har vi systematisk indsamlet 3’UTR sekvenser af mus Eph-receptorer og Ephrin ligander og screenet dem for

cis

virkende sekvens motiver. Vi har identificeret tre forskellige typer af motiver i flere af Ef /ephrin 3’UTRs: CPEs, AU-rige elementer (Ares), og HUR bindingssteder. Visse af disse motiver blev fundet at være fordelt tilsyneladende tilfældigt i de respektive 3’UTRs fandtes andre grupperes i klynger, som er stærkt konserveret mellem forskellige vertebrate arter. Desuden identificerede vi flere RNA-bindende proteiner, herunder HUR, der interagerer med disse klynger, og vi viser, at EfnA2, EphA2, og EphA4 er direkte posttranskriptionel mål for HUR i kræft cellelinjer. Overraskende fandt vi, at HUR ikke virke som en stabiliserende faktor ved ekspression af disse Eph /ephriner, men at det destabiliserer de respektive meddelelser.

Resultater

De 3′-utranslaterede regioner af udskrifter af mus Ef receptorer og Ephrin ligander

for at få en komplet samling af fuld længde 3’UTR sekvenser af mRNA for Eph-receptorer og Ephrin ligander, vi først udvindes alle tilgængelige mus Ef /ephrin sekvenser fra GenBank database NCBI. Kun polyadenylerede transkripter blev anset for at være i fuld længde, og kun sådan trunkering varianter, der indeholder både (i) en konsensus hexamer sekvens nær spaltningsstedet og (ii) en poly (A) hale blev inkluderet i analysen. Ufuldstændige udskrifter blev udvidet til poly (A) hale ved at rette 3’complete EST data ved hjælp af softwareprogrammet CAP3 (for tal tiltrædelsesforhandlingerne se tabel S1). C-terminale trunkerede isoformer blev ikke inkluderet i undersøgelsen.

de kodende regioner og exon /intron-grænserne [19] er stærkt konserverede mellem de forskellige medlemmer af Eph-receptor og ephrin ligand genfamilier, de 3’UTRs af transkripter viser en høj diversitet af længde og sekvens: de af ephrin ligander varierer fra 552 bp (EfnA4) til 3171 bp (EfnB2) og de af Eph-receptorer fra 198 bp (EphB6) til 3310 bp (EphA4) (fig. 1, tabel S1). Desuden kunne vi ikke finde nogen væsentlig bevaring på sekvensen niveau, enten mellem de 3’UTRs af Eph receptor udskrifter eller dem af ephrin ligander (data ikke vist).

Scheme af 3’UTRs af Ef /ephriner. Formodede

cis

virkende sekvens motiver er fremhævet i forskellige farver, bevaring mellem menneske /mus, menneske /mus /Xenopus vises af stjerner /åbne cirkler.

ortologe bevarelse mellem human og mus varierede fra 60% til 80%, hvilket er sammenligneligt med hele genomet gennemsnitsværdi af 69% [20].

Alternative polyadenyleringssteder blev fundet i 3’UTRs af EfnA4, EfnB2, EphA3, og EphA7 (fig. 1).

de 3′-utranslaterede regioner af udskrifter af Eph-receptorer og Ephrin ligander indeholder meget konserveret

cis

virkende sekvensmotiver

Som beskrevet ovenfor, er sekvenserne af Eph /ephrin 3’UTRs meget dårligt bevaret mellem paraloger. Imidlertid posttranskriptionel regulering ofte stoler på kort

cis

virkende sekvensmotiver, og gener, der koder proteiner, som funktionelt vekselvirker og /eller gener, der tilhører samme genfamilie kan forventes at indeholde konserverede 3’UTR motiver. For at detektere sådanne elementer vi scannede 3’UTRs af musen Ef /ephrin udskrifter for kendt

cis

virkende sekvensmotiver (se https://genereg.molgen.mpg.de/cgi-bin/regEchse/regEchse.pl: motiver, der er medtaget i søgningen er anført under “Vælg kendt motiv, HUR bindingssteder blev identificeret ved hjælp af Transterm https://uther.otago.ac.nz/Transterm.html). Bemærkelsesværdigt, førte dette til identifikation af tre fremtrædende motiver-CPEs Ares og Hur bindingssteder-i flere af Ef /ephrin 3’UTRs (fig. 1). CPE’ere er translationelle styreenheder, der skal placeres i umiddelbar nærhed af poly (A) -site at være funktionel [21]. Derfor i figur 1, kun de CPE’er der opfylder dette kriterium [0-250 bp afstand fra poly (A) hexamer] er afbildet. Hur interagerer med flere AUUUA gentagelser [22] og U-rige strækninger med høj affinitet. For nylig forsøg er blevet forpligtet sig til mere specifikt at definere en HUR bindingssted [23], [24]. I en række bindingsforsøg Meisner et al. udledt, at HUR bindingssted er den 9-mer NNUUNNUUU. Bemærkelsesværdigt dette motiv viste sig at være til stede i alle validerede Hur mål, og et enkelt punkt mutation i motivet er tilstrækkelig til fuldstændigt at ødelægge Hur binding. I denne undersøgelse søgningen efter Hur bindingssteder var baseret på denne motiv. Både Ares HUR bindingssteder blev fundet i alle dele af 3’UTRs. Nogle af motiverne blev fundet som isolerede, ikke-overlappende elementer. I andre tilfælde blev CPEs fundet at overlappe ARE’er eller HUR bindingssteder eller ARE’er med HUR bindingssteder. Af note, alle tre typer af motiver, nogle i flere kopier, blev fundet sammen i klynger (fig. 1, tabel S2). Disse klynger viser to forskellige lokaliseringsmønstre: placeret overalt i 3’UTR med nogen indlysende præference for en særlig region (f.eks EphA3, se Fig. 1) eller specifikt grupperet i 3’terminal region af 3’UTR i umiddelbar nærhed af polyadenyleringsstedet (f.eks EphA2, se fig. 1).

i ortologe 3’UTRs,

cis

virkende sekvens elementer med vigtige regulatoriske funktioner forventes at være bevaret gennem evolutionen [24] . I 18 af de undersøgte i denne undersøgelse 21 mus Eph /ephrin 3’UTRs, sekvenser fra humane orthologer var tilgængelige, og 44%, 74% og 72% af CPE’er, Ares, og Hur bindingssteder henholdsvis fandtes at være konserveret mellem de to arter (fig. 1 og 2). Mest indlysende, næsten alle motiverne opstillede i klynger er bevaret. Udover pattedyr, ortologe sekvenser af 3’UTRs af EfnB2 og EphA2 fra den nedre hvirveldyr

Xenopus laevis

er tilgængelige. Igen, især de motiver, der er klædt i klynger og placeret nær poly (A) stedet viste sig at være bevaret i denne art (fig. 1 og 2).

Multialignments af repræsentative eksempler på klynger motiver som fundet i 3’terminal dele af EfnA1, EfnA4, EphA2 og EphA4 3’UTRs. Positioner af CPEs, Ares, HUR bindingssteder samt konsensus hexamer af polyadenyleringssignalet er angivet nedenfor de alignments.

Identifikation af proteiner, der binder til sekvens motiver i Eph /ephrin 3’UTRs

på grundlag af følgende kriterier, de 3’terminal dele af EfnA1, EphA2, og EphA4 3’UTRs blev udvalgt til yderligere karakterisering. Første indeholder hver klynge sekvensmotiver bestående af CPE’ere Hur bindingssteder. EphA2 og EphA4 desuden indeholde ARE’er i disse klynger. Derfor bør de 3’terminal dele af disse 3’UTRs syntes at være gode kandidater til identifikation af proteiner, der interagerer med motivet klynger. For det andet, alle tre motiv klynger viser en høj grad af ortologe bevarelse i humane (fig. 1). Desuden er EphA2 klynge højt konserveret i

Xenopus laevis

(for EfnA1 og EphA4, ingen sekvensinformation var tilgængelig for denne art). For det tredje har 3’terminal region EphA2 3’UTR allerede vist sig at opfylde vigtige regulerende funktioner [18].

For at teste for binding af interagerende proteiner til disse motiv klynger, radioaktivt mærkede udskrifter der omfatter tre ‘terminale regioner af EfnA1, EphA2, og EphA4 3’UTRs (fig. 3a) blev inkuberet med lysatet fra muse hjerne og UV-tværbundet. Musehjerne blev anvendt i dette eksperiment, fordi adskillige kendte er- og CPE-interagerende proteiner stærkt udtrykt i dette organ. Komplekser blev resolveret ved elektroforese gennem SDS acrylamidgeler, og de tørrede geler blev eksponeret for røntgenfilm. Interessant, denne metode ikke kun identificeret adskillige proteiner, som havde bundet til motivet klynger af alle tre 3’terminal regioner, men også afslørede en overlappende båndmønster (figur 3b.): Proteiner af 30-45, 50 og 75 kD bundet til alle tre sekvenser, selvom affiniteten til 3’terminal regioner af EphA2 og EphA4 3’UTRs syntes meget højere end med den for EfnA1 3’UTR. Proteiner af -60 og 70 kD blev udelukkende påvises i EphA2 og EphA4 baner (fig. 3b). Identitet interagerende proteiner blev bestemt i en RNA-protein-pulldown assay med efterfølgende analyse af den eluerede fraktion ved massespektrometri. Biotin-mærket

I

–

vitro

-transcribed udskrifter svarende til 3’terminal region EphA2 3’UTR blev inkuberet med lysat fra musehjerne og trak ned med streptavidin magnetiske perler. Transkripter i antisense-orientering til den valgte region blev anvendt i en negativ kontrol eksperiment. Komplekser blev resolveret ved SDS-PAGE, farvet med kolloidt Coomassie, og bands specifikt beriget i prøven opnået med sense transkripter blev analyseret ved elektrospray ionisering (ESI) massespektrometri. Interessant, foruden adskillige proteiner, der vides at være involveret i transskription og mRNA splejsning-myelin ekspression faktor 2 (MyEF-2); heterogen nukleare ribonukleoprotein M (hnRNP M); langt opstrøms bindende protein 1 (FUSE-bindende protein 1, FBP); splejsning faktor, prolin- og glutamin-rig (PSF) -vi identificerede AUF1 og KSRP, to er-bindende proteiner (ARE-bps), som er kendte regulatorer af mRNA-stabilitet (fig. 3c, tabel 1). For at bekræfte interaktionen gentog vi RNA-protein-pulldown-assay. Denne gang dog RNA-protein-komplekser blev overført til PVDF-membraner og interagerende proteiner blev påvist med specifikke antistoffer. Som forventet KSRP bundet til RNA probe svarende til EphA2 3’UTR terminale region, men ikke til antisense negativ kontrol (fig. 3d). Interessant, om AUF1, vi kunne kun registrere binding af P45 og P42 isoformer men ikke p40 og P37 isoformer. Udover ARE og CPE-motiver, den 3’terminal del af EphA2 3’UTR huser et HUR bindingssted af konsensus NNUUNNUUU. Imidlertid blev Hur ikke identificeret som et interagerende protein i massespektrometrianalyse. For at teste direkte for bindingen af ​​Hur inkuberede vi Western blot membran med et antistof rettet mod endogent Hur protein. Som forventet blev Hur fundet specifikt at interagere med 3’terminal region af EphA2 3’UTR.

(A) Scheme of 3’UTRs af EfnA1, EphA2 og EphA4 som afbildet i fig. 1. Prober, der anvendes til UV-tværbinding og RNA-protein-pulldown assays er angivet (B) UV-tværbinding med protein lysat fra muse hjerne og radioaktivt mærkede prober svarende til grupperede motiver til stede i de 3’terminal dele af EfnA1, EphA2 og EphA4 3 ‘UTR’er. (C) 10% SDS-gel farvet med kolloidt Coomassie viser proteinerne elueret fra streptavidin perler koblet til et biotinyleret probe svarende til den 3’terminal del af EphA2 3’UTR (venstre bane) eller til den respektive antisense sekvens (højre bane ). Differential bånd blev udskåret og analyseret ved massespektrometri. Protein-identiteter er givet. (D) Western blot-analyser af RNA-protein pulldowns med protein lysat fra muse hjerne og biotinylerede prober svarende til den 3’terminal del af EphA2 3’UTR (venstre bane) eller til den respektive antisense sekvens (højre bane). KSRP, AUF1, Hur og hnRNP A0 påvises ved anvendelse af specifikke antistoffer. (E) western blot-analyser af RNA-protein pulldowns med protein lysat fra muse hjerne og biotinylerede prober svarende til de 3’terminal dele af Eph /ephrin 3’UTRs eller til EphA2 antisense-sekvensen. HUR og AUF1 påvises ved anvendelse af specifikke antistoffer.

Baseret på størrelse ligheder i 30-45 kD, UV-tværbindende assay foreslog binding af de samme proteiner til 3’terminal dele af EfnA1, EphA2, og EphA4 3’UTRs (fig. 3b). Dette kunne indikere, at ekspressionen af ​​flere af Eph-receptorer og ephriner reguleres af en fælles mekanisme. For at bevise, at identiske proteiner binder til motivet klynger identificeret i flere Eph /ephrin 3’UTRs, vi udførte yderligere RNA-protein pulldown analyser med

I

–

vitro

-transcribed og biotinyleret 3 ‘ terminal dele af alle Eph /ephrin 3’UTRs der indeholder Ares, CPEs og /eller HUR bindingssteder (tabel 2). Derudover har vi benyttet 3′-terminale del af en Eph 3’UTR, der ikke indeholder et sådant motiv (EphA1, den eneste motiv identificeret i 3’UTR af dette transkript er et Hur bindingssted placeret uden for 3′-terminale del ). Igen blev komplekserne overført til PVDF-membraner, og disse blev inkuberet med antistoffer detektere 32 kD Hur proteinet og fire AUF1 isoformer, P37, p40, p42, og P45 henholdsvis. Til vores overraskelse fandt vi, at både Hur og AUF1 p42 /p45 bundet til nogle, men ikke alle af transkripterne (figur 3e.), Og de bindende mønstre af begge proteiner kun var delvist overlappende: både Hur og AUF1 interageret med 3′-terminalen regioner i EfnA2, EfnB2, EphA2, EphA4, og EphA6 3’UTRs, men kun AUF1 bundet til 3’-terminale regioner af EfnA1, EphA3, og EphB1 3’UTRs (fig. 3e). Ingen binding af enten AUF1 eller HUR blev set med 3’terminale region af EphA1, som ikke indeholder et motiv.

Et nærmere kig på sammensætningen af ​​de forskellige 3’UTR terminal dele viste, at AUF1 havde bundet til alle ER-holdige udskrifter undtagen EphA7, men også til fire udskrifter, som ikke indeholdt en ARE (EfnA1, EfnB2, EphA6, EphB1). Til binding af Hur, tilstedeværelsen af ​​konsensus HUR bindingssted var afgørende, men ikke tilstrækkeligt: ​​vi kunne ikke registrere binding af HUR til nogen af ​​de udskrifter mangler denne hjemmeside; Men af ​​de otte udskrifter, der indeholder dette websted, HUR bundet til EfnA2, EfnB2, EphA2, EphA4, og EphA6 men ikke til EfnA1, EfnB3, og EphB1.

Da HUR binder til enkeltstrenget RNA, det var foreslået, at HUR bindingssted måske nødt til at påtage sig en bestemt konformation at undergå høj affinitet HUR bindende [24]. Derfor brugte vi Mfold program til at forudsige sekundære strukturer i 3’UTR prober, som vi havde anvendt i RNA-protein-pulldown-assay. I overensstemmelse med resultaterne af Meisner et al. (2004), fandt vi, at HUR havde interageret kun de transkripter, hvor Hur bindingssteder forudsagt at være placeret i enkeltstrengede sløjfer (fig. 4a). HUR bindingssteder de resterende transkripter var alle (i det mindste delvist) placeret i dobbeltstrengede områder (fig. 4b) og dermed muligvis utilgængelige for Hur.

Vist er de sekundære strukturer af proberne anvendes i UV -crosslinking og RNA-protein pulldown eksperimenter, der svarer til de 3’terminal dele af Eph /ephrin 3’UTRs som forudsagt af Mfold. (A) prober med HUR bindingssteder placeret i enkeltstrengede regioner (asterisker), der viste høj affinitet binding af HUR. (B) Prober hvor Hur bindingssteder forudsagt at huses i dobbeltstrengede regioner.

Den sekundære struktur af et relativt kort partiel transskript kan variere meget fra strukturen af ​​hele 3’UTR og derfor måske ikke afspejler kropsbygning

in vivo

. For at få indsigt i tilgængeligheden af ​​HUR bindingssteder nærede i Eph /ephrin 3’UTRs vi brugt Mfold algoritme til at forudsige de sekundære strukturer af hele 3’UTRs. Interessant, bortset fra EfnB3 og EphA1, alle murine Eph /ephrin 3’UTRs indeholder mindst et HUR bindingssted forudsiges at være en del af en enkeltstrenget region i eller uden for de beskrevne motiv klynger, hvilket tyder på en særlig vigtig rolle i HUR i regulering af Ef /ephrin udtryk (fig. S1).

HUR regulerer ekspressionen af ​​Eph /ephriner i cancer cellelinjer

Unormal udtryk for Eph /ephriner er blevet rapporteret i forskellige kræftformer, og er forbundet med dårlig prognose og fremskredne stadier af malignitet [11], [25]. Mens en stor indsats har været lagt i opklaringen af ​​transkriptionel regulering af Eph /ephriner i cancer cellelinjer og kræft væv, er posttranskriptionel regulering blevet forsømt. Halvfjerds-to procent af de Hur bindingssteder muse Ef /ephrin 3’UTRs er konserveret i human (se ovenfor). For at teste, om vores resultater i museceller også gælde for humane celler vi immunopræcipiteret Hur fra cervikalt carcinom cellelinie HeLa og astrocytoma /glioblastoma-cellelinie U373MG (fig. 5a) anvendelse af et anti-Hur antistof og udført RT-PCR på immunpræcipitere med primere specifikke for EfnA2, EphA2, og EphA4, som er tre mRNA vides at være stærkt udtrykt i forskellige cancertyper [11]. Som negativ kontrol udførte vi den samme fremgangsmåde med ikke-specifikke immunoglobuliner i stedet for anti-Hur antistof (fig. 5a og b), og som negativ kontrol for RT-PCR udførte vi cDNA-syntese trin uden revers transkriptase (data ikke vist). Sammenlignet med den negative IgG kontrol, der var klar berigelse af EfnA2, EphA2, og EphA4 beskeder i immunopræcipitaterne af begge cellelinier (fig. 5b), hvilket indikerer, at HUR havde bundet til Eph /ephrin mRNA’er

in vivo

. Notatet kunne ikke-target GAPDH besked også blive forstærket, om end mindre effektivt og i samme omfang i begge IP-grupper; dette fund er blevet beskrevet før [23], og verificeret brugen af ​​lige mængder af råmateriale.

(A) Immunopræcipitering af endogent HUR. HeLa eller U373-cellelysater blev immunfældet med anti-Hur antistof eller med uspecifikke IgG’er. Immunpræcipitater blev læsset på 10% SDS-sider og analyseret ved western blot med anti-Hur antistof; HC, tung kæde; LC, let kæde (B) RT-PCR efter RNA-ekstraktion fra HUR og IgG immunpræcipitater med primere specifikke for EfnA2, EphA2, EphA4 og GAPDH.

I en yderligere række eksperimenter testede vi, om HUR posttranscriptionally regulerer Ef /ephrin udtryk. Vi slået ned HUR i HeLa og U373MG celler ved hjælp af to forskellige HUR-specifikke siRNA oligonukleotider (fig. 6a og data ikke vist) og opdaget EfnA2, EphA2, og EphA4 mRNA af Real-Time RT-PCR 72 timer efter transfektion. Hur er blevet rapporteret som et mRNA stabiliserende protein, hvilket antyder, at dets knock-down ville føre til en reduktion af Eph /ephrin mRNA-ekspression. Men mens mængden af ​​EphA2 mRNA gjorde fald efter knock-down af HUR, til vores overraskelse de EfnA2 og EphA4 mRNA niveauer steget betydeligt (fig. 6a). For at teste, om de observerede på RNA-niveau ændringer afspejler situationen på proteinniveauet vi indlæst lige store mængder af proteinlysater fra HeLa og U373 celler efter Hur knock-down og udført Western blot-analyse med antistoffer påvisning EphA2 og EphA4 (fig. 6b) . I bekræftelse af Real-Time PCR-forsøg fandt vi, at ekspressionen af ​​EphA2 protein blev drastisk reduceret med 10 gange i HeLa og fem gange i U373 celler efter knock-down af HUR, mens ekspressionen af ​​EphA4 blev øget med 1,2 gange og 2-fold, (fig. 6b). Kontrol siRNA oligonukleotider ikke havde en signifikant effekt på EphA2 eller EphA4 protein udtryk, når sammenlignet med en mock-transficeret kontrol. Af note, det kommercielt tilgængelige EphA4 antistof, der anvendes i dette forsøg detekterer tre forskellige bånd i HeLa-celler (fig. 6B), som alle blev opreguleres efter Hur knock-down. To af disse bånd kan svare til to forskellige EphA4 isoformer med en størrelse forskel på 37 aminosyrer, der er angivet i Genome Browser. Det tredje bånd kan repræsentere en HeLa-specifik isoform, der endnu ikke er blevet påvist i nogen af ​​de konventionelle databaser.

Hur blev slået ned med en specifik Hur RNAi oligonukleotid i HeLa og U373-celler (A) mRNA-ekspression af EfnA2, EphA2 og EphA4 72 timer efter transfektion af en specifik Hur RNAi oligo blev sammenlignet med transfektion af en ikke-silencing kontrol oligo målt ved Real Time RT-PCR. Nøgletal mellem ekspressionsniveauerne efter Hur knockdown og transfektion af ikke-lyddæmpende kontrol oligonucleotodides vises. Værdier blev normaliseret til GAPDH. (B) western blot-analyser af protein ekspression af EphA2, EphA4 (tre isoformer, se pile), Hur og GAPDH 72 timer efter knockdown af Hur (øvre panel, bane 3) med specifikke antistoffer i sammenligning med en mock-kontrol (bane 1) samt en ikke-silencing siRNA kontrol (bane 2). Kvantificering af båndene (Against GAPDH) blev udført under anvendelse Image Quant software 5.2 (nederste panel). Fold stigning eller fald af udtryk er afbildet.

For at skelne mellem indirekte transkriptionelle effekter og mRNA stabilisering direkte forårsaget af knock-down af HUR, vi blokerede transskription med actinomycin D 48 timer efter transfektion af Hur siRNA oligoer eller kontrol oligoer, og målte mRNA halveringstider EfnA2, EphA2, og EphA4 af Real-Time RT-PCR. Overraskende fandt vi, at knock-down af HUR øget halveringstider alle testede Ef /ephrin mRNA. Dette antyder, at HUR destabiliserer disse mRNA’er (fig. 7a), og at faldet i EphA2 besked påvist efter knock-down af HUR kan være forårsaget af sekundære hæmning af EphA2 transkription.

(A) 48 timer efter transfektion af en specifik Hur RNAi oligonukleotid eller en kontrol oligonukleotid halveringstiderne af EfnA2 blev EphA2 og EphA4 mRNA’er vurderet ved anvendelse af 5 ug /ml actinomycin D; mRNA halveringstider blev målt ved Real Time RT-PCR, mRNA-ekspression blev normaliseret til GAPDH. (B) 3’terminal dele af EfnA2, EphA2 og EphA4 3’UTRs blev klonet i pGL3 promotor vektor og transficeret ind i HeLa-celler. 30 timer efter transfektion blev celler høstet og ildflueluciferase blev målt. Til normalisering et Renilla luciferase plasmid (PRL) blev cotransficeret. (C) 24 timer efter transfektion af en specifik Hur RNAi oligonukleotid HeLa-celler blev transficeret med pGL3 promotorkonstruktioner som beskrevet i (B), og 48 timer senere blev ildflueluciferaseaktivitet, målt, og normaliseret til cotransficeret pRL plasmid.

for yderligere at bekræfte, at de observerede virkninger medieres af

cis

virkende sekvenser nærede i 3’terminal dele af EfnA2, EphA2, og EphA4 3’UTRs, pGL3P reporter plasmider bærer disse sekvenser (herunder Hur bindingssteder) nedstrøms for den ildflue-luciferase-cDNA blev transficeret ind i HeLa-celler. For normalisering, PRL vektoren indeholdende

Renilla

luciferase cDNA blev cotransficeret. pGL3P konstruktioner, der indeholder EfnA2, EphA2 eller EphA4 3’terminal sekvenser produceret betydeligt mindre ildflueluciferase aktivitet end pGL3P vektor uden 3’UTR skær, bekræfter en destabiliserende funktion for de 3’terminal dele af disse 3’UTRs (fig. 7b). Efter knock-down af HUR med en specifik RNAi oligo denne destabiliserende virkning kan delvist reddet, hvilket yderligere foreslår en destabiliserende funktion for HUR protein (fig. 7c). Knock-down af HUR med en RNAi oligo rettet mod en anden region i HUR mRNA viste sammenlignelige resultater (data ikke vist). Off-target effekter blev udelukket ved transfektion af en pGL3P vektor uden HUR bindingssteder.

Diskussion

I denne undersøgelse anvendte vi en bioinformatik /molekylærbiologi tilgang til at screene 3’UTRs af udskrifter af Ef receptorer og Ephrin ligander for formodede

cis

virkende sekvens motiver og at beskrive deres biologiske funktion.

Vi viser, at flere af de Ef /ephrin 3’UTRs, selv udstille betydelig divergens mellem paraloger i hensyn til længde og sekvens, indeholder evolutionært konserverede motiv klynger bestående af overlappende CPE’er, Ares, og HUR bindingssteder. Vi identificerede HUR og flere andre proteiner involveret i mRNA stabilitet kontrol som interaktion partnere i disse klynger. Skift fra mus til menneskelige kræftceller, vi også fået bevis for, at ekspressionen af ​​Eph /ephriner posttranscriptionally reguleres gennem interaktion af de bevarede sekvens klynger og HUR, hvilket tyder på en sammenhæng mellem fejlagtig regulering af Ef /ephrin udtryk i kræft og overekspression af HUR.

de 3′-utranslaterede regioner af udskrifter af mus Eph-receptorer og Ephrin ligander

Et kendetegn for medlemmer af Eph /ephrin familier er deres ekspansion af tal i løbet af evolutionen, på grund af mangfoldiggørelse begivenheder [19]. De respektive kodende regioner og exon /intron-grænserne er stærkt konserverede blandt orthologer og paraloger, hvilket afspejles af de redundante funktioner, Eph /ephriner kan opfylde og ved evnen af ​​Eph-receptorer til at interagere med flere ephriner. Desuden er 3’UTRs af Eph /ephrin orthologer stærkt konserveret mellem mennesker og mus (op til 80%), hvilket tyder på god selektionstryk og måske bevarelse af særskilte udtryk profiler. I modsætning hertil 3’UTRs af Eph /ephrin paraloger viser en høj grad af strukturel divergens, hvilket kan have aktiveret Ephs /ephriner til at erhverve forskellige udtryk profiler (cellulære eller subcellulære), som det er blevet foreslået for andre konserverede paraloger [26].