PLoS ONE: Øget ekspression af Chemerin i Pladecellekræft kræft i spiserøret myofibroblaster og rolle i Rekruttering af Mesenchymale Stromal Cells

Abstrakt

Stromaceller såsom myofibroblaster indflydelse tumor progression. Mekanismerne er uklar, men kan indebære virkninger på både tumorceller og rekruttering af knoglemarv-afledte mesenkymale stromale celler (MSC), som derefter koloniserer tumorer. Brug af iTRAQ og LC-MS /MS identificerede vi adipokine, chemerin, som overudtrykt i esophageal squamous cancer associeret myofibroblaster (CAMs) sammenlignet med tilstødende væv myofibroblaster (ATM). Den chemerin receptoren, ChemR23, udtrykkes af MSC. Konditionerede medier (CM) fra CAM’er steg betydeligt MSC cellemigrering i forhold til ATM-CM; virkningen af ​​CAM-CM var signifikant reduceret med chemerin-neutraliserende antistof, forbehandling af CAM’er med chemerin siRNA, forbehandling af MSC’er med ChemR23 siRNA, og ved en ChemR23 receptorantagonist, CCX832. Stimulering af MSC’er ved chemerin øget phosphorylering af p42 /44, p38 og JNK-II kinaser og inhibitorer af disse kinaser og PKC omvendt chemerin-stimuleret MSC migration. Chemerin stimulering af MSC’er induceret også ekspression og sekretion af makrofag-inhibitorisk faktor (MIF), som havde en tendens til at begrænse vandrende reaktioner på lave koncentrationer af chemerin men ikke højere koncentrationer. I en xenograft model, som består af OE21 esophageal cancerceller og CAM’er, homing af MSC’er administreret i.v. blev inhiberet af CCX832. Således chemerin udskilles fra esophageal kræft myofibroblaster er en potentiel kemoattraktant for MSC og dets hæmning kan forsinke tumorprogression

Henvisning:. Kumar JD, Holmberg C, Kandola S, Steele I, Hegyi P, Tiszlavicz L, et al . (2014) Øget ekspression af Chemerin i Pladecellekræft kræft i spiserøret myofibroblaster og rolle i Rekruttering af Mesenchymale stromacellers. PLoS ONE 9 (8): e104877. doi: 10,1371 /journal.pone.0104877

Redaktør: Ajay Pratap Singh, University of South Alabama Mitchell Cancer Institute, USA

Modtaget: May 6, 2014 Accepteret: 15 Juli 2014; Udgivet: 15 August, 2014

Copyright: © 2014 Kumar et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Cancer Research UK (AV), NIHR (AV), National Institute of Health /NCI (5U54CA126513, TCW, AV) og ungarsk videnskabelig forskning Fund (NF100677, PH), Wellcome Trust (AV, CH, SK). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. TC og MP aflønnes medarbejdere ChemoCentryx. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker om datadeling og materialer. De andre forfattere har ingen interessekonflikter.

Introduktion

Betydningen af ​​tumor mikromiljø i fastlæggelsen af ​​kræft celle vækst og spredning er nu anerkendt [1]. Stromale celletyper, der bidrager til mikromiljøet indbefatter inflammatoriske og immune celler, endotelceller pericytter og fibroblast cellelinier [2]. I tilfælde af sidstnævnte en voksende mængde af data viser, at kræft-associerede fibroblaster (cafeer), hvoraf myofibroblaster er en fremtrædende undertype, adskiller sig fra deres kolleger i normalt væv [3], [4], [5]. Der er også en voksende erkendelse af, at knoglemarv afledt mesenkymale stromale (stamceller) celler (MSC) kan påvirke kræft progression ved migration til tumor steder, hvor de kan differentiere i en række forskellige celletyper, herunder myofibroblaster [6], [7]; de kan også være nyttige som køretøjer til at give målrettet anticancerterapi [8]. Selv om der er evidens for chemokin involvering i MSC rekruttering mekanismerne stadig dårligt forstået [9], [10].

Kræft i spiserøret, anses for at udgøre næsten en halv million dødsfald om året på verdensplan. Adenocarcinom, forbundet med tilbagesvaling og fedme opstår på en baggrund af Barretts øsofagus og er stigende i forekomst i de vestlige samfund; esophageal planocellulært karcinom (ESCC) er forbundet med rygning, alkoholforbrug og dårlig kost og er af høj forekomst i udviklingslandene [11]. Der er en voksende forståelse af den rolle, cafeer /myofibroblaster i ESCC især fremme kræft invasion og angiogenese selvom generelt disse forbliver dårligt forstået [12], [13].

Chemerin (Tazaroten induceret gen 2, TIG2 ; retinsyrereceptor responder 2, RARRES2) er en 18 kDa chemokin-lignende protein, der virker på ChemR23 (chemokin-lignende receptor 1, CMKLR1) [14], [15]. Det secerneres som et inaktivt forstadium, der aktiveres af en række ekstracellulære proteaser, der fjerner en C-terminal hexapeptid at befri en 157 aminosyre aktiv form; Det udtrykkes i adipocytter, lever og placenta og har roller i adipogenese og leukocyt kemotaksi herunder rekruttering af dendritiske og naturlige dræberceller (NK) celler til steder med inflammation eller cancer [16], [17], [18], [19] . I den foreliggende undersøgelse identificerede vi forøget ekspression af chemerin i ESCC cancer-associerede myofibrobroblasts (CAMs) sammenlignet med tilstødende væv myofibroblaster (ATM), og fandt udtryk for sine beslægtede receptor ChemR23- af MSC. Vi hypotese derfor, at chemerin fungerer som en MSC kemoattraktant og vi præsenterer her beviser til støtte hypotesen.

Materialer og metoder

Celler

myofibroblaster blev genereret fra tumorer og tilstødende væv af patienter med ESCC bruger tidligere beskrevne metoder (tabel S1 i File S1) [20], [21], og blev brugt mellem passagerne 3 og 10. Dette arbejde blev godkendt af den etiske komité ved University of Szeged, Ungarn og alle fag gav informeret samtykke. ESCC celler (OE21) og humane navlevene endotelceller (HUVEC) blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Human knoglemarv afledte mesenchymstamceller blev anvendt ved passager 3-12 i deres udifferentierede tilstand; op til passage 12 de udstillede fedtcellerne, osteocyt og chondrocytter differentiering i fedtcellerne, osteocyt og chondrocytter differentiering medier (Lonza, Cambridge, UK); cellerne var CD105, CD166, CD29, CD44, α-SMA og vimentin positive og var CD14, CD34, CD45, cytokeratin og desmin negativ.

Cell Culture

myofibroblaster blev dyrket som tidligere beskrevet [20]. MSC blev opretholdt i en udifferentieret tilstand i MSCGM (Lonza), der indeholder basalt medium og MSC vækst kosttilskud. Celler blev holdt ved 37 ° C i 5% v /v CO

2; HUVEC’er blev opretholdt i EGM-medium og anvendtes ved passagerne 5 til 9; OE21 celler blev dyrket i RPMI-1640 suppleret med 10% v /v FBS, 1% v /v penicillin-streptomycin, 2% vol /vol L-glutamin. Salg

konditionerede medier Salg

myofibroblaster (1,5 × 10

6 celler) blev udpladet i T-75 falcon kolber og opretholdt ved 37 ° C i 5% v /v CO

2 i 24 timer i fuld medier (FM). Kulturer blev derefter vasket 3 gange med sterilt PBS og inkuberet i 15 ml serumfri (SF) media i 24 timer. Konditionerede medier (CM) blev opsamlet, centrifugeret (7 min, 800 x g, 4 ° C), og portioner blev opbevaret ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse.

Immuncytokemi

Celler blev paraformaldehyd (PFA) -Rettet (4% vægt /volumen), permeabiliseres med 0,2% Triton X-100 i PBS (PBS-T) i 30 minutter og forarbejdet til immuncytokemi som tidligere beskrevet [22] ved brug af primære antistoffer mod CD105, CD34, CD29 (Ancell Corporation, Bayport, MN), α-SMA, vimentin, desmin, pancytokeratin (Fitzgerald, NJ), ChemR23 (Millipore, MA,) eller GPR1 (Abcam, Cambridge, UK) efterfulgt af inkubation med det passende fluorescein eller Texas Red mærkede sekundære antistoffer i æsel (Jackson Immunoresearch, Soham, UK), og monteres med Vectashield

® indeholder DAPI (Vector Laboratories, Peterborough, UK). Slides blev vist ved hjælp af en Zeiss Axioplan-2 mikroskop (Zeiss Vision, Welwyn Garden City, UK). Billeder blev taget med et JVC-3 charge-coupled device-kamera på 40 × forstørrelse med KS300 software (Imaging Associates, Bicester, Oxfordshire, UK).

proteomiske analyse

secretome af esophageal myofibroblaster blev undersøgt efter iTRAQ mærkning af proteiner i medier efterfulgt af LC-MS /MS som tidligere beskrevet (se Methods S1) [3]. blev søgt formodede chemerin mål i MSC efter SILAC mærkning af celler efterfulgt af udsættelse for chemerin (R .. D Systems) blev anvendt til at myofibroblastlignende medier i overensstemmelse med producentens anvisninger

Cell migration analyser

Transwell migration blev udført ved hjælp af BD indsatse (BD Bioscience, Californien) som tidligere beskrevet [25] beskæftiger chemerin (R Köln, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Hver transfektion anvendt 2 ug DNA (5 x 10

5 celler) og 100 pi af komplet nucleofector opløsning. Transfektion blev opnået ved anvendelse af program U-23 (for høj transfektionseffektivitet) ved tilsætning af 500 pi af forvarmet dyrkningsmedium til kuvetten og overførsel af prøver til T-75-kolber med 20 ml frisk fremstillet medium.

MSC homing til xenografter

Alle eksperimenter dyr blev udført efter godkendelse af University of Liverpool dyrevelfærd udvalg og var i overensstemmelse med de britiske Dyr (videnskabelige procedurer) Act 1986 (PPL 40/3137) .Til undersøgelse MSC rekruttering til xenotransplantater blev 6-8 uger gamle immunkompromitterede BALB /c nu /nu mus (Charles River, Wilmington, MA) injiceret sc med OE21 celler (10

6) alene eller med CAM’er (5 x 10

5). Mus med tumorer af sammenlignelig størrelse (1,0-1,2 cm i diameter) modtog efterfølgende CCX832 (2 mg /ml, 125 pi, iv), eller et køretøj, fulgt efter 24 timer af en anden dosis og MSC’er mærket med PKH67 (7,5 × 10

5). Efter 24 timer blev tumorer dissekeret, fikseret i 4% PFA og forarbejdet til lokalisering af fluorescerende celler.

Statistik Salg

De endelige resultater blev beregnet som middelværdi ± standardfejl af middel (SEM). Student t-test og ANOVA blev udført på de data som er relevant med signifikans ved p ≤ 0,05 hjælp Systat Software Inc. (London, UK), medmindre andet er angivet.

Resultater

Øget chemerin udtryk i skællede esophageal WEBCAMS

myofibroblaster identificeret ved α-SMA-ekspression blev fundet i større antal og udstillet forstyrret morfologi og arkitektur i ESCC sammenlignet med tilstødende væv (fig S1 i File S2). Dyrkede myofibroblaster fra disse tumorer og tilstødende væv udtrykt α-SMA og vimentin, men ikke desmin eller cytokeratin; CM fra CAM stimulerede vækst og migration af OE21 celler sammenlignet med ATM-CM (fig S2, S3 i File S2). Brug iTRAQ mærkning efterfulgt af LC-MS /MS for at identificere potentielle celle signalmolekyler udskilt af CAM, fandt vi øget chemerin overflod i CAM medier sammenlignet med ATM fra alle fire par ESCC prøver (Fig S4 i File S2; Table S3 i File S1). Western blotting bekræftet øget chemerin i CAM sammenlignet med ATM medier (Fig 1A), og ELISA medier angivet 2,1 ± 0,4 gange højere chemerin sekretion af CAM

vs

pengeautomater. I celleekstrakter, Western blots viste beskeden, men signifikant forhøjet chemerin i Cams end deres parrede pengeautomater (Fig S5 i File S2). En formodet chemerin receptor, ChemR23, blev udtrykt af MSC’er (se nedenfor), og chemerin stimulerede koncentrationsafhængig migration af MSC’er i to forskellige assays (Fig 1B). Desuden CAM-CM stimuleret MSC migration og svaret var signifikant større end til ATM-CM (Fig 1C, til venstre). Direkte bevis for en rolle chemerin som en aktiv bestanddel af CAM-CM blev tilvejebragt ved den observation, at immunoneutralisation af chemerin inhiberede virkningen af ​​CAM-CM (fig 1C, midten); derudover siRNA knockdown af chemerin udtryk faldt aktiviteten af ​​CM efterfølgende anvendt på MSC i migration assays (Fig 1C, højre, Fig S6 i File S2)

En

.. Repræsentant Western-analyse af chemerin i medier fra ESCC cams og pengeautomater (til venstre). Kvantitativ analyse ved densitometri af chemerin overflod i medier fra ESCC cams og pengeautomater (n = 4 forskellige par myofibroblaster) (til højre).

B

. Koncentrationsafhængig stimulering af MSC migration ved chemerin i scratch sår migration assays (til venstre) og Boyden kammer migration assays (højre) (n = 3).

C

. Øget migration af MSC’er i Boyden kamre som respons på konditioneret medium (CM) fra CAM’er og deres respektive pengeautomater (venstre) (n = 4 forskellige par myofibroblaster). Stimulering af MSC migration af CAM-CM blev inhiberet af chemerin neutraliserende antistof (Chem.Ab; 10 ug /ml) (i midten). MSC migration blev nedsat som reaktion på CM fra CAM1 og CAM4 celler transficeret med chemerin siRNA # 3 (højre). Vandrette pile, p. 0,05, t-test (n = 3)

ChemR23- udtrykt af MSC medierer vandrende svar til chemerin

Udtrykket i MSC af den formodede chemerin receptoren, ChemR23, er blevet identificeret af gen-array [28], og vi bekræftede udtryk for denne og en anden formodet receptor, GPR1 [29], ved immunocytokemi. Knockdown af siRNA ChemR23 (Fig 2A, venstre, Fig S7 i File S2) hæmmede signifikant vandrende reaktion på både chemerin (Fig 2A, i midten) og CAM-CM (Fig 2A, højre), mens knockdown af GPR1 haft ringe effekt. En ChemR23 antagonist, CCX832, dosisafhængigt inhiberede MSC migration som reaktion på chemerin (Fig 2B, venstre og i midten) og CAM-CM (fig 2B, højre), mens en inaktiv analog, CCX826 havde ingen effekt; hæmning af CAM-CM ved CCX832 svarede til opnås ved immunoneutralisation (Fig 2B, højre).

En

, Repræsentative billeder fra MSC farvet for vimentin (positiv kontrol) og ChemR23- afslørende knock-down (KD) efter ChemR23 siRNA behandling (til venstre). Knockdown af ChemR23, men ikke GPR1, inhiberet MSC migration som reaktion på chemerin (100 ng /ml) (i midten) og CAM-CM (højre).

B

, koncentrationsafhængig hæmning af MSC migration som reaktion på chemerin af ChemR23 antagonisten CCX832 (venstre), men ikke kontrol Forbindelse CCX826 (1 uM) (i midten). MSC migration som reaktion på CAM-CM blev inhiberet på samme måde af chemerin neutraliserende antistof og CCX832, men ikke CCX826 (1 uM) (højre).

C

, Repræsentative Western blot shows øget phosphorylering af p42 /44, p38 og JNK-II kinaser i MSC’er behandlet med chemerin (100 ng /ml) (venstre). I Boyden kammer assays blev chemerin-stimuleret MSC migration inhiberet af JNK-II inhibitor, SP600125 (50 uM), den p42 /44-inhibitor, UO126 (10 uM), p38-inhibitor SB202190 (3 uM), og PKC-inhibitoren Ro320432 (2 uM), men ikke af PIK3 inhibitoren LY294002 (50 uM) (højre). Vandrette pile, p 0,05, ANOVA (n = 3 i hvert tilfælde)

Chemerin stimulation af protein kinase veje medierer MSC vandrende reaktioner

Chemerin omgående øget fosforylering af flere proteinkinaser. herunder p42 /44, p38 og JnkII kinaser i MSC’er (fig 2C, venstre). Inhibitorer af alle tre kinaser reducerede signifikant vandrende reaktion af MSC’er til chemerin men inhibering af PI-3-kinase under anvendelse af LY294002 havde nogen virkning. Den PKC inhibitor Ro320432 også hæmmet migration, og kombinationen af ​​Ro320432, U0126, SP600125 og SB202190 fuldstændig hæmmet vandrende reaktioner (Fig 2C, højre). Dokumentation for, at PKC-aktivering var opstrøms for MAP-kinase stimulation leveres af den observation, at PMA stimulerede MSC migration og dette blev inhiberet af U0126, SP600125 og SB202190; desuden PMA stimulerede phosphorylering af p42 /44, p38 og JnkII kinaser (Fig S8 i File S2). Der var en markant reduktion i phosphorylering af p42 /44, p38 og JnkII kinaser efter ChemR23 knockdown hjælp siRNA i overensstemmelse med tanken om, at disse kinaser er nedstrøms ChemR23 (Fig S8 i File S2).

Chemerin øger MIF udtryk i MSC, der fastholder migration

for yderligere at definere formodede mål for chemerin vi anvendte SILAC og LC-MS /MS til identifikation af proteiner i celleekstrakter og medier af MSC’er behandlet med chemerin i 24 timer. Uventet, MIF blev øget i chemerin-stimulerede celler (Tabel S4 i File S1, Fig S9 i File S2). Western blot bekræftet, at chemerin, samt IGF-II anvendt som en positiv kontrol, øget MIF i celleekstrakter og medier (Fig 3A, venstre), og ved anvendelse af ELISA var der ca. 10 gange højere MIF koncentrationer i medierne efter chemerin behandling. Efter ChemR23- knockdown MIF respons på chemerin var dybt hæmmet (Fig 3A, midten). I nærvær af MIF, blev MSC vandrende reaktion på chemerin inhiberet med ca. 50% (Fig 3A, højre). For at bestemme den funktionelle betydning af MIF i MSC migration vi ansat MIF antagonist ISO-1; dette undertrykte effekten af ​​MIF hæmme chemerin-stimuleret MSC migration, og signifikant øget den vandrende reaktion MSC’er til chemerin (Fig 3B). Tilsvarende MIF knockdown (Fig S10 i File S2) steg MSC migration som reaktion på lave koncentrationer af chemerin (4 ng /ml), men interessant svaret på chemerin ved højere koncentrationer (20 ng /ml) var ikke påvirket af MIF knockdown ( fig 3C)

En

, Repræsentative Western blots viser MIF i MSC medier (øverst til venstre) og celleekstrakter (nederst til venstre), der blev behandlet med chemerin (Ch;. 100 ng /ml) eller IGF -II (100 ng /ml) i 15 min. ChemR23- knock-down faldt MIF frigivelse som reaktion på chemerin (i midten). Chemerin-stimuleret MSC migration blev inhiberet af MIF (200 ng /ml) (højre).

B

, Undertrykkelse af MIF signalering med ISO-I (50 uM) yderligere øget chemerin-stimuleret migration.

C

, MIF knock-down i MSC øget migration som svar på 4 ng /ml, men ikke 20 ng /ml chemerin. Vandrette pile, p 0,05, t-test (n = 3)

Chemerin stimulerer MSC migration over endotelceller og kræver MMP-2

De data implicerer chemerin i rekrutteringen. af MSC’er til cam-holdige kræft mikromiljøer.

In vivo

dette kræver transendothelial migration og så vi undersøgt, om chemerin var i stand til at stimulere MSC migration gennem et monolag af endothelceller tidligere dannet på Boyden kamre. MSC’er mærket med PKH67 (Fig 4A, venstre) blev identificeret som migrere som respons på chemerin (Fig 4A, i midten) og CAM-CM (fig 4A, højre), og den vandrende respons blev inhiberet af CCX832 men ikke CCX826. Udskilles proteaser, der kan give transendothelial migration blev derefter søges i protein lister opnået fra SILAC-mærkede MSC’er behandlet med chemerin. Abundant MMP-2 blev identificeret i chemerin-stimulerede prøver (Tabel S5 i File S1) og Western blots (fig 4B, venstre) og MMP-2 enzymaktivitetsassays (Fig 4B, højre) bekræftede øget overflod i medier som reaktion på chemerin. I migrationstudier, tilsætning af MMP-2 stimulerede MSC migration og dette var signifikant reduceret med en MMP-2-inhibitor (Fig 4C venstre). Samme inhibitor også væsentligt reduceret MSC transendothelial migration i respons på chemerin (Fig 4C, højre).

En

, Repræsentative felter fra MSC transendothelial migrationseksperimenter viser migrering af PKH67-mærkede MSC’er (venstre ). CCX832 (1 uM) inhiberede chemerin- (i midten) og CAM-CM stimulerede MSC transendothelial migration men CCX826 (1 uM) havde ingen effekt (til højre).

B

, Chemerin, og IGF-II anvendt som en positiv kontrol, straks (30 min) stimulerede proMMP2 overflod i medier som påvist ved Western blot, men havde ingen virkning på cellulær proMMP2 overflod (venstre); chemerin steg betydeligt MMP-2-enzymaktivitet i MSC medier detekteres af selektive substrat MCA-Pro-Leu-Ala-Nva-Dpa-Ala-Arg-NH

2 (højre).

C

, Human rekombinant MMP-2 (80 ng /ml) stimulerede transendothelial migration og der var dosisafhængig inhibering med en MMP-2 selektiv inhibitor (MMP-2-inhibitor I) (venstre). MMP-2-inhibitor (60 uM) signifikant inhiberede chemerin-stimuleret MSC transendothelial migration (i midten). Vandrette pile, p 0,05, t-test (n = 3)

I en xenograft model, MSC målsøgende stimuleres af knaster og hæmmes af CCX832

På grundlag af. de ovenfor beskrevne data, vi antaget, at

in vivo

chemerin medierer MSC homing til tumorer, der består af kræftceller og CAM. I en xenograft model af OE21 celler i nøgne mus, matchede tumorer af lignende størrelse (1,0-1,2 cm i diameter) dannet med og uden samtidig administration af CAM’er blev undersøgt efter efterfølgende i.v. injektion af PKH67-mærkede MSC’er. Mærkede celler i xenotransplantater blev forhøjet i tumorer i OE21 og CAM’er forhold til OE21 celler alene (Fig 5A). Forbehandling af mus med ChemR23 antagonisten CCX832 inden injektion MSC væsentligt reduceret antallet af mærkede celler i xenotransplantaterne hvilket viser en rolle for chemerin i MSC rekruttering

in vivo

(Fig 5B).

En

, Visualisering af PKH67-mærkede MSC’er i repræsentative felter fra xenografter oprettet med OE21 cancerceller alene eller co-injiceret med CAM efterfulgt af behandling med køretøjet (øverst) eller CCX832 (nederst) og iv injektion af PKH67- mærkede MSC’er.

B

, I xenografter med OE21 cancerceller og CAM der blev øget MSC homing udtrykt som mærkede celler per arealenhed af xenograft sammenlignet med xenografter af OE21 kræftcelle alene; behandling med CCX832 inhiberede homing (OE21 /bærestof, n = 3; OE21 /CCX832, n = 4; OE21 og CAM’er /bærestof, n = 6; OE21 og CAM’er /CCX832, n = 6). Vandrette pile, p 0,05, ANOVA

Diskussion

Der er stigende tegn på, at MSC migrere til tumorer hvor de bidrager til tumorvækst [6], [30].. Mekanismerne i homing og migration forblive ufuldstændigt forstået. I denne undersøgelse giver vi bevis for, at ekspression af chemokin-lignende peptid, chemerin, forøges i CAM’er fra ESCC og virker som en kemoattraktant for MSC’er via aktivering af G-protein-koblet receptor ChemR23. En lille molekyle antagonist ChemR23, CCX832, hæmmede virkningen af ​​chemerin både

in vitro

og i en xenograft model

in vivo

. Resultaterne identificerer chemerin som en ny CAM-afledt faktor for MSC rekruttering til tumorer.

Tidligere undersøgelser har rapporteret en række forskellige roller for CAF, CAM og relaterede celler i progression og respons på behandling af en række kræftformer, herunder prostata, bryst, mave, lunge og tyktarm [2], [31], [32], [33], [34], [35]. Kammene anvendes til den foreliggende undersøgelser blev afledt af tumorer, hvori myofibroblastdifferentiering nummer, arkitektur og morfologi blev sprængt; desuden CM fra disse CAM fremkaldte en mere aggressiv fænotype i kræftceller (spredning, migration) sammenlignet med CM fra pengeautomater. Mere generelt er handlinger myofibroblaster rapporteret at være både positiv og negativ på kræft celledeling og migration, og der er også virkninger på angiogenese, og modulation af immun mekanismer [3], [12]. Men mens MSC homing til kræft sites er anerkendt, har særlige rolle myofibroblaster i denne proces været uklar. De nuværende data tyder ikke bare, at CAM er aktive deltagere i MSC ansættelse, men også, at en bestemt mægler, chemerin er differentielt udtrykt i CAM og pengeautomater.

Chemerin opstået gennem en proteomisk undersøgelse af myofibroblastlignende secretomes. Der er stigende interesse for anvendelse af proteom undersøgelser for at definere secretomes af stromaceller, men selv så disse forbliver mindre godt undersøgt end kræft celle secretomes. Tidligere secretome undersøgelser på begge fibroblastiske afstamningsceller og MSC’er har identificeret nogle af molekylerne, der findes i den foreliggende undersøgelse navnlig ECM-proteiner, MMP’er, IGFBP’er; signalmolekyler identificeret i disse undersøgelser omfatter SDF-1, HGF, EGF og andre kemokiner [36], [37]. Vores indledende identifikation af chemerin blev foretaget i alle fire par celler undersøgt og valideret af Western blot og ELISA af medier, der tilsammen viser, at chemerin bør betragtes som en ny formidler af myofibroblastdifferentiering cellesignalering.

Chemerin udtrykkes normalt af adipocytter, lever, lunge og andre celler. I en række af cancere, herunder squamøs hudkræft, melanom, prostata, lunge, bryst og hepatocellulært carcinom, nedsat chemerin ekspression er forbundet med uheldige udfald. Men det er værd at bemærke, at tidligere arbejde har ikke, for det meste, taget hensyn til forskellige mønstre af udtryk for chemerin i tumor epitelceller sammenlignet med stromale celler [18], [38]. Da chemerin er en kemoattraktant for NK-celler og dendritiske celler [14], [16], [19] er det blevet foreslået, at tab af chemerin giver tumorer at unddrage sig de immun forsvarsmekanismer, der hæmmer tumorigenese [18], [38], [ ,,,0],39]. Dog kan esophageal celler give en tolerogenisk miljø [40], der afbøder de beskyttende virkninger af chemerin. Desuden er der i mavekræft der er øget plasma chemerin og chemerin stimulerer cancercelleinvasion

in vitro

[41]. Således kan chemerin udøve både positive og negative effekter på tumorudvikling.

Der er flere potentielle roller for chemerin frigivet af CAM’er herunder modulering af kræft og immuncelle funktion og angiogenese. Vi fandt, at beslægtede receptor ChemR23 blev udtrykt af MSC’er og at chemerin var en kemoattraktant for disse celler. Siden receptor knockdown, immunoneutralisation og en ChemR23 receptorantagonist kun delvist hæmmet virkningerne af CAM-CM, er der sandsynligvis også være andre CAM kemoattraktanter. Vi foreslår chemerin er en god kandidat til yderligere undersøgelse ikke mindst på grund af tilgængeligheden af ​​receptorantagonister. Mekanismerne i kemotaksi omfatter aktivering af PKC og af flere downstream kinase veje herunder p42 /44, p38 og JNK-II-kinaser, som alle synes at spille en rolle. I det mindste delvis disse intracellulære signalsystemer mekanismer kan ligne dem beskrevet i andre celler, der udviser chemerin-stimulerede kemotaxi herunder dendritiske celler [14].

Tidligere undersøgelser har vist, at en række forskellige vækstfaktorer og chemokiner stimulere MSC migration, herunder HGF, TNF, SDF-1, CXCL12, CXCL13, CHCL16 og CCL22 [42], [43]. MSC der vandrer tværs endotel ved kemokin-medierede mekanismer, som også involverer matrixmetalloproteinaser især MMP-2 [43], [44], [45], [46], [47]. Vi fandt hurtig (30 min) stimulering af proMMP-2-sekretion med MSC’er i respons på chemerin og en rolle for MMP-2 i lette chemerin-stimuleret transendothelial migration, formentlig efter aktivering af andre ekstracellulære proteaser, såsom MMP-14 [45].

Det er kendt, at MIF inhiberer MSC migration [48], [49]. De nuværende data tyder på, at koncentrationsafhængig induktion af MIF i MSC ved chemerin handlinger at begrænse migration. Imidlertid er den inhibitoriske virkning dæmpes ved høje koncentrationer af chemerin. En implikation er, at kontrol myofibroblaster, hvor chemerin udtryk er beskeden, ikke effektivt at fremme MSC rekruttering på grund af den autoinhibitory virkning af MIF; men i CAM’er, hvor der er øget chemerin er kapaciteten for MSC rekruttering forbedret siden autoinhibitory virkning af MIF er overvundet.

ChemR23 antagonist CCX832 har tidligere været anvendt til at definere hidtil ukendte interaktioner mellem perivaskulære adipocyter og vasokonstriktor responser [ ,,,0],26]. Vi viser nu både

in vitro

in vivo

i en xenograft model, CCX832 hæmmer MSC migration som reaktion på CAM. Hvorvidt chemerin påvirker MSC differentiering efter ansættelsen kræftformer er endnu ikke fastslået. Det ville ikke være overraskende, hvis det gjorde, da det er kendt for at stimulere mesenchymale stamcelle adipogenese [17], [50]. Taget som helhed de nuværende data indikerer chemerin er en roman potentiel regulator af kræft progression ved at målrette MSC rekruttering og foreslå muligheden for at benytte ChemR23-receptor-antagonister til at regulere denne proces.

Støtte oplysninger

Metoder S1.

supplerende metoder

doi:. 10,1371 /journal.pone.0104877.s001

(PDF)

File S1.

Supplerende tabeller. Tabel S1 til tabel S5

doi:. 10,1371 /journal.pone.0104877.s002

(PDF)

File S2.

Supplerende figurer. Figur S1 til figur S10

doi:. 10,1371 /journal.pone.0104877.s003

(PDF)

Tak

Vi er taknemmelige for professor Rod Dimaline for nyttige diskussioner, Biomedical service Unit, University of Liverpool for hjælp med xenografter, og kirurger fra Institut for Kirurgi, University of Szeged for at give kirurgiske prøver.