PLoS ONE: Optimal 3D Matrix stivhed for vedligeholdelse af cancer stamceller er afhængig Tissue oprindelse Cancer Cells

Abstrakt

Introduktion

vækst og udtryk for cancer stamceller (CSCS) afhænger af mange faktorer i tumoren mikromiljø. Formålet med dette arbejde var at undersøge effekten af ​​kræftceller ‘væv oprindelse på den optimale matrix stivhed for CSC vækst og markør udtryk i en model polyethylenglycoldiacrylat (PEGDA) hydrogel uden indblanding af andre faktorer i mikromiljø.

Metoder

Menneskelig MCF7 og MDA-MB-231 brystcarcinom, HCT116 kolorektale og AGS gastrisk carcinom, og U2OS osteosarcomceller blev anvendt. Cellerne blev indkapslet i PEGDA geler med kompressionskraft moduler i 2-70 kPa rækkevidde og optimeret cellepodning densitet 0.6×10

6 celler /ml. Micropatterning blev anvendt til at optimere væksten af ​​indkapslede celler i forhold til gennemsnittet tumorsphere størrelse. CSC delpopulation af de indkapslede celler var præget af celle nummer, tumorsphere størrelse og antal tæthed, og mRNA ekspressionen af ​​CSC markører.

Resultater

Den optimale matrix stivhed for vækst og markør udtryk CSC delpopulation af kræftceller var 5 kPa for brystkræft MCF7 og MDA231, 25 kPa for kolorektal HCT116 og gastrisk AGS, og 50 kPa for knogle U2OS celler. Konjugation af et CD44 bindende peptid til gelen stoppet tumorsphere dannelse ved cancerceller fra forskellige væv oprindelse. Udtrykket af YAP /Taz transkriptionsfaktorer af de indkapslede kræftcellerne var højest på det optimale stivhed indikerer en forbindelse mellem Hippo transducere og CSC vækst. Den optimale gennemsnitlige tumorsphere størrelse for CSC vækst og markør udtryk var 50 um.

Konklusion

Markøren udtryk resultater tyder på, at CSC sub-population af kræftceller bor inden for en niche med optimal stivhed, som afhænger af kræftceller ‘væv oprindelse

Henvisning:. Jabbari E, Sarvestani SK, Daneshian L, Moeinzadeh S (2015) Optimal 3D Matrix stivhed for vedligeholdelse af cancer stamceller er afhængig tissue oprindelse af kræftceller. PLoS ONE 10 (7): e0132377. doi: 10,1371 /journal.pone.0132377

Redaktør: Adam J. Engler, University of California, San Diego, USA

Modtaget: 2. marts, 2015; Accepteret: 13 Juni 2015; Publiceret: 13 jul 2015

Copyright: © 2015 Jabbari et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger til EJ fra National Science Foundation under tilskud nr CBET1403545 og National Institutes of Health under tilskud nr AR063745. De finansieringsorganer havde ikke nogen rolle i udformningen eksperimenter eller som forberedelse til dette manuskript

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne viser ingen potentielle interessekonflikter

Introduktion

A væsentlig faktor dødelighed kræft er tilbagefald efter kirurgi, stråling eller lægemiddelterapi [1,2]. Brystkræft tilbagefald påvirker 30% af patienterne [3], mens op til 50% af colorectale cancerpatienter oplever tilbagefald [4]. Malignitet i kræft menes at være relateret til eksistensen af ​​en lille sub-population af stamceller (CSCS) i tumoren med forhøjet resistens over for kræftbehandling [5]. I overensstemmelse med det, den mest aggressive triple-negativ brystkræft eller metastatisk stadie III tyktarmskræft har den højeste underpopulation af CSCS blandt forskellige former [6,7]. Derfor forstå faktorer i tumor mikromiljø, der bidrager til CSC vækst er central for kræftbehandlingen [8].

Underlag stivhed påvirker slægt engagement og skæbne af stamceller [9]. En blød substrat dirigerer differentiering af mesenchymale stamceller (MSC’er) til neurogen afstamning henviser et substrat med mellemliggende og høj stivhed fører til differentiering af MSC’er til myogene og osteogene afstamninger, henholdsvis [10]. Substrat stivhed påvirker også skæbnen for maligne celler [11] som stivheden af ​​hyperplastisk erbB2 overudtrykker MCF10AT humane bryst epitelceller øges som reaktion på højere stivhed af kollagenmatrixen [12]. Rolle 3D matrix stivhed på vækst og markør udtryk for CSC delpopulation af kræftceller fra forskellige cellelinjer er ikke blevet undersøgt, og relationen mellem matrix stivhed, CSC vækst, og epitelial til mesenkymale overgang (EMT) er ikke kendt.

Da processen for kræft initiering kan tage lang tid, og det er vanskeligt at studere in vivo, in vitro-dyrkning er blevet udviklet til at studere CSCS. CSCS dyrkes i suspension på et ikke-vedhæftende substrat er morfologisk forskellig i forhold til i tumorvævet [13]. Naturlige ECM komponenter er almindeligt anvendt som en 3D-matrix til at fremme in vivo som morfogenese af CSCS [14], men biologiske matricer er i sagens natur variabel i sammensætning og variationer i matrix sammensætning kan ændre ligand /receptor-densitet [11]. Endvidere ligand-receptor-interaktioner og kemiske stimuli i biologiske matricer ofte maskere virkningen af ​​mekaniske stimuli på celler [15]. Vi har tidligere vist, at bryst CSCS selektivt vokse i ikke-klæbende polyethylenglycoldiacrylat (PEGDA) geler og danner tumorspheres når kræftceller er indkapslet i gelen [16,17]. På grund af fraværet af ligand-receptor-interaktion, har ikke-stamcelle population af de indkapslede celler ikke vokser i gelen, som førte til selektiv berigelse af CSCS. Vi har tidligere observeret en tofaset forhold mellem ekspressionen af ​​CSC markører og matrix stivhed for brystcancerceller [16]. Ændringen i væv stivhed med kræft progression kunne være en iboende reaktion fra CSC delpopulation at optimere vækst og udtryk for stamcelle markører. Humane HCT8 colorectalt carcinom celler udviste en metastatisk fænotype i 20-50 kPa stivhed interval [18] henviser osteosarcomceller interagerede optimalt med substrater ved 55 kPa stivhed [19]. Vi antager, at den optimale matrix stivhed for vækst og ekspression af CSC markører afhang af kræftceller ‘væv oprindelse. Derfor er formålet med dette arbejde var at undersøge effekten af ​​gel stivhed på vækst og markør udtryk for CSC delpopulation af kræftceller stammer fra forskellige væv. De testede kræftceller var MCF7 og MDA-MB-231 brystadenocarcinom, HCT116 colorektal carcinom, AGS gastrisk adenocarcinom, og U2OS osteosarcom humane cellelinjer med ikke-tumorigene MCF10A epitelcellelinie anvendt som kontrol. Micropatterning blev anvendt til at styre den gennemsnitlige størrelse af de CSC kolonier dannet af kræftceller i PEGDA gel.

Materialer og metoder Salg

Materialer

Lineær polyethylenglycol (PEG) med molekylvægt (MW) på 3,4 kDa blev indkøbt fra Acros (Pittsburg, PA). 4- (2-hydroxyethoxy) phenyl- (2-hydroxy-2-propyl) keton (Irgacure-2959) fotoinitiator var fra CIBA (Tarrytown, NY). Acryloylchlorid (Ac) og calciumhydrid var fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). De beskyttede aminosyrer og Rink amid NovaGel harpiks blev modtaget fra EMD Biosciences (San Diego, CA). Piperidin, tetrahydrofuran (THF), trimethylsilan (TMS), triethylamin (TEA), acrylsyre, dimethylsulfoxid (DMSO), og ethylendiamintetraeddikesyredinatriumsalt (EDTA) var fra Sigma-Aldrich. N, N-dimethylformamid (DMF), acetonitril (MeCN), N, N-diisopropylethylamin (DIEA), N, N’-diisopropylcarbodiimid (DIC), triisopropylsilan (TIPS), N, N-dimethylaminopyridin (DMAP), hydroxybenzotriazol (HOBt ), dichlormethan (DCM), og trifluoreddikesyre (TFA) blev modtaget fra Acros. Spectro /Por dialyserør (MW cutoff 3,5 kDa) var fra Spectrum Laboratories (Rancho Dominquez, CA).

MCF7 (HTB-22) brystadenocarcinom, MDA-MB-231 (HTB-26, i det følgende betegnet med MDA231) brystadenocarcinom, HCT116 (CCL-247) colorektalt carcinom, AGS (CRL 1739) gastrisk adenocarcinom, U2OS (HTB-96) osteosarcom cellelinier, og MCF10A (CRL-10317) ikke-tumorigene epitelceller blev indkøbt fra ATCC ( Manassas, VA). Phosphat-puffer saltvand (PBS) og Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) blev modtaget fra GIBCO BRL (Grand Island, NY). Hesteserum og DMEM-F12-medium var fra PAA Laboratories (Etobicoke, Ontario) og MediaTech (Manassas, VA), hhv. Trypsin-EDTA, RPMI-160 cellekulturmedium, føtalt bovint serum (FBS), Alexa Fluor 594 Phalloidin, og Quant-det PicoGreen dsDNA reagenskit var fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) og epidermal vækstfaktor (EGF) var fra Lonza (Allendale, NJ). Bovint serumalbumin (BSA) var fra Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA). Alexa Fluor Phalloidin, CellTracker rød CMTPX farvestof, og live /Dead cellernes levedygtighed kit var fra Molecular Probes (Life Technologies, Grand Island, NY). Paraformaldehyd, 4,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI), insulin, hydrocortison, koleratoksin, penicillin og streptomycin blev modtaget fra Sigma-Aldrich. Monoklonalt kaninantistof mod YAP /Taz transskriptionsfaktorer blev modtaget fra Cell Signaling (Danvers, MA).

makromer og peptidsyntese

hydroxylendegrupperne af PEG makromer blev omsat med acryloylchlorid at producere PEG-diacrylat (PEGDA), som vi beskrev tidligere [16,17]. Produktet blev oprenset ved udfældning i koldt ethylether to gange, dialyseret mod deioniseret (DI) vand fra DMSO og frysetørres. Den kemiske struktur af den funktionaliserede makromer var karakteriseret ved

1 H-NMR som vi beskrev tidligere [16]. Den acrylamid-terminerede CD44 bindende peptid Ac-RLVSYNGIIFFLK blev syntetiseret manuelt på Rink amid harpiks i den faste fase under anvendelse af en tidligere beskrevet procedure [20]. Efter spaltning fra harpiksen blev den Ac-terminerede peptid oprenset ved præparativ HPLC, lyofiliseres, og produktet blev karakteriseret med en Electro (ESI) spektrometer, som vi beskrev tidligere [20]. En lignende procedure blev anvendt til at syntetisere den krypterede (mutant) Ac-VLFGFLKIYSRIN peptidet.

Dyrkning af tumorceller

Følgende fremgangsmåde blev anvendt til indkapsling af tumorceller i PEGDA gel [16]. MDA231, MCF7, HCT116, og AGS tumorceller blev dyrket på adhærente vævskulturplader i RMPI-1640-medium med 10% FBS under 5% CO

2 henviser U2OS celler blev dyrket i DMEM medium ifølge leverandørens anvisninger. MCF10A celler blev dyrket i DMEM-F12-medium tilsat 0,5 mg /ml hydrocortison, 10 ug /ml insulin, 100 ng /ml koleratoksin, 20 ng /ml EGF og, 5% hesteserum ifølge leverandørens anvisninger. 2D cellekulturer blev trypsinbehandlet efter at have nået 70% konfluens og resuspenderet i PBS ved en densitet på 1×10

7 celler /ml. Gelforstadiet opløsning blev fremstillet ved opløsning af 100 mg PEGDA makromer i fotoinitiator-opløsning (10 mg Irgacure-2959 i 1 ml PBS) og opløsningen blev steriliseret ved filtrering. Dernæst blev et specificeret volumen af ​​tumorcellerne ensartet suspenderet i gelforstadiet opløsning ved forsigtig blanding til en endelig densitet på 0.3-2.0×10

6 celler /ml. Celle-suspenderede gel forstadium opløsning blev tværbundet ved UV-bestråling med en UV-lampe (Black-Ray, UVP, Upland, CA) ved maksimal bølgelængde på 365 nm som vi beskrev tidligere [16]. Den sammentrykkende modulus af cellen-indkapslede geler blev målt med et rheometer (TA Instruments, New Castle, DE) under en uniaksial trykkraft som vi tidligere beskrevet [16]. Precursor-opløsninger med 5, 10, 15, 20, og 25 vægt-% PEGDA makromer fremstillet celle-indkapslede geler med 2, 5, 25, 50 og 70 kPa kompressionskræfter moduli henholdsvis [16]. Efter tværbinding blev gelerne skåret i skiver og inkuberes i stamcelle medium til dannelse tumorspheres. Stamcelle medium bestod af DMEM-F12 suppleret med 0,4% BSA, 5 mg /ml insulin, 40 ng /ml bFGF, 20 ng /ml EGF, 5% hesteserum, 100 U /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin [21].

Micropatterning

følgende fremgangsmåde blev anvendt til indkapsling af cancerceller i en mikromønstrede gel. Til fysisk adskilt celle-indkapslet gellaget fra det stive glassubstrat blev 40 pi af gelen precursor-opløsning (25 vægt% PEGDA uden celler) overføres til et objektglas med kanterne dækket med et biomedicinsk kvalitet tape for at kontrollere gel tykkelse til inden for 100 um. Dernæst blev konstruktionen dækkes med et dækglas og UV bestrålet i 8 min. For at generere et mønster, blev UV masker designet med en AutoCAD software (AutoCAD 2010, Autodesk, San Rafael, CA) og udskrives på en gennemsigtig plade som beskrevet [22]. Glaskanterne blev dækket med et andet lag af tape, og 40 pi af cellen-suspenderede gel forstadium-opløsning blev overført til gelen-dækket objektglas blev UV maske placeret over opløsningen og presset mod klæbebånd med et glas objektglas, og UV bestrålet i 5 minutter. Efter gelering masken blev fjernet, blev cellen-indkapslede gel vasket med PBS og UV bestrålet i yderligere 3 min for at fuldføre gelering. Dernæst blev den mønstrede celle-indkapslet gel vasket med PBS, skrællet fra objektglasset, og dyrket i stænglen celledyrkningsmediet. For levende celle sporing blev tumorcellerne inkuberet med CellTracker farvestof (1: 1000 fortynding) før indkapsling og de farvede levende celler blev afbildet med et omvendt fluorescerende mikroskop (Nikon Eclipse Ti-ε, Melville, NY)

Tumorsphere billeddannelse og bestemmelse af celletal

levedygtighed de indkapslede celler blev bestemt to dage efter indkapsling hos live /Dead assay som vi beskrev tidligere [16]. For at måle størrelsen og antallet af de indkapslede tumorspheres blev cellekernerne og cytoskelettet visualiseret ved farvning med DAPI og phalloidin henholdsvis og afbildes med et Nikon fluorescensmikroskop som tidligere [16,17] beskrevet. Antal og størrelsesfordelingen af ​​tumorspheres blev kvantificeret ved at dele billederne i mindre kvadrater og tælle antallet af kugler og måle deres størrelse. Dobbeltstrenget DNA-indhold af gelerne, som et mål for celletal, blev målt med et Quant-det PicoGreen assay som tidligere beskrevet [23].

Real time PCR-analyse

Ved hvert tidspunkt blev prøver manuelt homogeniseret og sonikeret for at sprænge membranen af ​​indkapslede celler. Totalt cellulært RNA fra prøverne blev isoleret under anvendelse af TRIzol som tidligere beskrevet [23]. Efter revers transkription (Promega, Madison, WI), blev omdannet cDNA kvantificeret ved RT-qPCR med SYBR green RealMasterMix (Eppendorf, Hamburg, Tyskland) ved anvendelse af Bio-Rad CXF96 PCR (Bio-Rad, Hercules, CA) og det passende gen specifikke primere. Primere blev udformet og udvalgt ved hjælp Primer3 web-baseret software som beskrevet tidligere [24] og syntetiseret af Integrated DNA-teknologier (Coralville, IA). Listen over frem og bak primer sekvenser er angivet i tabel 1. De designede primersekvenser matchet med de rapporterede sekvenser for human CD44, ABCG2, CD133, OCT4, TGF-β, EGFR, og GAPDH [25-28]. PCR-data blev analyseret under anvendelse ΔΔct Realtids analysemetode som tidligere beskrevet [29]. mRNA udtryk blev normaliseret mod GAPDH henvisning genet og fold ændringer blev sammenlignet med dem i samme gruppe ved tiden nul.

Flowcytometri

De celle-indkapslede geler blev fikseret med 4% paraformaldehyd, vasket med PBS og inkuberet i oxidativ nedbrydning opløsning (0,1 M CoC

2 i 20% hydrogenperoxid) i 2 h [30]. Efter gel nedbrydning blev suspensionen centrifugeret, og cellerne blev vasket med kold PBS indeholdende 5% BSA. Derefter blev cellerne inkuberet med phycoerythrin (PE) muse-anti-humant CD24 og fluoresceinisothiocyanat (FITC) muse anti-humant CD44 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) i PBS med 5% BSA i 45 minutter på is i mørke. Derefter blev cellerne vasket med koldt PBS med 5% BSA og analyseret ved et flowcytometer (FC500, Beckman Coulter, Brea, CA).

immunblotting og proteinanalyse

Prøver blev homogeniseret i RIPA-buffer og de homogeniserede prøver blev centrifugeret i 5 min for at isolere de totale proteiner. Derefter blev proteinerne separeret ved standard SDS-PAGE under anvendelse af Mini-gel-system (Bio-Rad) og overført til en nitrocellulosemembran ved halvtør overførsel apparat (Bio-Rad). Membraner blev inkuberet i blokerende buffer ved omgivelsesbetingelser i 1 time efterfulgt af inkubation med primære antistoffer (1: 1000) natten over ved 4 ° C. Efter vask blev membranerne inkuberet med peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer (1: 5000) i 1 time ved omgivende betingelser. Efter grundig vask med en blanding af tris-bufret saltvand og Tween-20 (TBST) blev membranen inkuberet med ECL detektionsreagenser og eksponeret for en røntgenfilm. Intensiteten af ​​båndene blev kvantificeret med Image-J software (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

Statistisk analyse

Alle forsøg blev udført i tre eksemplarer og kvantitative data udtrykt som middel ± standardafvigelse. Signifikante forskelle mellem grupper blev evalueret ved anvendelse af en tovejs ANOVA med replikation test, efterfulgt af en to-tailed Students t-test. For at tage højde for flere par sammenligninger, blev p-værdier fra t-tests korrigeret ved hjælp Falsk Discovery Rate (FDR) metoden [31]. En værdi på p 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

afhængighed af tumorsphere vækst ved første celle seeding tæthed

Effekt af indledende celle såning tæthed på tumorsphere dannelsen blev undersøgt med MDA231 celler på optimal gel modulus på 5 kPa (figur 1). Gelen modulus for MDA213 celler er optimeret med hensyn til tumorsphere dannelse i det følgende afsnit om “Afhængighed af optimal matrix stivhed for CSCS på væv oprindelse.” DAPI og Phalloidin farves billede af de indkapslede celler som en funktion af initial celledensitet fra 0.3×10

6 til 2×10

6 celler /ml er vist i fig 1A på dag nul (venstre kolonne) og efter 9 dages inkubation (højre kolonne). CD44 cellemembranen glycoprotein anvendes som markør til karakterisering af bryst-, tyktarms-, mave-, hoved og hals, lever, ovarie, pancreas, og prostatacancer i kombination med andre CSC markører [5]. ABCG2 af ABC transportproteiner er en velundersøgte markør for bryst CSCS [32], og dens udtryk er opreguleret i MDA231 CSC delpopulation [33]. EGFR er opreguleret i MDA231 celler [34]. MDA231 celler indkapslet i gelen ved en relativt lav udsåningstæthed af 0.3×10

6 celler /ml forblev som enkelte celler efter 9 dage uden en væsentlig stigning i celleantal (fig 1B) eller CSC markør ekspression (Fig 1C-1E) . De indkapslede celler ved høje densiteter af 1,5×10

6 og 2×10

6 celler /ml viste celleaggregering (fjerde og femte rækker i fig 1A) og en betydelig stigning i celleantal efter 9 dage (Fig 1B), men indkapslede celler ikke danne tumorspheres som udtryk for CSC markører ikke er steget (figur 1C-1E). Omvendt de indkapslede celler ved moderat tætheder af 0.6×10

6 og 1×10

6 celler /ml dannet tumorspheres (anden og tredje rækker i fig 1A) med en signifikant stigning i celletal (figur 1B) og ekspression af CSC markører (fig 1C-1E, statistisk højere end grupperne med initial celledensitet på 0.3×10

6, 1,5×10

6 og 2.0×10

6 celler /ml, tabeller AC i S1-fil). Som det oprindelige cellepodning densitet blev øget fra 0.3×10

6 celle /ml til 0,6, 1,0, 1,5 og 2×10

6 celler /ml, celletal efter 9 dage steg fra 0,12 ± 0,04 celler /ml til 2,1 ± 0,2, 4,8 ± 0,3, 4,5 ± 0,4, og 5,8 ± 0,4 celler /ml, henholdsvis, mens CD44 markørekspression ændret fra 0,6 ± 0,1 til 25,0 ± 1,6, 29,0 ± 1,7, 3,3 ± 0,9 og 3,2 ± 0,8. Endvidere ekspressionen af ​​CD44, ABCG2, og EGFR markører efter 9 dage var signifikant højere end dag 6 (fig 1C-1E).

(A) DAPI (blå) og phalloidin (rød) farvede billeder af indkapslede MDA231 celler (5 kPa gel) på dag nul (venstre kolonne) og efter 9 dages inkubation (højre kolonne) versus oprindelige antal celler; (B) Antal indkapslede celler efter 9 dages inkubation som funktion af indledende celleantal; mRNA-ekspression af CD44 (C), ABCG2 (D), og EGFR (E) markører af de indkapslede celler efter 6 og 9 dages inkubation som funktion af indledende celleantal; (F) E-cadherin-mRNA-ekspression af de indkapslede celler efter 2, 4 og 6 dages inkubation som funktion af den initiale celletal. Skalaen barer i (A) er 200 um. En stjerne i (CE) angiver en statistisk højere (p 0,05) mRNA-ekspression i forsøgsgruppen i forhold til de grupper med initial celledensitet på 0.3×10

6, 1,5×10

6, og 2.0×10

6 celler /ml på samme tidspunkt. En stjerne i (F) angiver en statistisk højere E-cad udtryk i forsøgsgruppen i forhold til de grupper med initial celledensitet på 0.3×10

6, 0.6×10

6 og 1,0×10

6 celler /ml på samme tidspunkt. De p-værdier for stjernerne i (C-F) er anført i tabel A-D i S1 File. Fejllinjer svarer til middel ± 1 SD for n = 3.

E-cadherin mRNA ekspressionen af ​​de indkapslede celler (Fig 1F) steg ikke med inkubationstiden for første celle tætheder af 0.3×10

6, 0.6×10

6, og 1×10

6 celler /ml, men udtrykket steg betydeligt ved højere celledensiteter på 1,5×10

6 og 2×10

6 celler /ml (fig 1F, signifikant højere end de grupper med initial celledensitet på 0.3×10

6, 0.6×10

6, og 1,0×10

6 celler /mL, tabel D i S1 File). E-cadherin-mRNA-ekspression for den første celle seeding tæthed af 1,5×10

6 celler /ml steg fra 1,9 ± 0,7 til 6.6 ± 1,7 og 24,2 ± 2,7 efter 2, 4 og 6 dages inkubation, henholdsvis henviser udtrykket øget fra 3,7 ± 0,9 til 21.4 ± 1,8 og 40,3 ± 3,2 ved den højere podningstæthed af 2×10

6 celler /ml. De indkapslede MDA231 celler med initial cellepodning densitet på 0.6×10

6 celler /ml dannet lidt lavere antal sfærer sammenlignet med tætheden af ​​1,0×10

6 celler /ml. Derfor at minimere celleaggregering blev alle efterfølgende eksperimenter udført med den oprindelige celle seeding tæthed af 0.6×10

6 celler /ml.

afhængighed af tumorsphere vækst på dyrkningsmediet i 2D og 3D

grupper inkluderet MDA231 celler på 2D adhærente plader og dyrket i RPMI-1640 medium (2D-RPMI), celler på 2D plader og dyrket i CSC-medium (2D-CSC), og celler indkapslet i 5 kPa PEGDA gel og dyrket i CSC medium (3D-CSC). Cell-numre steget for alle grupper med inkubationstiden men stigningen var højere for de 2D grupper (fig 2A og 3D-CSC gruppe statistisk lavere celletal end 2D-grupper, tabel E i S1 File). For enhver tid punkt, celletallet for 2D-CSC-gruppen var en smule højere end 2D-RPMI men forskellen var ikke statistisk signifikant. For enhver tidspunkt, cellen nummer for 3D-CSC var væsentligt lavere end de 2D grupper, fordi cellevækst i ikke-klæbende PEGDA gel blev begrænset til stamceller delpopulation. Ekspressionen af ​​CD44, ABCG2, og EGFR CSC markører i 2D grupper (blå og grønne kurver) steg ikke med inkubationstiden og forskellen i markørekspression mellem 2D-1640 og 2D-CSC grupper var ikke signifikant (Fig 2B-D ). Udtrykket af CSC markører for cellerne i 3D-CSC gruppe var meget højere end i 2D-grupper (rød kurve Fig 2B-D, statistisk højere end 2D grupper, Borde F-H i S1 File). Resultaterne i figur 2 viste, at den højere ekspression af CSC markører for celler i 3D-CSC gruppe var relateret til indkapsling af cancerceller i PEGDA gel, ikke ændringen i dyrkningsmediet.

Number densitet (A) og mRNA-ekspression af CD44 (B), ABCG2 (C), og EGFR (D) markører for MDA231 celler som en funktion af inkubationstid. Grupper omfattede celler på 2D adhærente plader og dyrket i RPMI-1640 medium (2D-RPMI), celler på 2D plader og dyrket i CSC-medium (2D-CSC), og celler indkapslet i 5 kPa PEGDA gel og dyrket i CSC-medium ( 3D-CSC). En asterisk i (A) angiver en statistisk lavere (p 0,05) celleantal i forsøgsgruppen sammenlignet med 2D grupper på samme tidspunkt. En asterisk i (B-D) angiver en statistisk højere (p 0,05) mRNA-ekspression i forsøgsgruppen sammenlignet med 2D grupper på samme tidspunkt. De p-værdier for stjernerne i (A-D) er anført i tabel E-H i S1-fil. Fejllinjer svarer til middel ± 1 SD for n = 3.

(A) Procedure for celle indkapsling i mikromønstrede gel. CellTracker farves billeder af MDA231 celler indkapslet i 5 kPa gel med cirkulære mønstre med diameter på 50 (B), 75 (C), 100 (D), 150 (E), og 250 (F) um efter 2 dages inkubering ( skala barer i BF er 200 um). DAPI (blå) og phalloidin (rød) farvet billeder af 7 repræsentant tumorspheres dannes af de indkapslede celler i (BF) fra forskellige dele af mønstrede geler efter 14 dages inkubation med 50 (G), 75 (H), 100 (I ), 150 (J), og 250 (K) um mønstre (skala barer i GK er 50 um). Bemærk, at de 7 repræsentative tumorspheres i (G-K) er fra flere mønstre i gelen prøven, ikke et enkelt mønster, for at vise størrelsesområde og form af tumorspheres for et givet mønster størrelse. Celletal (L), gennemsnitlig tumorsphere størrelse (M), CD44-ekspression (N), og ABCG2 ekspression (O) af cellerne i (BF) med inkubationstiden for 50 (lyserød), 75 (blå), 100 (rød) , 150 (grøn), 250 (brun) um mønstre, og un-mønstrede gel (lilla). Fejl barer i (LO) svarer til gennemsnit ± 1 SD for n = 3.

afhængighed af tumorsphere vækst på niche størrelse

Micropatterning blev brugt til at styre gennemsnitlige tumorsphere størrelse i gelen (fig 3A). Fluorescerende billeder af CellTracker-farvede MDA231 celler i 5 kPa cirkulære gel mønstre med diametre på 50 til 250 um viste ensartet celle podning 2 dage efter indkapsling (figur 3B-3F). DAPI og phalloidin-farvede billeder af tumorspheres dyrkes i de mønstre med diametre på 50 til 250 um, er vist i Fig 3G-3K. Det skal bemærkes, at de syv tumorspheres vist i hvert billede (G-K) er fra flere mønstre i gelen prøven, ikke et enkelt mønster, for at vise størrelsesområde og formen af ​​tumorspheres for et givet mønster størrelse. Celleantal (fig 3 I) og gennemsnitlig tumorsphere størrelse (fig 3M) steg støt med inkubationstid og mønster størrelse. Til måling af celledensitet i de mønstrede geler (fig 3L), blev prøven størrelse normaliseret til den oprindelige celle seeding tæthed i geler. Vi spekulere, at efter celle såning CSC delpopulation voksede mens de differentierede celler, der påberåbes celle-matrix interaktion ikke vokse i ikke-klæbende PEGDA gel. Som følge heraf celledensiteten faldt en smule efter to dages inkubation (Fig 3L). Som de indkapslede CSCS voksede og dannede tumorspheres i gelen, den målte celledensitet forøget til værdier større end det oprindelige udsåningstæthed af 0.6×10

6 celler /ml. CD44 (Fig 3N) og ABCG2 (Fig 3O) markør udtryk for tumorspheres dannet i un-mønstrede gel og de geler med 75-250 um mønstre oprindeligt steget med inkubationstid, toppede på dag 9, og faldt derefter. På den anden side, markør ekspression af disse tumorspheres dannet i 50 um mønstrede gel støt med inkubationstid i 14 dage (lyserød linie i fig 3N og 3O). CD44 markør ekspression af tumorspheres i 150 um mønstrede gel ændret fra 3,7 ± 0,5 til 21 ± 2, 67 ± 3, og 49 ± 2 efter 2, 6, 9, og 14 dage henholdsvis hvorimod CD44 ekspression af disse tumorspheres i 50 um mønstret gel ændret fra 2,1 ± 0,7 til 15 ± 1, 34 ± 2 og 43 ± 2. Baseret på micropatterning resultater, udtryk for CSC markører for MDA231 celler afhængige af tumorsphere størrelse og 50 um størrelse kugler havde højeste udtryk for CSC markører. Derfor, i alle efterfølgende eksperimenter kræftceller blev indkapslet i un-mønstrede geler men inkubationstiden var begrænset til 9 dage for at kontrollere gennemsnitlige tumorsphere størrelse.

Flowcytometri blev anvendt til at kvantificere CSC fraktion (CD44

+ /CD24

-) af MDA231 tumorspheres dyrkes i fem kPa PEGDA gel [35]. Gelen modul for MDA213 celler er optimeret med hensyn til tumorsphere dannelse i det følgende afsnit om “Afhængighed af optimal matrix stivhed for CSCS på væv oprindelse.” Som kun MDA231 celler blev anvendt, alle PEGDA-indkapslede tumorspheres (un-mønstrede og mønstrede) til flowcytometri eksperimenter blev dyrket i 5 kPa gel. Grupper omfattede celler dyrket på adhærente vævskulturplade (TCP, Fig 4A), celler på ikke-klæbende TCP (suspensionskultur, fig 4B), celler indkapslet i Matrigel med 500 Pa stivhed [36] (Fig 4C), celler indkapslet i un-mønstrede 5 kPa PEGDA gel (fig 4D), og i 50 um mønstrede gel (fig 4E). Alle grupper blev dyrket i 8 dage. CSC brøkdel af MDA231 celler dyrket på vedhængende plader var 8,3% tæt på den tidligere rapporterede CSC fraktion [37], som steg en smule til 11% af suspension kultur og 9,3% ved indkapsling i Matrigel. Indkapsling af MDA231 celler i 5 kPa un-mønstret og 50 um mønstrede geler markant øgede CSC fraktion til 48% og 70%, hhv.

MDA231 celler dyrket på adhærente vævskulturplade (TCP, A), ikke-klæbende vævskulturplade (suspension, B), ved indkapsling i Matrigel (C), indkapsling i un-mønstrede 5 kPa PEGDA gel (D), og indkapsling i 50 um mønstret 5 kPa PEGDA gel; (F) CSC brøkdel af de MDA231 celler i (AE) som sub-population af celler i fjerde kvadrant (CD44

+ /CD24

-)

Afhængighed af optimal. matrix stivhed for CSCS på væv oprindelse

effekten af ​​væv oprindelse på optimal matrix stivhed for vækst og ekspression af CSC markører blev undersøgt med MCF7 og MDA231 bryst, HCT116 colorectal, AGS gastrisk og U2OS osteosarcomceller indkapslet i PEGDA geler med kompressionskraft modulus intervallet fra 2 til 70 kPa. Ikke-tumorigene MCF10A celler ikke danne tumorsphere (første kolonne i figur 5A), hvorimod alle kræftceller dannede tumorspheres efter 9 dages indkapsling i gelen (Fig 5A). Stigningen i celleantal, sfære nummer og kugle størrelse med inkubationstiden afhang af cancer celletype (fig 5B-5D). 20% af de MCF7 tumorspheres havde 60-80 um størrelsesområde sammenlignet med 75% for MDA231 i 5 kPa gel (fig 5E). 10% af de dårligt invasive AGS tumorspheres havde 40-60 um størrelsesområde sammenlignet med 70% for moderat-invasiv HCT116 i 25 kPa gel (fig 5E). 70% af de moderat-invasive U2OS tumorspheres i 50 kPa gel havde størrelser 40 um (figur 5E). Cellen antal triple-negative (claudin-lav) MDA231 og luminale-A MCF7- brystkræftceller [38] efter 9 dage indkapsling i det 5 kPa gel var 1,6 ± 0.1×10

6 og 1,0 ± 0.1×10

6 celler /ml;