PLoS ONE: Fremme af Cancer Cell invasiv og metastase Emergence Forårsaget af olfaktoriske receptor Stimulation

Abstrakt

lugtereceptorer (periferi) er udtrykt i det olfaktoriske epitel, hvor de registrerer lugtstoffer, men også i andre væv med yderligere funktioner. Nogle RYP’erne er endda overudtrykt i tumorceller. I denne undersøgelse identificerede vi yderste periferi udtrykt i enterochromaffin tumorceller ved RT-PCR, som viser, at enkelte celler kan co-udtrykke flere yderste periferi. Nogle af receptorerne identificeret allerede rapporteret i andre tumorer, men de er sjældne (uden kendt ligand), som det er tilfældet for de fleste af de hundredvis af humane yderste periferi. Således blev gener, der koder for humane yderste periferi med kendte ligander transficeret i disse celler, der udtrykker funktionelle heterologe yderste periferi.

in vitro

stimulering af disse celler med de tilsvarende ELLER lugtstof agonister fremmet celle invasion af kollagen geler. Brug af LNCaP-prostatacancerceller, stimuleringen af ​​PSGR (Prostate Specific G-protein-koblede receptorer), en endogent overudtrykt OR, ved β-ionon, dens lugtstof agonist, resulterede i den samme fænotypiske forandringer. Vi viste også at inddrage en PI3 kinase γ afhængig signalvej i denne kampagne for tumorcelleinvasivitet udløst af OR stimulation. Endelig efter subkutan podning af LNCaP celler i NSG immunsvækkede mus,

in vivo

stimulering af disse celler ved PSGR agonist β-ionon væsentligt forbedret metastaser fremkomsten og sprede

Henvisning:. Sanz G , Leray I, Dewaele A, Sobilo J, Lerondel S, Bouet S, et al. (2014) Fremme af Cancer Cell invasiv og metastase Emergence Forårsaget af olfaktoriske receptor stimulation. PLoS ONE 9 (1): e85110. doi: 10,1371 /journal.pone.0085110

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: April 24, 2013; Accepteret: December 1, 2013; Udgivet: 8. januar 2014

Copyright: © 2014 Sanz et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af INRA og CNRS (det nationale Center for Videnskabelig forskning (Frankrig). Denne forskning blev gennemført i omfanget af LEA EBAM (Europa Associated Laboratory (LEA) med titlen “Pulserende Electric Fields Applications i biologi og medicin”). den finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser findes

Introduktion

lugtereceptorer (periferi) er G-protein-koblede receptorer hovedsageligt udtrykt i olfaktoriske sensoriske neuroner (OSN) af det olfaktoriske epitel, hvor de registrerer og diskriminerer myriader af lugtstoffer ifølge et kombinatorisk kode, hvori en OR kan aktiveres af forskellige duftstoffer og et lugtstof kan stimulere forskellige yderste periferi [1], [2]. Desuden er disse regioner udtrykkes i ikke-olfaktoriske væv [3] – [5], hvor de kan spille yderligere roller. De især regulerer sædceller chemotaxis, regulere migrering og adhæsion af muskelceller, og kontrollere serotonin sekretion med enterochromaffin (EF) celler [6] – [10]. Flere undersøgelser rapporterede også, at nogle yderste periferi kan være tumor markør, en af ​​dem ændre

in vitro

spredning af LNCaP prostatacancerceller [11], [12], [13], [14].

især kan EC-celler erhverve en tumoral fænotype og differentielt udtrykkelige yderste periferi afhængigt af neuroendokrine karcinom evolution [15]. De BON celler, en human EF cellelinie afledt fra en metastase af en pancreas carcinom [16], [17], blev beskrevet for endogent udtrykkelige yderste periferi [8], som kunne være tumormarkører når overudtrykt [15]. Fordi BON-celler blev afledt fra en metastase, vi undersøgt, om aktivering af yderste periferi af agonist lugtstoffer kunne have en rolle i tumorudvikling. Til dette formål, besluttede vi at identificere disse regioner udtrykt i BON celler. Men agonist eller antagonist lugtstoffer specifikke for BON celler regioners er ukendte, ligesom for de fleste af de hundredvis af identificerede menneskelige yderste periferi. Vi forsøgte derfor at udvikle en model ved transfektion af disse celler med deorphanized yderste periferi. Den heterologe ekspression opnået tilladt os at vurdere

in vitro

invasivitet af disse celler ved stimulering med lugtstoffet ligand af transficerede receptor. Desuden identificerede vi PI3 kinase γPI3Kγ som en komponent i signalvejen induceret af OR stimulering og fremme celle invasiv. En mere fysiologisk model blev også anvendt

in vitro

, LNCaP-prostatacancerceller som overudtrykker PSGR (Prostate Specific G-protein-koblede receptorer), en endogen og deorphanized ELLER betragtes som en tumormarkør, og OLE wich blev beskrevet til at inhibere proliferation af disse celler

in vitro

[12]. Denne model blev derefter brugt

in vivo

at analysere den rolle, regioners stimulation i tumor progression, der er i metastaser fremkomst og spredning.

Materialer og metoder

Etik Statement

dyrene blev håndteret i overensstemmelse med retningslinjerne fra den franske regering vedrørende operative procedurer og pasning af dyr. Protokollen blev godkendt af den etiske comity til forsøg med dyr, med navnet “Comité d’Ethique en eksperimenteren Animale de l’IRCIV” CEEA-26 (protokol nummer 2012-043).

revers transkription (RT) -PCR, kloning og sekventering

Totale RNA’er blev ekstraheret ved anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen) og behandlet med DNase I. RT blev udført med «SuperScript First-Strand®, Synthesis System for RT-PCR» kit (Invitrogen).

i enkelt celle RT-PCR, enkelte celler blev opsamlet ved opsugning i en glaspipette og RT blev udført under anvendelse af de «enkelt celle Superscript ™ III Cells Direct cDNA Synthesis System» kit (Invitrogen) efter cellesprængning, proteindenaturering og DNAse behandling.

nested PCR blev udført startende fra 1 pi RT produkter og anvendelse af degenererede primere målretning eller konserverede regioner eller primere specifikt er rettet mod eller identificeret med degenererede primere. Degenererede primere sekvenser blev venligst stillet til rådighed af Stephan Bieri (Givaudan, Schweiz). Fravær af genomisk DNA blev kontrolleret under anvendelse af human GAPDH eller P-actin-primere på DNase I-behandlet RNA’er uden revers transkriptase.

PCR-produkter amplificeret med degenererede primere blev klonet ind i pGEM-T-vektoren (Promega) og sekventeret ved Beckman Coulter Genomics. PCR-produkter amplificeret med specifikke primere var direkte sekventeret (Beckman Coulter Genomics).

Kemikalier

Lugtstoffer, DMSO og mineralolie (M3516) blev købt fra Sigma-Aldrich, Fluka eller Acros Organics på højeste tilgængelige renhed. AS605240 blev købt fra Euromedex (Selleck, S1410) og gallein fra Tocris biovidenskab. Paraffin (CellWax) blev opnået fra CML, og hemalun, eosin og safran fra RAL.

Pattedyrekspressionsvektorer

OR1G1 eller OR17-40 kodende sekvenser blev indført i pCMV-Tag3B pattedyrsekspression vektor (Stratagene) på en måde der resulterer i fusionen af ​​et cmyc epitop på receptoren N-terminus. De resulterende vektorer blev navngivet pCMV-TagOR1G1 og pCMV-TagOR17-40.

Cell kultur og transfektion

BON celler (subklon # 7) blev venligst stillet til rådighed af Dr. Courtney M. Townsend (Department of Kirurgi UTMB, Galveston, TX 77551, USA) [16], [17]. De blev dyrket i DMEM /F-12 (Ham) uden phenolrødt (GIBCO, Invitrogen Corporation) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Perbio) og antibiotika (100 U penicillin /ml og 100 ug streptomycin /ml, Invitrogen) ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO

2. Celler blev transient transficeret med pCMV-TagOR1G1 eller pCMV-TagOR17-40 hjælp jetPEI ™ (POLYPLUS-transfektion) ifølge producentens instruktioner. Eller ekspression ved celleoverfladen blev kontrolleret ved immunfluorescensmikroskopi anvendelse af det monoklonale anti-cmyc-Cy3 antistof (C6594, Sigma-Aldrich) på ikke-permeabiliseres celler.

LNCaP-celler blev erhvervet fra ATCC (Klon FGC, nr . CRL-1740 ™) ved passage 19, og dyrket i RPMI 1640 medium (ATCC, nr 30-2001) tilsat 10% føtalt bovint serum (ATCC, nr 30-2021), ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO

2.

Calcium imaging

BON og LNCaP-celler podedes på en 96-brønds kulturplade (sort mikrotiterplade, Greiner Bio-on), henholdsvis ved en densitet på 10

5 og 0,5 × 10

5 celler pr. 24 timer senere blev cellerne belastet med 2,5 uM af fluo-4 acetoxymethylester (Molecular Probes), som tidligere beskrevet [18]. Calcium imaging blev udført under anvendelse af et omvendt epifluorescensmikroskop (CK40 Olympus) udstyret med et digitalt kamera (ORCA-ER, Hamamatsu Photonics). Ca

2+ reponses blev observeret ved 460-490 nm excitation og ≥ 515 nm emissionsbølgelængder. Dataindsamling og -analyse blev udført under anvendelse af SimplePCI software (Hamamatsu, Compix). Duftstoffer og mineralolie blev fremstillet umiddelbart ved en første fortynding i DMSO og derefter seriefortyndinger i Hanks saltopløsning (Eurobio) suppleret med 20 mM Hepes, pH 7,2. Stimuli blev testet ved koncentrationer, der ikke fremkalder calcium responser i mock-transficerede celler. 1 pM isoproterenol (Sigma-Aldrich) blev påført som en positiv kontrol. Ca

2+ signalet blev målt som den relative ændring i fluorescensintensitet bf /F = (F-F

0) /F

0, hvor F

0 er fluorescens niveau, før stimulation. Resultaterne blev udtrykt som middelværdien af ​​bf /F på mindst tyve celler.

In vitro

vurdering af celleinvasion

collagen type I geler blev fremstillet som beskrevet af de Wever [19]. Celler blev dyrket i 48 timer før såning dem som en suspension af enkeltceller aflejret oven på collagen type I geler. At stimulere yderste periferi, blev lugtstoffer og mineralolie først fortyndet i DMSO og derefter ind i collagen I-opløsningen eller dyrkningsmediet. Virkningerne af specifikke inhibitorer af PI3Kγ (AS605240) og βγ subunits af G-proteiner (gallein) blev også vurderet ved at tilføje dem til kollagen gel og dyrkningsmediet. For kontroller blev DMSO tilsat ved den samme slutkoncentration anvendes til at fortynde disse kemikalier. Mængden af ​​tilsat DMSO oversteg ikke 0,2% og ikke ændre antallet af invasive celler sammenlignet med prøver uden DMSO (data ikke vist). 24 timer efter deres podning blev invasive celler der præsenterer invasive udvidelser i kollagengelen og ikke-invaderende celler talt i 10-15 mikroskopfelter tilfældigt udvalgte. Resultaterne blev udtrykt som procentdelen af ​​invasive celler (invasion indeks). Morerover, F-actin cytoskeleton blev observeret ved anvendelse af rhodamin-konjugeret phalloidin (Invitrogen). Til dette formål blev celler fikseret i 20 minutter med 3% paraformaldehyd i PBS ved stuetemperatur, derefter permeabiliseret i 15 minutter med 0,5% Triton X-100 i PBS og blokeret i 30 minutter med 2% BSA, 1% glycin i PBS. Celler blev inkuberet med rhodamin-phalloidin (1:300) i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur og vasket grundigt med PBS før observation med et inverteret epifluorescensmikroskop.

Mus

Nod Scid Gamma ( NSG) hanmus blev avlet i dyr boliger faciliteterne i Institut Gustave Roussy, med fri adgang til mad og vand. Plastic bure blev forbundet til kontrollerede ventilerede stativer. De bure med dyr udsat for lugtstof β-ionon blev forbundet til et adskilt ventilationsanlæg.

In vivo

vurdering af celle invasion og metastaser

LNCaP celler ved passage 25 blev inokuleret i 8 ugers gamle kastrerede NSG mus (kastration blev udført to uger før celleinokulering). 10

6 celler blev suspenderet i 75 pi RPMI 1640 plus 75 pi Matrigel (BD Biosciences) og injiceret med en nål (26G) i det subkutane rum, på 2 lokaliteter i hver flanke af musene. Lugtstoffet β-ionon blev først fortyndet i DMSO ved en koncentration på 100 mM og derefter ind i RPMI + Matrigel blandingen ved en slutkoncentration på 100 uM. DMSO blev også tilsat ved den samme dosis for RPMI + Matrigel blandingen uden lugtstof. En første gruppe af 5 mus blev podet med LNCaP-celler (i tilstedeværelsen af ​​DMSO) og modtog ingen yderligere behandling. Fem andre mus blev inokuleret med LNCaP-celler (i tilstedeværelsen af ​​DMSO) og børstet med mineralolie tre gange om dagen i løbet af 6 uger og derefter tre gange om ugen indtil aflivning. En tredje gruppe af 5 mus blev podet med LNCaP-celler i nærvær af β-ionon i DMSO. Disse mus blev penslet med 1 mM β-ionon direkte fortyndet i mineralolie tre gange om dagen i løbet af 6 uger og derefter tre gange om ugen indtil aflivning. Før offer, blev nogle dyr først undersøgt ved tomoscintigraphy (SPECT, NanoSPECT /CT Bioscan) ved hjælp af

99mTc-MDP, en klassisk knogle scintigrafi agent for funktionel billeddannelse af knoglen. Denne analyse blev ikke udført på alle dyr, fordi det viste sig mindre informative end røntgenstråler i vores undersøgelse. Således alle mus blev udforsket

in vivo

ved MikroCT tomografi (μCT) (CT120, General Electric Healthcare) at opdage knoglemetastaser. 360 X ray fremskrivninger blev indsamlet i 1 ° intervaller (100 KVP, 50 mA, 20 ms eksponering) for omkring 5 min total scan tid. Billeder blev rekonstrueret i 3D volumener (50 um opløsning) på en rekonstruktion klynge ved hjælp af en modificeret telt-FDK conebeam algoritme (GE genopbygning software). 3D-data blev behandlet ved hjælp MicroView (GE Healthcare). Dataanalyse blev udført først på individuelle skiver (aksial, coronal, sagittale) derefter på rekonstruerede mængder og MIP-billeder (Maximum Intensity Projection). Dyr blev aflivet, når tumorstørrelsen oversteg 1.500 mm

3. Ved autopsi, tumorer og væv er kendt at huse metastaser fra prostata tumorer såsom lymfeknuder, lunger og pigge, blev udtaget. Lever, rogn og Tyson kirtler blev også udtaget, nogle lever optræder unormal og nogle Tyson kirtler overraskende stort. Væv blev fikseret i 24 timer i formaldehyd derefter lagret i 70% ethanol ved 4 ° C. For pigge, blev afkalkning realiseret ved en yderligere inkubation i 10% EDTA, pH 7,4, ved 4 ° C i løbet af en uge. Alle prøver blev dehydreret i ethanol og inkluderet i paraffin. Serielle sektioner af 5 um tykkelse blev fremstillet og afvokset i toluen og rehydreret i ethanol og derefter vand. Nogle sektioner blev farvet med hemalun (RAL), eosin og safran (HES farvning). Immunhistokemi blev udført på andre sektioner under anvendelse af anti-PSGR (LS-A6332, Cliniscience), anti-PSA (ab9537, ABCAM) eller kaninserum som en negativ kontrol, den Vectastain Elite ABC-Peroxidase Kits kanin IgG (Cliniscience), og en DAB åbenbaring (SK-4100, Vector).

Resultater

yderste periferi endogent udtrykt af BON celler

Siden BON celler vise en heterogen morfologi, vi isolerede homogene subkloner. Eller ekspression blev undersøgt ved nested PCR på cDNA’er fra ni kloner ved anvendelse af degenererede primere målretning eller konserverede områder, og PCR-produkter sekventering. Vi har registreret periferi transkripter i seks af klonerne (tabel S1). Blandt dem, fem viste ekspression af mere end én eller gen eller pseudogen, og panelet af yderste periferi identificerede varierede fra klon til klon. For at bekræfte disse resultater, vi udførte nested PCR med primere specifikt rettet mod de tidligere identificerede yderste periferi. Faktisk alle ni kloner udtrykte periferi transkripter (tabel 1) og nogle af dem (OR7D2, OR1F1) blev fundet i de fleste af klonerne. Det skal fremhæves, at OR7A17, OR7D2 og OR2A1 udskrifter også findes i flere tumorer (EST’er anført i HORDE database).

For yderligere at vurdere at i modsætning til OSN, BON celler co-udtrykker flere yderste periferi, vi analyserede ELLER udtryk på enkelt-celle niveau. Det lykkedes at amplificere cDNA’er svarende til GAPDH eller β-actin for de fleste testede celler, men OR cDNA’er kunne amplificeres kun for nogle få celler, sandsynligvis på grund af det meget lave niveau af OR mRNA’er på enkeltcelle-niveau. Vores data viser, at nogle enkelte BON celler gør co-udtrykker mere end én eller udskrift (Figur S1a).

Heterolog funktionel udtryk for yderste periferi i BON celler

Siden BON celler endogent udtrykkelige yderste periferi, vi infered at de også kunne heterologt udtrykke funktionelle yderste periferi efter transfektion af OR1G1 og OR17-40 gener. BON celler syntes at udtrykke disse heterologe receptorer og at udsætte dem på plasmamembranen (Figur S1b). Vi har også fundet i BON celler afskriften af ​​REEP1, et protein, der letter eller udtryk i OSN [20] (Figur S1c). Vi derefter viste, at de heterologt udtrykte receptorer er funktionelle, inducerer en calcium respons, når de stimuleres med deres respektive ligand (1-nonanol for OR1G1 og helional for OR17-40 [18], [21]) (figur 1). Calciumreaktionen induceret ved stimulering af OR17-40 receptor er mindre udtalt end induceret ved stimulering af OR1G1 receptoren, men det forbliver signifikant. Forskelle mellem ELLER responsniveauer kan skyldes forskellige ekspressionsniveauer af receptorerne, til en anden koblingseffektivitet med det endogene G-proteiner på heterologe celler, eller til en anden effektivitet af liganderne anvendte. Mock-transficerede celler ikke reagerer på nonanol heller helional, der viser, at de testede lugtstoffer ikke agonister af disse regioner endogent udtrykt i BON celler.

BON celler blev forbigående transficeret til at udtrykke OR1G1 eller OR17-40 receptorer. 72h senere blev celler fyldt med fluo-4 og stimuleret med de respektive lugtstof ligander af de transficerede yderste periferi (1-nonanol og helional). Calcium responser på grund af interaktionen mellem OR og dens specifikke lugtstof agonist er udtrykt som den gennemsnitlige fluorescens variation bf /F (%). (åbne cirkler) OR1G1 celler, 1-nonanol; (Fyldte diamanter) OR17-40 celler, helional; streger indikerer standardafvigelse (n = 3). Mock-transficerede celler ikke reagerer på en-nonanol heller helional.

OR-induceret forøgelse af celle invasiv

Brug BON celler heterologt udtrykker OR1G1 eller OR17-40 receptorer, vi vurderede invasiviteten af ​​kollagen type i geler [19] af disse celler, stimuleret eller ej med lugtstof agonister af disse yderste periferi. I mangel af lugtstof stimulering blev invasionsevne af BON celler ikke ændret ved heterolog ekspression af yderste periferi (invasionen indekset forbliver omkring 3%, figur 2a). Nonanol stimulering steget betydeligt invasionen indeks OR1G1-udtrykkende celler (OR1G1 celler) med en faktor på 2,7, hvorimod helional stimulering øget invasionen indeks på OR17-40 celler med en faktor på 2,5 (figur 2a). Vi observerede, at 10

-6 og 10

-7 M af nonanol inducerede samme invasion niveau, mens 10

-6 M dukkede mere effektiv i aktivering OR1G1 på calcium imaging eksperimenter. Dette kan skyldes manglende evne BON celler til at nå et større invasion niveauer (ca. 10% invasive celler). Nonanol og helional havde ingen signifikant effekt på mocktransfekterede kontrol celler. Nonanol havde ingen signifikant effekt på OR17-40 udtrykkende celler, heller helional på OR1G1 udtrykker celler. Endvidere vanillin, en antagonist af OR1G1 receptor [22], var i stand til specifikt at modvirke invasionsevne induceret af nonanol i OR1G1 celler. Invasionen indeks for kontrol celler stimuleret af nonanol alene eller af en blanding af nonanol og vanillin var uændret (figur 2a). Invasive cellulære udvidelser i collagen type I geler, karakterisere de invasive celler, blev også observeret efter immunolabeling af F-actin cystoskeleton (figur 2b). Alle sammen, disse resultater viser, at,

in vitro,

yderste periferi stimulering af lugtstoffer kan specifikt fremme invasiv af OR-udtrykkende cancerceller.

(a) BON-celler blev forbigående transficeret til at udtrykke OR1G1 eller OR17-40 receptorer eller mock-transficeret. Celler blev podet på collagen type I geler og stimuleret af de respektive lugtstof ligander af OR1G1 og OR17-40 receptorer (nonanol: OR1G1 agonist, vanillin: OR1G1 antagonist, helional: OR17-40 agonist). Invasive celler blev talt 24 timer senere. Resultaterne præsenteres som invasionen indeks. (B) Modifikation af F-actin cytoskeleton for Bon celler i collagen type I matricer. F-actin blev afsløret ved rhodamin-konjugeret phalloidin. Invasive udvidelser i kollagengeler kendetegner invasive celler er angivet med pile. (C) LNCaP-celler podedes på kollagen type I geler og stimuleres af PSGR ligander (β-ionon: agonist, α-ionon: antagonist). Invasive celler blev talt 24 timer senere. Resultaterne præsenteres som invasionen indeks i forhold til kontrol celler uden lugtstof stimulation. Standardafvigelse af kontrollen var 13,42%. Statistik blev udført under anvendelse af en to-halet Student test og streger indikerer standardafvigelse (n = 3).

Vi bekræftede dette resultat ved hjælp af de LNCaP-prostatacancerceller som endogent udtrykker en OR, den PSGR. Denne receptor har kendt agonist og antagonist-lugtstoffer [12], henholdsvis β-ionon og α-ionon. Vi anvendte en 100 uM koncentration af β-ionon til stimulering LNCaP-celler, da denne dosis allerede blev rapporteret at stimulere PSGR [12] og det inducerede den højeste invasivitet af LNCaP-celler i vores hænder (data ikke vist). Som vist i figur 2c, stimulering af PSGR med 100 pM β-ionon øget invasionsevne af LNCaP-celler med en faktor på 2,75, og denne virkning blev helt ophævet ved antagonisten α-ionon. Alene, denne antagonist havde ingen effekt på LNCaP-celler invasion niveau. Mens der er ingen negative kontrol med LNCaP celler, der ikke ville udtrykke PSGR, den drastiske farmakologiske virkning af α-ionon taler for en specifik effekt af β-ionon gennem PSGR stimulation. Udelukkelse af en ikke-specifik kemisk virkning af β-ionon på LNCaP-celler inducerende invasionsevne understøttes også af den omstændighed, at α-ionon, som er meget lig til p-ionon og blev påført ved to gange den β-ionon dosis, ikke inducerede invasionsevne af LNCaP-celler. Desuden har vi testet effekten af ​​100 pM β-ionon på invasiv af PC3 celler, andre prostata cancer celler, som ikke udtrykker PSGR [12], og vi ikke observere en øget invasionsevne i disse celler. Eksperimentelle resultater beskrevet nedenfor også støtte tanken om, at LNCaP invasionsevne kan styrkes gennem PSGR stimulation.

Inddragelse af PI3Kγ i celle invasionsevne fremkaldt af yderste periferi

PI3Kγ aktivering via GPCR’ere kan inddrages i at omdanne funktioner sådanne som invasion [23], og en krydstale mellem lugtstof signalering og PI3Kγ blev beskrevet i olfaktoriske sensoriske neuroner [24], [25]. Vi udforskes således, om PI3Kγ kunne være en del af signalvejen, som er udløst af lugtstof aktivering af yderste periferi og fremmer celle invasiv. Først viste vi ekspressionen af ​​PI3Kγ i BON og LNCaP-celler ved rå lysater immunoblotting med et antistof rettet mod PI3Kγ (data ikke vist). Vi vurderede derefter invasiviteten af ​​BON celler hetorologously udtrykker OR1G1 eller af LNCaP celler efter stimulation med agonister af OR1G1 eller PSGR, i overværelse af en specifik hæmmer af PI3Kγ (AS605240). 10

-6 af AS605240 er blevet rapporteret til helt hæmme PI3Kγ [26]. Vedrørende BON celler under anvendelse af 10

-6 og 10

-7 af AS605240, fandt vi et tilsvarende stort (ca. 80%), men ikke samlet reduktion af cellen invasionsevne fremmes af OR1G1 upon nonanol stimulation (figur 3), hvilket indikerer, at den maksimale virkning er observeret ved 10

-7 af AS605240. Således PI3Kγ synes at spille en væsentlig rolle ved mediering BON celle invasionsevne fremmes af eller stimulering af dets specifikke lugtstof, selv om andre signalveje også kan være involveret. Inddragelse af PI3Kγ blev bekræftet for LNCaP-celler (figur 3). Men i modsætning til BON celler, PI3Kγ inhibitor AS605240 inducerede en reduktion af LNCaP invasiv selv i fravær af PSGR stimulation. PI3Kγ synes derfor at være også involveret i den basale invasiv af LNCaP celler. Eftersom PI3Kγ kan aktiveres af G

βγ underenhed af G-proteiner gennem GPCR aktivering [27], brugte vi gallein, en G

βγ underenheder inhibitor, der forstyrrer interaktionen af ​​G

βγ underenheder med PI3Kγ [28], og viste, at det modvirket forøgelsen af ​​LNCaP-invasionsevne induceret af PSGR stimulation (figur 3). Dette resultat understøtter også at inddrage PI3Kγ i invasiv af tumorceller induceret af OR-stimulering.

BON celler heterologt udtrykker den OR1G1 receptoren blev podet på collagen type I geler og blev stimuleret af nonanol (OR1G1 agonist) i tilstedeværelsen af ​​en specifik PI3Kγ inhibitor (AS605240). LNCaP-celler blev podet på collagen type I geler og blev stimuleret af β-ionon (PSGR agonist) i nærværelse af en specifik PI3Kγ inhibitor (AS605240) eller en inhibitor af βγ subunits af G-proteiner (gallein). Invasive celler blev talt 24 timer senere. Resultaterne præsenteres som invasionen indekset i forhold til den for kontrolceller (uden lugtstoffet eller AS605240 eller gallein). Standardafvigelse af kontrollen var 4,74% for kontrol BON celler og 13,86% for kontrol LNCaP celler. Statistik blev udført ved hjælp af en to-halet Student test og barer indikerer standardafvigelse (n = 3).

eller aktivering-induceret forøgelse af kræft celle invasionsevne

in vivo

Da

in vitro

forstærkning af celle invasiv ved yderste periferi aktivering antyder en mulig rolle (i det mindste nogle) yderste periferi i metastaser fremkomsten

in vivo

, vi podet LNCaP prostata tumorceller subkutant i immundeficient NSG (NOD SCID gamma) mus. Dyrene var enten venstre ubehandlet, eller daglig børstes på huden med PSGR agonist β-ionon fortyndet i mineralolie (en olieagtig hjælpestof nødvendig for at anvende de lipofile lugtstoffer over mus huden), eller med mineralsk olie alene som en kontrol. Tumorstørrelse blev målt og metastaser blev detekteret ved

in vivo

billeddannelse og ved immunohistokemi post mortem anvendelse af antistoffer rettet mod PSGR eller PSA (prostataspecifikt antigen) (eksempler på rygsøjlen og lungemetastaser vises i figur 4). PSGR ekspression blev detekteret i primære tumorer og i alle metastaser (se andre eksempler i fig S2), hvilket bekræfter, at denne receptor var til stede og eventuelt aktiveret under vores eksperimenter. Uden behandling metastaser bl.a. opstået i de inguinale lymfeknuder og occasionnally i rygsøjlen og lever (figur 4a). Metastaser placeret i lyske noder var godt udviklet, mens dem, der ligger i rygsøjlen og lever var mikrometastaser. Antallet af metastaser forøget ved behandling med mineralolie og deres lokalisering var mere forskelligartet i nærvær af β-ionon. Faktisk metastaser optrådte i lunger og Tyson kirtler kun for mus behandlet med β-ionon (3 ud af 5 dyr til Tyson kirtler og 2 ud af 5 dyr for lungerne). Desuden metastaser beliggende i Tyson kirtler blev højt udviklet, med størrelser nærmer 1.000 mm

3. I lungerne, kun blev påvist mikrometastaser, ligesom i rygsøjlen og leveren. Da mus ikke blev aflivet på samme tid, men afhængigt af tumorstørrelse, viser vi i figur 5b og 5c udviklingen med tiden af ​​antallet af metastaser efter antallet af ofret mus og det gennemsnitlige antal af metastaser per mus på tidspunktet af ofre for hver forsøgsgruppe. Vi observerede, at mus behandlet med mineralolie eller β-ionon måtte ofres tidligere, som følge af en hurtigere tumorvækst, og at de viste en signifikant stigning i metastaser antal sammenlignet med ubehandlede mus. Sideløbende har vi også observeret, at tumorer udvikles på 85% af de inokulerede steder i ubehandlede mus, mens de var mindre talrige (50%) i mineralsk olie eller β-ionon behandlede mus.

Metastaser er angivet med pile. I rygsøjlen, blev metastaser observeret under anvendelse MikroCT tomografi (maksimal intensitet Projection) og bekræftet efter slagtning af HES-farvning og immunhistologi anvendelse af anti-PSA (prostataspecifikt antigen) og anti-PSGR antistoffer (kun én metastase præsenteres). I lungerne, blev metastaser præget af HES farvning og immunhistologi bruger anti-PSA og anti-PSGR antistoffer

(a) Antallet af metastaser observeret i forskellige væv efter mus ofre (hvid:. Ubehandlet kontrol mus, grå: mus behandlet med mineralolie, sort: mus behandlet med 1 mM β-ionon i mineralolie). (B) Kumulativ antal metastaser, uanset deres placering, som en funktion af tidsrummet mellem LNCaP-celler inokulering og mus ofre (hvid: ubehandlede kontrolmus, grå: mus behandlet med mineralolie, sort: mus behandlet med 1 mM β ionon i mineralolie). Mus blev aflivet, når tumorstørrelsen oversteg 1.500 mm

3. Antallet af aflivet mus er angivet i parentes for hvert tidspunkt og hver mus gruppe. (C) Kurver rapportering af forholdene mellem antallet af metastaser over antallet af ofret mus som en funktion af tiden (sort stiplede: ubehandlede kontrolmus, grå: mus behandlet med mineralolie, sort: mus behandlet med 1 mM β-ionon i mineralolie).

resultaterne med mineralsk olie var spændende. Da yderste periferi kan aktiveres ved forskellige molekyler [2], [12], [18], undersøgte vi, om mineralsk olie kan stimulere PSGR i

in vitro

celleinvasion assays og calcium imaging eksperimenter. Mineralsk olie steg både invasionsevne og calciumphosphat respons af LNCaP-celler, og PSGR antagonist-α-ionon ophævede disse virkninger (figur 6 a, b). Disse resultater viser, at en mineralolie komponent stimulerede LNCaP-celler via PSGR, fremme deres invasionsevne. Desuden blev LNCaP celler invasionsevne induceret af mineralolie hæmmes af PI3Kγ eller G

βγ underenheder hæmmere (henholdsvis AS605240 og gallein), viser, at PI3Kγ er involveret i denne proces, da det er involveret i celle invasionsevne fremkaldt af β-ionon. Men selv om mineralolie forbedret metastase fremkomsten, metastase forekomst var endnu mere udtalt i nærvær af β-ionon, hvilket resulterer i cellerne breder sig til lungerne og Tyson kirtler, der forekom kun i nærvær af β-ionon. Alle disse data konvergere at påvise, at stimulering af en OR, den PSGR, kan bidrage til formidling af prostata tumorceller og metastaser generation.

(a) LNCaP celler blev podet på collagen type I geler og blev stimuleret af mineralolie eller mineralsk olie blandet med 10

-4 β-ionon, 2,10

-4 α-ionon, 10

-7 AS605240 eller 10

-5 gallein. Mineralolie blev først fortyndet 1/4 i DMSO (mineralolie blev ikke fuldstændig solubiliseret ved denne dosis, men dette tilladt os at forvente en meget stor solubilisering af mineralet oliekomponenter), og opløsningen blev derefter fortyndet 1/1000 i dyrkningsmediet eller kollagen I gel. Invasive celler blev talt 24 timer senere. Resultaterne præsenteres som invasionen indekset i forhold til den for kontrolceller (med kun DMSO). Barer angiver standardafvigelsen. Standardafvigelse af kontrollen var 3,67%.