Abstrakte
Kombination af immunterapi og kemoterapi har vist lovende for kræft. Interleukin-7 (IL-7) kan potentielt øge immunreaktioner mod tumor, mens oxaliplatin (OXP), et platinbaseret lægemiddel, kan fremme en gunstig immun mikromiljø og stimulere anticancer immunrespons. Vi evaluerede anti-tumor aktivitet af IL-7 kombinerer OXP mod et murint coloncarcinom in vitro og in vivo og studerede tumoren immune mikromiljø at undersøge, om den kombinerede behandling påvirker de lokale immuncellepopulationer. Ved hjælp lunge og mave metastase-modeller ved inokulering af CT26-mus colon cancerceller, vurderet, antitumoreffektiviteten kombinere IL-7 og OXP i musemodeller. Tumor immune mikromiljø blev vurderet ved flowcytometrisk analyse og immunhistokemisk farvning. Vores undersøgelse viste, at in vivo-administration af IL-7 i kombination med OXP markant inhiberede væksten af tumorer i lunge og mave metastase coloncancer-modeller. IL-7 alene havde ingen virkning på tumorvækst hos mus og IL-7 ændrede ikke celle følsomhed over for OXP i kultur. Antitumorvirkningen af at kombinere IL-7 og OXP korreleret med en markant stigning i antallet af tumorinfiltrerende aktiverede CD8 + T-celler og et markant fald i antallet af regulatoriske T (Treg) celler i milten. Vore data antyder, at OXP plus IL-7 behandling inhiberer tumorcellevækst ved immunregulering snarere end direkte cytotoksicitet. Vores resultater berettiger yderligere evaluering for at kombinere IL-7 og kemoterapi som en ny eksperimentel kræftbehandling
Henvisning:. Gou HF, Huang J, Shi HS, Chen Xc, Wang YS (2014) Chemo-immunterapi med oxaliplatin og Interleukin-7 Hæmmer Colon Cancer Metastase i mus. PLoS ONE 9 (1): e85789. doi: 10,1371 /journal.pone.0085789
Redaktør: Fabrizio Mattei, Istituto Superiore di Sanità, Italien
Modtaget: September 16, 2013; Accepteret: December 5, 2013; Udgivet: 21 Jan 2014
Copyright: © 2014 Gou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Oxaliplatin (OXP), der er almindeligt anvendt i. kolorektal cancer, er for nylig blevet fundet at forøge immunogeniciteten af kræftceller og inducere immunogene celledød [1]. Det har endvidere vist sig, at OXP kan forøge immunresponset over for tumorer ved at nedsætte regulatoriske /suppressorceller: regulatoriske T (Treg) celler og myeloide afledte suppressorceller (MDSCs) og forøgelse af forholdet af cytotoksiske CD8 + T-lymfocytter (effektorceller ) versus immunosuppressive cellepopulationer i tumoren microenviroment [2], [3], [4].
Interleukin-7 (IL-7) er en af de interleukin-2 (IL-2) -relaterede cytokiner denne andel og signal gennem γ-kæden til at påvirke T-celle proliferation, udvikling og homeostase [5], [6], [7], [8]. IL-7 fremstilles ved en række forskellige stromale celler i thymus og knoglemarv, og også af vaskulære endotelceller, tarmepitelet, keratinocytter og follikulære dendritceller [9], [10]. IL-7 udgør en potentiel behandling for at forbedre T-celle rekonstitution og vaccineeffektivitet som det har særskilte aktioner på forskellige undergrupper af T-celler [11]. IL-7 også fremmer antigen-specifik T-celle-cytolytisk aktivitet [12], [13], [14]. IL-7 var konsekvent lige så effektivt som IL-2 i at opretholde T-celler [13], [14]. For eksempel er det blevet påvist, at tumorcellelinjer transficeret med IL-7-genet reducerede T-celle-afhængig tumorigenicitet i murine modeller [15], [16]. Tilsvarende er lokal eller systemisk indgivelse af IL-7 har antitumorvirkninger ved at styrke immunrespons mod tumorer [17], [18], [19], [20], [21], især ved kombination med andre immun behandling. Evnen til at forøge immunrespons mod maligniteter af IL-7 har store konsekvenser for immunterapi i behandling af tumorer.
Kombinationen af kemoterapi med immunreaktionsmodificerende midler, såsom interleukin 2 (IL-2) eller interferon-α (IFN-α), benævnt kemo-immunterapi, har vist lovende antitumoraktivitet til melanom [22], [23]. Cytotoksiske kemoterapeutiske midler var traditionelt blevet anset for at have immunosuppressive bivirkninger og skade antitumorimmunitet grund af deres ikke-specifikke cytostatiske og cytotoksiske virkninger. Men der er akkumulerende beviser for, at under visse betingelser nogle af disse stoffer kan påvirke tumor immunologiske microenviroment og stimulere anticancer immunrespons [3], [4], [24], [25], [26]. Det er en rationel udvikling at kombinere disse immunstimulerende cytotoksiske kemoterapeutiske midler med immunreaktionsmodificerende midler.
På baggrund af ovenstående, vi hypotese, at kombinationen af IL-7 og OXP kan øge deres anti-tumor aktivitet ved at inducere ekspansion af T-celler og blokerer T-celle inhibitoriske pathways i tumoren immuno-mikromiljø. I vores undersøgelse vurderede vi antitumoraktiviteten af IL-7 i kombination med OXP mod et murint coloncarcinom in vitro og in vivo og undersøgte tumor immune mikromiljø at undersøge, om denne kombinerede behandling påvirker de lokale immuncellepopulationer. Vore data viser OXP plus IL-7 er signifikant mere effektiv end IL-7 eller OXP alene til inhibering af tumorvækst in vivo. Vore data antyder, at OXP plus IL-7 behandling inhiberer tumorcellevækst ved immunregulering stedet for direkte cytotoksicitet.
Materialer og metoder Salg
Cellelinie
coloncarcinomcellelinie CT26 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). Celler blev rutinemæssigt dyrket som monolag i 75-cm
2 firkantede vævskulturkolber i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO
2 i luft. Dyrkningsmediet indeholdt RPMI 1640 (Life Technologies, Bedford, MA) suppleret med 10% FBS, 100 U /ml penicillin. Cellen linje var mycoplasma gratis.
tumorigenese model
patogenfrie BALB /c (6-8 uger gamle) mus blev købt fra Vital River Laboratory Animal Technology Co Ltd, Beijing. Protokollen blev godkendt af Det Dyreetiske udvalg Sichuan University. Alle forsøg blev udført dyr under specifikke patogenfrie betingelser i overensstemmelse med institutionelle retningslinier.
Før in vivo injektion i mus blev kræftceller i den eksponentielle vækstfase høstet, vasket tre gange med PBS, talt og fortyndet i denne opløsning før in vivo-injektion. At etablere en pulmonær metastasemodel, alt 1 × 10
6 CT26 colon cancerceller blev injiceret i halevenen af syngene BALB /c-mus. At etablere en abdominal metastase model, alt 1 × 10
6 CT26 tyktarmscancerceller blev injiceret intraperitonealt. Tumor-bærende mus blev dernæst overvåget for tumorudvikling og progression
På dag 6 efter post-podning med tumoren hver model blev randomiseret i 4 grupper med 8 mus i hver gruppe for yderligere indgivelse som følger:. Gruppe af kontrol ( phosphatpufferopløsning, PBS), gruppe af IL-7, gruppe af OXP, og gruppen af IL-7 kombineret med OXP. I den abdominale metastasemodel OXP blev givet i.p. i en dosis på 5 mg /kg hver 3. dag i 12 dage. I lunge metastase, blev OXP givet i.v. i en dosis på 5 mg /kg hver 3. dag i 12 dage. IL-7 (5 ug /dag) blev indgivet i.p. dagligt i 12 dage.
Dyrene blev aflivet på dag 13 efter den første behandling. Metastatiske tumor knuder i subpleurale regioner af lungerne blev talt under et dissektionsmikroskop og vægtet. Seeding metastatisk tumor knuder i bughulen blev talt ved nøgne øjne og vægtet.
Reagenser
Rekombinant human IL-7 (IL-7) blev indkøbt fra Shanghai PrimeGene Bio-Tech Co., Ltd og fortyndet i sterilt destilleret vand. OXP blev indkøbt fra Sanofi-Aventis (Frankrig) og fortyndet i sterilt glucose. Fluorescerende-konjugeret flowcytometri anti-muse-antistoffer (Abs) CD4, CD8, CD69, CD11b, CD11c, Gr-1, og isotype-matchede antistoffer blev opnået fra BD Pharmingen. F4 /80 blev opnået fra BioLegend. Muse-regulerede T cellefarvning Kit blev opnået fra eBioscience. Immunhistokemi antistoffer par for murine CD8 blev købt fra ABGENT. Ki-67 blev indkøbt fra Novus Biologicals, og Apoptosis Detection Kit blev indkøbt fra (Promega Corp., Madison, WI).
3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5- diphenyltetrazoliumbromid assay (MTT)
3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, blev 5-diphenyltetrazoliumbromid 96-brønds plade-assay anvendes til at bestemme de relative mængder af celler i brønde efter eksponering for forskellige midler. CT26-celler blev udpladet ved 1,000cells /brønd i plader med 96 brønde, og derefter inkuberet i yderligere 24 timer. Fem replikatbrønde blev anvendt i disse assays. Dernæst forskellige koncentrationsgradienter af IL-7 (25 ng /ml, 50 ng /ml, 75 ng /ml, 100 ng /ml) og OXP (10 pmol /l, 30 pmol /l, 50 pmol /l) blev tilsat i brønde og inkuberet i 24 timer, 48 timer i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO
2 ved 37 ° C. Alle analyser omfattede passende kontroller. Ved slutningen af inkubationen blev levedygtige celler kvantificeret under anvendelse af 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT). Kort fortalt blev 20 pi af MTT-stamopløsning (5 mg /ml) tilsat til hver brønd i et assay. Efter 2 h inkubation blev mediet fjernet, og konverterede farvestof blev opløseliggjort med DMSO (150 UL /brønd). Absorbansen af den konverterede farvestof blev målt ved en bølgelængde på 540 nm. Omdannelsen til celleantal var baseret på en standardkurve. Procentdelen af celleoverlevelse (overlevelsesrate) blev beregnet ved at dividere absorbansen værdien af den behandlede prøve ved den for den ubehandlede kontrol inden for hver gruppe.
flowcytometrisk analyse
Ved de angivne tidspunkter , tumorer og milten blev høstet fra musene, hakket i små fragmenter og mekanisk spredt i 3-5 ml kold RPMI medium. Tumorcellerne blev spaltet i 1 mg /ml collagenase IV (Sigma), 0,1 mg /ml DNase (Sigma) i RPMI 1640 ved 37 ° C i 1 time. Miltcellerne blev udtømt for erythrocytter ved osmoticlysis og justeret til koncentration på 1 × 10
5 celle i 100 ul PBS. Herefter blev encellede suspensioner af tumorceller og splenocytter farvet i 30 minutter på is med 1 ug af følgende fluorokrom-mærkede antistoffer, CD4, CD8, CD69, CD11b, CD11c, F4 /80, eller matchede isotypy kontrol antistoffer og derefter vasket en gang med PBS. Intracellulær farvning for foxp3 blev udført under anvendelse af muse regulatoriske T-celle-farvning kit, ifølge producentens instruktioner. Cellerne blev erhvervet på et FACSCablibur flowcytometer (BD Biosciences), og 10,000_20,000 gated hændelser blev indsamlet. De indsamlede data blev analyseret af FlowJo software 7.6. I cytometrisk analyse, vi gate data ved hjælp af FSC og SSC bivariate plot, derefter tegne et område omkring klynge af lymfocytter og derefter gate fluorescens histogram på dem. Denne port, i FSC vs SSC view, først er etableret, bliver derefter anvendt til analysen af alle efterfølgende prøver. Tre mus fra hver gruppe blev aflivet at evaluere immunocyt CD markør ekspression.
immunhistokemisk farvning
Det udskårne tumorer fikseret i 10% formalin blev indlejret i paraffin og snittet ved 4 um tykkelse. Snittene blev anvendt til analyse af ekspression af CD8, og Ki-67 ved immunhistokemi farvning med relevante monoklonale antistof. Prøver blev immunfarvet ved standard mærket streptavidin-biotin protokol. Kort beskrevet blev snit af 4 um monteret på silaniserede objektglas og fik lov at tørre natten over ved 37 ° C. Efter afparaffinering og antigen-genvinding, blev vævssnit inkuberet med CD8-antistof (1:250 fortynding) og Ki-67 antinbody (1:200 fortynding) ved 37 ° C i 1 time og derefter ved 4 ° C natten over. Snittene blev derefter inkuberet med biotinyleret gede-antimuse-immunoglobulin G (Zymed Laboratories Inc., USA) og efterfølgende inkuberet med peberrod mærket streptavidin (Zymed Laboratories Inc., USA). 3, blev 3′-diaminobenzidin som chromogen og hematoxylin som modfarvet. Tre mus per gruppe blev analyseret.
Evaluering af immunhistokemiske farvning
blev observeret Graden af CD8 + infiltration i mere end 10 uafhængige high-power (× 200) mikroskopiske felter for hver vævsprøve. De fem mikroskopiske felter med den mest rigelige fordeling blev valgt inden cancercellen reden. Det gennemsnitlige antal CD8 + -T-celler blev talt i de fem mikroskopiske felter [27]. Bestemmelse af proliferativ aktivitet ved Ki-67 imunohistochemistry blev udført kvantitativt ved at tælle immunreaktive tumorceller i de mest intens farvning områder. I hver prøve blev et minimum på 1000 tumorceller scoret i de mikroskopiske områder, der viser den højeste grad af immunfarvning, og resultaterne blev udtrykt som procentdelen af positive celler [28].
Terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end mærkning (TUNEL) assay
sektionerne, de samme som dem, der anvendes til immunkemi analyse blev anvendt til in situ-analyse af apoptose ved TUNEL. TUNEL-farvning blev udført med et in situ apoptotisk celledetektionsreaktionen kit efter fabrikantens protokol. Objektglassene blev observeret under et Olympus fluorescensmikroskop fastgjort til en charge-coupled device-kamera. Billederne blev erhvervet under × 10 og × 40 mål ved hjælp af Image-Pro-softwaren. Apoptotisk indeks blev bestemt ved at beregne det gennemsnitlige antal kerner apoptotiske celler i 5 høj effekt mikroskopiske felter (× 400) udvalgt fra et centralt område i levedygtige tumorområder, undgå områder med nekrose [29].
Statistisk analyse
PRISM-version 5.0 (GraphPad Software) blev anvendt til at tegne grafer og statistiske analyser. Resultater er rapporteret som middelværdi ± standardafvigelse (SE). Dual sammenligninger blev foretaget ved hjælp af uparret Student
t
test.
P
0,05 blev anset for at være statistisk signifikant
Resultater
In vitro
effekt af OXP plus IL-7 på væksten af CT26. celler
for at bestemme om IL-7 direkte påvirker væksten af CT26 celler eller forøger deres følsomhed over for OXP in vitro, virkningen af IL-7 alene og af IL-7 plus OXP på CT26-celler blev bestemt i kultur . CT26-celler blev dyrket in vitro med IL-7 (25 ng /ml, 50 ng /ml, 75 ng /ml, 100 ng /ml) alene eller i kombination med OXP ved tre koncentrationer fra 10 pmol /ml til 50 pmol /ml . De relative antal af levedygtige celler blev derefter vurderet 24, 48 timer senere hhv. OXP inducerede den forventede koncentrationsafhængig cellevækstinhiberingen. Hastigheden af tumorcellevækst var ikke signifikant forskellige ved noget dosisniveau af IL-7 fra dem observeret i kontrolkulturer. Og tilsætningen af IL-7 ændrede ikke signifikant CT26 cellevækst eller deres følsomhed over for OXP (fig. 1).
CT26-celler blev dyrket in vitro med IL-7 (25 ng /ml, 50 ng /ml, 75 ng /ml, 100 ng /ml) alene eller i kombination med OXP ved tre koncentrationer fra 10 pmol /ml til 50 pmol /ml og de relative antal af levedygtige celler blev vurderet 24, 48 timer senere hhv. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± S.E. (N = 5). en. OXP inducerede den forventede koncentrationsafhængig cellevækstinhiberingen. b. IL-7 alene havde ingen virkning på CT26-cellevækst in vitro. Hastigheden af tumorcellevækst var ikke signifikant forskellige ved noget dosisniveau af IL-7 fra dem observeret i kontrolkulturer. c og d. Tilføjelsen af IL-7 ændrede ikke signifikant CT26 cellevækst eller deres følsomhed over for OXP.
Kombination med IL-7 øger anti-tumor effekt af OXP in vivo
Til undersøge, om IL-7 kan forøge anti-tumor effekt af OXP i tumorbærende mus blev to modeller etableret. Murin CT26 colon cancerceller blev injiceret i BALB /C-mus i.v. at etablere lunge metastase og i.p. at etablere den abdominale metastasemodel. Musene modtog følgende behandlinger: PBS; IL-7 (5 ug /injektion); OXP (5 mg /kg /injektion); og IL-7 (5 ug /injektion) kombineret med OXP (5 mg /kg /injektion), ifølge det ovennævnte skema. Musene blev aflivet på dag 13 efter den første behandling.
I lunge metastase, blev lungerne fjernet og vejet. De samlede antal lunge metastatiske knuder i sub-pleural regioner af lungerne blev talt under dissektion omfang. Resultaterne blev udtrykt som middelværdi ± S.E. Resultaterne viste klart, at kombinationen af IL-7 og OXP opnår den bedste terapeutiske virkning, målt ved antitumor-virkning. Som vist i fig. 2a (n = 3), IL-7, når de gives sammen med OXP, havde en større end 2,55 gange, 1,73 gange, 2,07 gange reduktion i antallet af metastatiske knuder på lungen sammenlignet med PBS, IL-7 og OXP grupper hhv. Lungerne blev vægtet. Forholdsmæssige fald i lungevægte blev også observeret. Som vist i fig. 2b, IL-7, når de gives sammen med OXP, havde en større end 1,88 gange, 1,52 gange, 1,82 gange reduktion i vægtene af lungerne sammenlignet med PBS, IL-7 og OXP grupper hhv. Behandling med IL-7 alene resulterede i en signifikant reduktion i lungevægte og en lille, ikke statistisk reduktion i antallet af metastatiske knuder på lungen sammenlignet med PBS. Administrationen af OXP sig ikke har givet nogen anti-tumor effekt i forhold til PBS i lunge metastase.
På dag 6 efter tumor podning hver model blev randomiseret i 4 grupper med 8 mus i hver gruppe for yderligere indgivelse som følger: PBS, IL-7, OXP, IL-7 i kombination med OXP. Metastatiske tumor knuder i sub-pleural regioner af lungerne blev talt under en dissektion mikroskop. De metastatiske tumorknuder i bughulen blev talt ved nøgne øjne og vægtet. Resultaterne blev udtrykt som middelværdi ± S.E.
P
værdier: *,
P
0,05, **,
P
0,01; en. Metastatisk tumorknuder nummer i lunge metastase. b. Vægt af lungerne i lunge metastase. c. Metastatisk tumorknuder nummer i maven metastase-model. d. Vægten af tumor knuder i underlivet metastase model. Alle a, b, c, viste d IL-7, når de gives sammen med OXP, øget anti-tumor effekt in vivo sammenlignet med PBS, IL-7 og OXP grupper respectively.The indgivelse af IL-7 alene, medførte en signifikant reduktion i lungevægte og en lille, ikke statistisk reduktion i det endelige tumorvolumen i forhold til PBS i lunge metastase. Administrationen af OXP alene gav ikke nogen anti-tumor effekt i forhold til PBS i lunge metastase. I den abdominale implantation model, administration af OXP alene resulterede i en signifikant reduktion i vægten af tumorknuder og en lille, ikke statistisk reduktion i antallet af tumorknuder i bughulen sammenlignet med PBS. Administrationen af IL-7 alene gav ikke nogen anti-tumor effekt i forhold til PBS i den abdominale implantation model.
I den abdominale implantation model, tumoren i bughulen blev fjernet og vejet, og tumorknuder blev talt, og vejet. IL-7, når de gives sammen med OXP, øget anti-tumor effekt in vivo sammenlignet med PBS, IL-7 og OXP grupper henholdsvis (
P
0,001, n = 6~7). Administrationen af OXP alene resulterede i en signifikant reduktion i vægten af tumorknuder og en lille, ikke statistisk reduktion i antallet af tumorknuder i bughulen sammenlignet med PBS. Administrationen af IL-7 alene gav ikke nogen anti-tumor effekt i forhold til PBS i den abdominale implantation model. (Fig. 2c, 2d)
Kombination af OXP med IL-7 hæmmede spredning og induceret apoptose i mus kolon tumor
Vi analyserede antallet af prolifererende celler ved hjælp af spredning markør Ki-67. Den kombinerede behandling med OXP og IL-7 præsenteret færre Ki-67 positive celler, sammenlignet med IL-7 eller OXP alene og kontrol (
P
0,05) (. Figur 3). Endvidere viste TUNEL-assayet, at den kombinerede behandling med OXP og IL-7 induceret signifikant forøget apoptose af tumorceller (Fig. 4). Den gruppe, der fik kombinationsbehandling viste den højeste apoptotiske indeks (
P
0,01). Disse resultater antyder, at kombinationen af OXP med IL-7 signifikant reduceret celleproliferation og apoptose
in vivo
.
operativt fjernede tumorer i hver gruppe blev analyseret ved immunhistokemisk farvning for proliferationsmarkør Ki 67. en. De repræsentative lysbilleder af hver behandlingsgruppe er vist. Original forstørrelse, × 200. b. Den proliferative aktivitet blev evalueret ved Ki-67-farvning. I hver prøve blev et minimum på 1000 tumorceller scoret i de mikroskopiske områder, der viser den højeste grad af immunfarvning, og resultaterne blev udtrykt som procentdelen af positive celler. Resultaterne blev udtrykt som middelværdi ± S.E. (N = 3).
P
værdier: IL-7 + OXP sammenlignet med de andre behandlingsgrupper, *,
P
0,05, **,
P
0,01. Den kombinerede behandling med OXP og IL-7 præsenteret færre Ki-67 positive celler, sammenlignet med IL-7 eller OXP alene og kontrol.
a. Paraffinsnit blev farvet med TUNEL analyse til påvisning af apoptotiske celler winthin CT26 tumor. De repræsentative dele af hver gruppe er præsenteret. Original forstørrelse, × 200. b. Apoptotisk indeks blev bestemt ved at vurdere det gennemsnitlige antal kerner apoptotiske celler i 5 high-power mikroskopiske felter. Gruppen af kombinationsterapi viste den højeste apoptotiske indeks. Data, repræsenterede apoptotiske indeks blev udtrykt som gennemsnit ± S.E. (N = 3).
P
værdier:. IL-7 + OXP sammenlignet med de andre behandlingsgrupper, *,
P
0,05, **,
P
0,01
Kombination af OXP med IL-7 inducerede signifikante aktiverede T-celler i tumorerne Salg
CD69 er en T-celle-aktivering markør. Vi afgøres derfor, om IL-7, og /eller OXP behandling forbedret tilstedeværelsen af aktiverede CD8 + T-celler (CD8 + CD69 + population) i de to modeller murine kolon tumorer. I lunge metastase på dag 13 efter første behandling blev encellede suspensioner af tumorvæv fra hver gruppe analyseres for aktiverede CD8 + -T-celler ved flowcytometri. Som vist i fig. 5, IL-7 havde alene ingen virkning på CD8 + CD69 + -populationen. OXP alene har øget CD8 og CD69 positive celler i tumorer sammenlignet med PBS-kontroller og IL-7 også. IL-7 kombineret med OXP har øget CD8 og CD69 positive celler i tumorer sammenlignet med PBS-kontroller og IL-7 eller OXP alene. En immunhistokemisk undersøgelse blev udført på tumorprøver opnået fra hver gruppe af mus. Undersøgelsen blev udført for at evaluere mængden af CD8 + T-celler i tumorvæv. Resultaterne evealed at tumorer fra IL-7 og OXP kombination-behandlede mus var stærkt infiltreret med CD8 + T-celler, sammenlignet med PBS, IL-7 eller OXP alene behandlede mus (
P
0,05) (fig. 6). Lignende resultater blev observeret i den abdominale implantation model (fig. 6).
a. I cytometrisk analyse, vi gate data ved hjælp af FSC og SSC bivariate plot, derefter tegne et område omkring klynge af lymfocytter og derefter gate fluorescens histogram på dem. Denne port, i FSC vs SSC view, først er etableret, bliver derefter anvendt til analysen af alle efterfølgende prøver. Repræsentative flowcytometri for hver gruppe blev præsenteret. b.IL-7 kombineret med OXP har øget CD8 + /CD69 + positive celler i tumor i sammenligning med PBS-kontroller og IL-7 eller OXP alene lunge model. Resultaterne blev udtrykt som middelværdi ± S.E. (N = 3).
P
værdier:. IL-7 + OXP sammenlignet med de andre behandlingsgrupper, *,
P
0,05, **,
P
0,01
a. De repræsentative lysbilleder af immunhistokemisk farvning af CD8 hver behandlingsgruppe er vist. Original forstørrelse, × 200. b. blev observeret Graden af CD8 + infiltration i mere end 10 uafhængige high-power (× 200) mikroskopiske felter for hver vævsprøve. De fem mikroskopiske felter med den mest rigelige fordeling blev valgt inden cancercellen reden. Det gennemsnitlige antal CD8 + -T-celler blev talt i de fem mikroskopiske felter. Resultaterne blev udtrykt som middelværdi ± S.E. (N = 3).
P
værdier:. IL-7 + OXP sammenlignet med de andre behandlingsgrupper, *,
P
0,05, **,
P
0,01
Tumor-associerede makrofager og dendritiske celler (DCS) er vigtige bestanddele af leukocyt infiltrere i solide tumorer. Vi undersøgte også antallet af makrofager i tumoren ved flowcytometri med F4 /80-antistof og CD11b-antistof, og antallet af tumor-infiltrerende modne dendritiske celler med CD11b-antistof og CD11c-antistof i lunge metastase. Imidlertid IL-7 og OXP behandlinger havde ingen virkning på antallet af CD11b + F4 /80 + -celler og DC’er i tumorer sammenlignet med dem fra IL-7 alene, OXP alene, og PBS-behandlede mus i lunge metastase (fig. 7).
a. b. Repræsentative flowcytometri for hver gruppe blev præsenteret. c. og d. IL-7 i kombination med OXP havde ingen virkning på antallet af CD11b + F4 /80 + -celler og DC’er i tumorer sammenlignet med dem fra IL-7 alene, OXP alene, og PBS-behandlede mus i lunge metastase.
kombination af OXP med IL-7 reducerede Treg-celler i milt
Vi vurderede, om IL-7 og OXP kombineret behandling havde en effekt på de immunosuppressive cellepopulationer. Milte fra hver gruppe af dyr blev opsamlet, og Treg populationer (CD4 + foxp3 + population) blev analyseret ved flowcytometri. I lunge metastase, fandt vi, at kombinationen-behandlede CT26 colon tumorbærende mus havde en lavere procentdel af Treg celler blandt CD4 + -T-celler i milten, sammenlignet med IL-7 alene, OXP alene, og kontrolmus (Fig. 6 ) (
P
0,05). Lignende resultater blev opnået i abdominal implantation model (
P
0,05). (Fig.8)
a. Repræsentative flowcytometri for hver gruppe blev præsenteret. b. IL-7 i kombination med OXP har reduceret foxp3 + -populationen i CD4 + -T-celler i milten i sammenligning med PBS-kontroller og IL-7 eller OXP alene i både lunge og abdominal metastase-modeller. Resultaterne blev udtrykt som middelværdi ± S.E. (N = 3). P-værdier:. IL-7 + OXP sammenlignet med de andre behandlingsgrupper, *,
P
0,05, **,
P
0,01
MDSCs er heterogene populationer af suppressor celler defineret fænotypisk i mus ved deres co-ekspression af CD11b og Gr-1 [30], [31], [32]. Vi undersøgte også antallet af MDSCs i milt i lunge metastase ved flowcytometri med CD11-antistof og Gr-1-antistof tilgodese deres evne til at undertrykke T-celle-immunresponser. IL-7 og OXP ikke signifikant formindske antallet af MDSC i milten sammenlignet med den for IL-7 alene, OXP alene eller kontrol i lunge metastase (fig. 9).
a. Repræsentative flowcytometri for hver gruppe blev præsenteret. b. IL-7 og OXP ikke signifikant formindske antallet af MDSC i milten sammenlignet med den for IL-7 alene, OXP alene eller kontrol i lunge metastase.
Discussion
effekten af OXP plus IL-7 behandling mod den meget invasive metastatisk mus CT26 colonadenocarcinom blev evalueret på grundlag af satsen for reaktion i vores eksperiment. Vores data viser, at når det gives i samme dosis, OXP plus IL-7 er signifikant mere effektiv end IL-7 eller OXP alene til inhibering af tumorvækst. Vores undersøgelse viser, at OXP plus IL-7 kombinationsbehandling signifikant inhiberede tumorvækst i murine modeller af tyktarmskræft.
Vores resultater viser, at IL-7 alene havde ingen virkning på tumorvækst i mus og IL-7 gjorde ikke ændre celle følsomhed over for OXP i kultur. Derfor er det usandsynligt, at IL-7 har en direkte effekt på tumoren. Den flowcytometri data indikerer, at kombinationen af OXP med IL-7 inducerede signifikant infiltrering af aktiverede T-celler i tumorerne og havde en lavere procentdel af Treg celler i milten. Disse data antydede, at OXP plus IL-7 behandling inhiberede tumorcellevækst ved immunregulering snarere end direkte cytotoksicitet. De antitumorvirkninger af OXP plus IL-7 var forbundet med forøgede procentdele og antal aktiverede CD8 + -T-celler. Der blev også forbundet med hæmmet udviklingen af Treg celler.
IL-7 kan potentielt forbedre immunresponser mod tumoren gennem en række mekanismer [8]. Mange undersøgelser har vist, at IL-7 ekspanderer og opretholder en effektiv T-celler i tumorbærende mus. For eksempel kan IL-7 forbedre vaccine-medieret antitumorimmunitet ved at fremme CD8 ekspansion [21]. Den markant anti-tumor aktiviteten af administration af IL-7 /HGFb in vivo korrelerede med en betydelig stigning i antallet af tumor-infiltrerende CD4 + og CD8 + T-celler [18]. IL-7 synergistisk med IL-12 eller IL-21, der kan forbedre anti-tumor immunitet gennem forstærkning af cytotoksisk T-celler funktion [33], [34]. Forbedret generation af aktiverede dendritiske celler med IL-7 i kombination med andre faktorer er en anden mekanisme, gennem hvilken IL-7 kan forøge antitumor immunrespons [18], [20]. Endvidere IL-7 kan øge antitumor-immunitet ved antagonisering inhibitoriske netværk: begunstige Th17 differentiering, nedregulere transformerende vækstfaktor (TGF) -β produktion, begrænser TGF-β-associeret signalering, og gøre effektorcellerne ildfaste til Treg celler [21] , [35], [36], [37]. Evnen af adjuvans IL-7 til at antagonisere inhibitoriske netværk på det cellulære og molekylære niveau har store konsekvenser for immunterapi i behandling af tumorer.
De fleste anti-tumor aktiviteter af IL-7 blev fundet, når det blev kombineret med andre terapeutiske måder. Anti-tumor effekt var nominel når IL-7 blev anvendt alene [16], [17], [18], [19], [20], [21], [35], [36], [38]. IL-7 alene har vist sig at have nogen virkning på humane tyktarmscarcinomceller xenografter [38]. Kemoterapeutiske stoffer kan inducere anti-tumor immunitet, og disse fund åbne muligheder for at integrere immunterapier med kemoterapi. Anti-tumor aktiviteten af at kombinere IL-7 og kemoterapi er ikke undersøgt. Det er blevet rapporteret, at OXP kan fremme en gunstig immun mikromiljø og stimulere anticancer immunresponser [3], [4]. Eksponering af calreticulin på celleoverfladen og frigivelse af HMGB1 er blevet foreslået som centrale elementer i de immunstimulerende egenskaber OXP [1].
OXP kan forøge immunrespons mod tumorer ved at vippe balancen mellem effektor og regulering /suppressorceller fordel for effektorceller, som det er blevet beskrevet tidligere for andre kemoterapeutiske lægemidler [2], [3]. En gunstig balance mellem T-effektor og T-suppressor-celler er blevet associeret med forbedrede immunresponser mod tumorer [2], [39]. Den manglende effekt af OXP alene i aggressive modeller in vivo er blevet beskrevet [3], [40].
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.