PLoS ONE: Tumor Tissue mikromiljø kan hæmme dendritcellemodning i kolorektal Cancer

Abstrakt

Inflammatoriske mediatorer i tumor mikromiljø fremme tumorvækst, vaskulær udvikling og muliggøre omgåelse af anti-tumor immunrespons, ved at deaktivere infiltrere dendritiske celler. Imidlertid er bestanddelene i tumormikromiljøet, som direkte påvirker dendritcellemodning og funktion ikke godt karakteriseret. Vores mål var at identificere tumorassocierede inflammatoriske mediatorer, der påvirker funktionen af ​​dendritiske celler. Tumor konditionerede medier opnået fra dyrkede colorektal tumor eksplantatvæv indeholdt høje niveauer af kemokiner CCL2, CXCL1, CXCL5 foruden VEGF. Forbehandling af monocytafledte dendritiske celler med denne tumor konditionerede medier inhiberede opregulering af CD86, CD83, CD54 og HLA-DR som respons på LPS, øge IL-10 samtidig reducere IL-12p70 udskillelse. Vi undersøgte, om specifikke individuelle komponenter af tumoren konditionerede medier (CCL2, CXCL1, CXCL5) kunne modulere dendritcellemodning eller cytokinsekretion som reaktion på LPS. VEGF blev også vurderet som det har en undertrykkende virkning på dendritcellemodning. Forbehandling af umodne dendritiske celler med VEGF inhiberede LPS-induceret opregulering af CD80 og CD54, mens CXCL1 inhiberede HLA-DR. Interessant behandling af dendritiske celler med CCL2, CXCL1, CXCL5 eller VEGF undertrykte signifikant deres evne til at udskille IL-12p70 som reaktion på LPS. Desuden dendritiske celler behandlet med en kombination af CXCL1 og VEGF udskilt mindre IL-12p70 som reaktion på LPS sammenlignet med forbehandling med enten cytokin alene. Afslutningsvis tumor konditioneret medier påvirker stærkt dendritcellemodning og funktion

Henvisning:. Michielsen AJ, Hogan AE, Marry J, Tosetto M, Cox F, Hyland JM, et al. (2011) Tumor Tissue mikromiljø kan hæmme dendritcellemodning i kolorektal cancer. PLoS ONE 6 (11): e27944. doi: 10,1371 /journal.pone.0027944

Redaktør: Francesco Dieli, University of Palermo, Italien

Modtaget: 30. maj 2011; Accepteret den 28. oktober 2011; Udgivet: November 18, 2011

Copyright: © 2011 Michielsen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af den irske Forskningsrådet for Videnskab, Teknik og teknologi og Darren Gibbons Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Dendritiske celler (DC’er) er potente antigenpræsenterende celler i stand til at aktivere naive T-celler. DC’er er til stede i væv i en umoden tilstand og vise lave niveauer af modning eller co-stimulerende markører såsom CD83, CD80 eller CD86. Umodne DCs (IDCS) genkende og fange specifikke antigener, herunder tumorantigener. DC’er undergår en funktionel modningsproces som reaktion på inflammatoriske mediatorer, såsom IFN-α eller Toll lignende receptor (TLR) agonister. Som DC’er modnes de får potentialet præsentere antigen for T-celler og aktivering af en specifik anti-tumor T-celle-respons [1], [2]. DC’er, der udskiller høje niveauer af bioaktivt IL-12p70 inducere optimal anti-tumor-immunitet, da de har forøget kapacitet til at øge den naturlige dræbercelleaktivitet, forvrænge reaktion på Th1 og prime tumor specifikke CD8

+ T-celler [3], [ ,,,0],4].

Men mange tumorer unddrage immunresponset ved at udskille cytokiner og andre faktorer, der inhiberer DC differentiering eller modning af tumorinfiltrerende DC’er. [1]. En af disse “pro-tumor ‘faktorer, vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) er kendt for at opretholde tumorvækst via dens angiogene egenskaber, men kan også fremkalde en hæmmende virkning på DC differentiering og modning, øge tumor overlevelse [1], [5] [6], [7], [8]. VEGF har med succes været mål for den humaniseret monoklonalt antistof Bevacizumab (Avastin) [9], men svarprocenter er ca. 40% og mange patienter udvikler resistens over for denne behandling. Det er derfor afgørende at undersøge potentialet i andre inflammatoriske mediatorer til stede i tumor mikromiljø, der kan hæmme DC modning, da disse også kan være potentielle terapeutiske mål.

Flere cytokiner og kemokiner er til stede i høje niveauer i tumor mikromiljø, sammenlignet med normale væv, såsom CCL2 (MCP-1), CXCL1 (GROa) og CXCL5 (ENA-78) [10], [11], [12]. CCL2 er kendt for at tiltrække monocytter, T-celler og dendritiske celler [10], [13], mens den vigtigste funktion af CXCL1 og CXCL5 er at tiltrække og aktivere neutrofiler [14], [15]. Ud over deres kemotiltrækkende funktioner, CCL2, CXCL1 og CXCL5 spiller også en vigtig rolle i angiogenese [15], [16], [17], hvilket viser multifunktionelle karakter af disse kemokiner. Det er kendt, at humane myeloide DC’er udtrykker CCR2 og CXCR2, receptorerne for CCL2 og CXCL1 og CXCL5, henholdsvis [18], [19]. Men virkningen af ​​disse chemokiner på DC modning og funktion ikke tidligere er blevet undersøgt.

I denne undersøgelse anvendte vi eksplanteret human colorectal cancervæv at modellere tumormikromiljøet [20]. Eksplantatpartikler væv opretholde den komplekse 3D-struktur af tumoren, herunder stroma, hvilket således muliggør produktion af mange forskellige tumorassocierede faktorer, nøje efterligner den inflammatoriske miljø af tumoren

in situ

. Tidligere undersøgelser har vist, at supernatanter fra tumorcellelinier kan inhibere DC modning [21], [22], men betydningen af ​​faktorer der udskilles af hele tumoren på dendritcellemodning er ikke tidligere undersøgt.

Vi demonstrerer at Tumor Betinget medier (TCM) fra dyrkede kolorektale kræftsvulster væsentligt hæmmede LPS-induceret DC modning, markant stigende IL-10, mens faldende IL-12p70 sekretion som reaktion på LPS. Vi fandt, at TCM indeholdt betydelige mængder af kemokiner CCL2, CXCL1 og CXCL5 foruden VEGF. Niveauer af CCL2, CXCL1 og CXCL5 i TCM korreleret med CD83-ekspression og IL-12p70 udskillelse fra DC’er behandlet med TCM. Individuelt, alle disse inflammatoriske mediatorer inhiberede signifikant LPS induceret IL-12p70 udskillelsen, men IL-10-sekretion forblev upåvirket. Interessant, virkningerne af CXCL1 og VEGF på inhibering af LPS-induceret IL-12p70 udskillelse af DC’er var additive. Derudover CXCL1 havde også en markant inhiberende virkning på LPS-induceret opregulering af HLA-DR.

Resultater Salg

Tumor konditionerede medier inhiberer DC modning og IL-12p70 udskillelse, mens forstærke IL-10 sekretion som reaktion på LPS

monocytafledt DC’er opnået fra 2 raske frivillige blev inkuberet med forskellige mængder af TCM fra 4 kolorektal cancer patienter i 4 timer før LPS simulering i yderligere 18 timer for at bestemme den optimale koncentration af TCM. Vi undersøgte virkningen af ​​TCM på evnen af ​​DC’er til at secernere IL-10 og IL-12p70 som respons på stimulering med LPS. Sekretion af IL-12p70 af DC’er forstærkes og dirigerer ekspansion og differentiering af tumorspecifikke Th1-reaktioner, mens høje niveauer af IL-10-sekretion præferentielt fører til en udvidelse af immunosuppressive T regulatoriske celler. Behandling af DC’er med en 1 i 2 fortynding af TCM viste at have den mest potente virkning på IL-10 stigning og IL-12p70 inhibering (p = 0,028) som respons på LPS (figur 1). Ingen signifikant forskel blev observeret i ekspression af CD80, CD86, CD54, CD83 og HLA-DR (MHC II), markører associeret med DC modning, mellem forskellige fortyndinger af TCM (data ikke vist). Derfor brugte vi en 1 i 2 fortynding af TCM til yderligere analyse.

Umodne monocytafledt dendritiske celler (IDC’erne) (n = 2) blev behandlet i 4 timer med 1:02, 1:04 og 1:10 fortyndinger af Tumor konditioneret medier (TCM) opnået ved dyrkning af eksplanterede tumorer i 4 kolorektal kræftpatienter

in vitro

i 72 timer. LPS (1 ug /ml) blev tilsat, og cellerne blev dyrket i yderligere 18 timer. Supernatanter blev opsamlet fra celler dyrket som beskrevet ovenfor, og niveauet af IL-10 og IL-12p70 udskillelse fra de DC’er blev målt ved ELISA. Statistiske forskelle bestemtes ved Wilcoxon Rank Sum.

monocytafledt DC’er opnået fra 6 raske donorer blev behandlet med 1 i 2 TCM af 21 colorektale patienter i 4 timer før behandling med LPS i yderligere 18 timer, og interessant, TCM behandlede DC’er udskilte signifikant højere niveauer af IL-10 som reaktion på LPS (p 0,0001), men signifikant lavere niveauer af IL-12p70 (p 0,0001) (figur 2A). Desuden IL-12p70 viste en negativ korrelation med CD83-ekspression Spearman r = -0,71, p. 0,001 (data ikke vist), hvilket yderligere antyder, at TCM behandlede DC’er med stigende CD83 udtryk har faldende niveauer af IL-12p70 sekretion

IDC (n = 6) blev behandlet med TCM af 21 patienter med tarmkræft i 4 timer før tilsætning af LPS; cellerne blev dyrket i yderligere 18 timer. Niveauer af IL-10 og IL-12p70 udskillelse fra de DC’er blev målt ved ELISA. Statistiske forskelle bestemtes ved ANOVA. (A) Ekspression af følgende modning markører: CD80, CD54, CD86, HLA-DR, og CD83 blev bedømt ved flowcytometri. Et repræsentativt eksperiment af seks er vist (B). Den Fold Ændring i M.F.I. af hver markør blev beregnet i forhold til ikke-stimulerede IDCS for celler behandlet med LPS eller TCM + LPS. Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af Wilcoxon-test. (C). *

s

0,05, **

s

0,01, og ***

s

. 0,001

Behandling af DC’er med TCM også signifikant hæmmede LPS-induceret DC modning, med reduceret udtryk for CD54 (

s

0,0001), CD86 (

s

= 0,0035), HLA-DR (

p

= 0,0474) og CD83 (

s

= 0,0018) observeret (figur 2B C). Behandling af DC’er med konditioneret medium udtaget fra normalt væv støder op til tumorvævet (NCM) inhiberede ikke LPS-induceret modning eller cytokinsekretion fra DC’er (figur 3).

Normal konditioneret medium (NCM) 5 kolorektal cancer patienter blev anvendt til behandling monocytafledt DC’er før tilsætning LPS. Ekspression af CD80, CD54, CD86, HLA-DR og CD83 blev målt ved flowcytometri. Ingen statistisk signifikant forskel blev observeret. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Wilcoxon-test.

Niveauer af CCL2, CXCL1, og CXCL5 stede i TCM korrelere med CD83-ekspression og IL-12p70 sekretion fra udviklingslandene

TCM opnået fra 21 patienter med colorectal cancer blev analyseret ved ELISA for flere kendte tumorassocierede faktorer. Niveauer af CCL2, CXCL1 og CXCL5 var konsekvent højere end VEGF (en aktuel terapeutisk mål i colorectal cancer) hos alle patienter undersøges. Vi fandt, at niveauet af CCL2 (Spearman r = 0,59,

s

= 0,0053) CXCL1 (Spearman r = 0,50,

s

= 0,0202) og CXCL5 (Spearman r = 0,50,

p

= 0,0199) til stede i TCM positivt korreleret med CD83-ekspression på DC’er, behandlet med TCM (figur 4A). Dette indebærer, at med stigende niveauer af CCL2, CXCL1 og CXCL5 stede i TCM, er CD83-ekspression hævet på DC’er behandlet med TCM. Selvom VEGF er til stede ved detekterbare niveauer i TCM, det viste ingen korrelation med DC modning. Derudover fandt vi, at IL-12p70 sekretion fra udviklingslandene behandlet med TCM negativt korreleret med CCL2 (Spearman r = -0,64,

s

= 0,0019), CXCL1 (Spearman r = -0,59,

p

= 0,0049) og CXCL5 (Spearman r = -0,57,

s

= 0,0075) (figur 4B). Dette antyder, at med stigende niveauer af CCL2, CCL1 og CXCL5 i TCM, IL-12p70 udskillelse fra DC’er falder. Der var ingen signifikant korrelation mellem de fire cytokiner og de andre DC markører, CD80, CD54, CD86, og HLA-DR, og IL-10-sekretion.

Koncentrationer af CCL2, CXCL1, CXCL5 og VEGF i tumor konditioneret medier af 21 colorectale cancerpatienter blev målt ved ELISA. Koncentrationerne af CCL2, CXCL1 og CXCL5 korreleret med ekspression af CD83 på DC’er behandlet med TCM (A). CCL2, CXCL1 og CXCL5 omvendt korreleret med sekretion af IL-12p70 fra dendritiske celler behandlet med TCM (B). Den Spearman rank korrelation test blev anvendt.

Effekt af CCL2, CXCL1, CXCL5 og VEGF på DC modning markør udtryk og cytokinsekretion som reaktion på LPS

Efter at have konstateret, at TCM hæmmer DC modning som reaktion på LPS, og at TCM indeholder høje niveauer af kemokiner CCL2, CXCL1 og CXCL5 vi næste bestemmes, hvis disse individuelle komponenter havde en direkte virkning på udviklingslandene. Rekombinant VEGF signifikant hæmmede LPS-induceret ekspression af DC modning markører CD80 (

s

= 0,0391) og CD54 (

s

= 0,0078) og CXCL1 hæmmede opregulering af HLA-DR (signifikant

s

= 0,0156) (data ikke vist). Selvom CCL2 og CXCL5 viste en reduktion af LPS-induceret modning af DC’er, dette ikke statistisk signifikans (data ikke vist). Mens forbehandling af DC’er med CCL2, CXCL1, CXCL5 eller VEGF undladt at forøge LPS-induceret IL-10-sekretion blev et signifikant fald i niveauerne af LPS-induceret IL-12p70 udskillelse observeret: CCL2 (

p

= 0,048), CXCL1 (

s

= 0,0068), CXCL5 (

s

= 0,0255), VEGF (

s

= 0,0402) (figur 5). IL-1β, TNF-α, IL-8 og IL-6-produktion af DC’er som respons på LPS i fravær eller nærvær af forbehandling med VEGF, CCL2, CXCL1 eller CXCL5 blev også målt; men der var ingen signifikante forskelle i niveauerne af disse cytokiner fastsat i henhold til disse betingelser (data ikke vist). Behandling af DC’er med CCL2, havde CXCL1, CXCL5 og VEGF ikke påvirke deres evne til at inducere T-celleproliferation eller produktion af IFNy (data ikke vist).

Supernatanterne af DC’er dyrket i nærvær af CCL2, CXCL1 , CXCL5 og VEGF (n = 8) blev høstet og koncentrationer af IL-10 og IL-12p70 bestemt ved ELISA. Statistisk signifikans blev bestemt ved Mann-Whitney U test. * P 0,05, ** p. 0,01

Derudover undersøgte vi, om CCL2, CXCL1, CXCL5 og VEGF kunne påvirke DC migration. CCL19 blev anvendt som en positiv kontrol, da det vides at binde til kemokiner receptor CCR7, som udtrykkes af DC’er [23]. Vi fandt, at de ikke øgede migration i forhold til CCL19 (data ikke vist).

CXCL1 og VEGF har en additiv inhibitorisk virkning på IL-12p70 udskillelse af DC’er som reaktion på LPS

TCM har en potent hæmmende virkning på DC modning og funktion, men CCL2 og CXCL5, som er til stede i høje niveauer i TCM, har ikke en signifikant effekt på dendritcellemodning markør udtryk, mens CXCL1 kun signifikant hæmmede HLA-DR og VEGF hæmmes betydeligt CD80 og CD54 (data ikke vist). Derfor undersøgte vi, om at kombinere de rekombinante cytokiner kan have en mere potent virkning på dendritcellemodning. Vi undersøgte syv forskellige kombinationer af de fire cytokiner: CCL2 + CXCL1, CCL2 + CXCL5, CCL2 + VEGF, CXCL1 + CXCL5, CXCL1 + VEGF, CXCL5 + VEGF, CCL2 + CXCL1 + CXCL5 + VEGF. Kombinationen af ​​CXCL1 og VEGF ikke signifikant hæmmer LPS-induceret modning markør udtryk ved udviklingslandene (CD80

s

= 0,0625, CD54

s

= 0,6, CD86

s

= 0,6, HLA-DR

s

= 0,1, CD83

s

= 0,8) (figur 6A). Men at kombinere CXCL1 og VEGF væsentligt reduceret LPS-induceret IL-12p70 (

s

= 0,0028), men ændrede ikke niveauerne af IL-10 (figur 6B). IL-1β, TNFa, blev IL-8 eller IL-6 sekreter ikke ændret (data ikke vist). Ingen anden kombination havde en direkte virkning på LPS-induceret DC modning eller cytokinsekretion af DC’er som reaktion på LPS sammenlignet med de individuelle cytokiner (data ikke vist). Desuden medtagelse af neutraliserende antistoffer til CXCL1 og VEGF, alene og i kombination, ikke korrekt TCM induceret ændring af DC modning, IL-10 eller IL-12p70 udskillelse fra DC’er som respons på LPS (data ikke vist).

IDC’erne (n = 5) blev behandlet med en kombination af rekombinant CXCL1 (100ng /ml) og VEGF (20 ng /ml), 4 timer inden tilsætningen af ​​LPS (1 ug /ml). Cellerne blev derefter dyrket i yderligere 18 timer og niveauet for CD80, CD54, CD86, HLA-DR og CD83 blev bedømt ved flowcytometri. Resultaterne er vist som fold-ændring i M.F.I. i forhold til ubehandlede IDC’erne. Statistisk signifikans blev bestemt ved Wilcoxon-test (A). Supernatanter blev fjernet fra celler behandlet som beskrevet ovenfor, og koncentrationen af ​​IL-10 og IL-12p70 blev bestemt ved ELISA. Statistisk signifikans blev beregnet ved Wilcoxon Rank Sum (B). * P 0,05, ** p. 0,01

Diskussion

I dette studie har vi vist for første gang, at tumor konditioneret medie fra kolorektale kræft tumoreksplantater væsentligt kan hæmme LPS -induceret modning af monocytafledte DC’er. Derudover behandling af DC’er med TCM før LPS-stimulering signifikant forøget produktion af IL-10, et anti-inflammatorisk cytokin, som inhiberer en Th1-respons [24], men med færre sekretionen af ​​IL-12p70, en pro-inflammatorisk cytokin kræves til Th1-reaktioner: en DC fænotype associeret med tolerance. Efterfølgende fandt vi, at CCL2, CXCL1 og CXCL5 blev udtrykt ved høje niveauer i TCM forhold til VEGF, og vi bestemt, hvis disse inflammatoriske mediatorer kunne ændre funktionen af ​​udviklingslandenes. VEGF blev inkluderet i vores analyser, som det tidligere havde vist sig at hæmme DC modning [8], [22]. Tilsætning af rekombinant VEGF til IDCS havde en inhibitorisk virkning på LPS-induceret opregulering af CD80 og CD54, samtidig med at tilføje rekombinant CXCL1 til IDC’erne faldt HLA-DR-ekspression efter LPS-behandling.

Men behandling af IDC’erne med human rekombinant CCL2, CXCL1, CXCL5 eller VEGF, ved doser på linje med andre undersøgelser [13], [22], [25], [26], resulterede i signifikant reduceret niveauer af IL-12p70 sekretion som respons på LPS stimulering. Disse data antyder, at inflammatoriske mediatorer stede i tumormikromiljøet reducere kapaciteten af ​​lokale DC’er til at udskille IL-12p70 og dermed fremkaldelse af en effektiv anti-tumor respons.

Lignende resultater blev rapporteret i et forsøg, der undersøgte effekten af konditionerede medier taget fra pancreascancer cellelinien BxPC-3 (BxCM), hvor DC differentiering og modning blev inhiberet af BxCM. Undersøgelsen viste, at BxCM reducerede ekspressionen af ​​CD83, CD1a, CD1c, CD80 og CD86 ved DC’er som reaktion på TNFa. I overensstemmelse med vores resultater, denne undersøgelse fandt en signifikant stigning i IL-10 og en reduktion i IL-12p70 produktionen som reaktion på stimulering med TNFa følgende BxCM behandling [27]. Derimod kan behandlingen af ​​DC’er med supernatant af RCC-10 (renal cell carcinoma celler), resulterede i en reduktion i ekspressionen af ​​modningen markører, men påvirkede ikke IL-10-produktion som respons på stimulering med TNFa, IFNa og poly I: C [22]. Disse undersøgelser, sammen med data præsenteret her, tyder på, at mange tumortyper udskiller inflammatoriske mediatorer, der kan hæmme funktionaliteten af ​​udviklingslandene; men at der sandsynligvis vil være variation i den inflammatoriske miljø og den resulterende virkning på DC-funktion ifølge tumortype og stadie. Selv om det ville have været interessant at vurdere og isolere de faktiske niveauer af DC infiltration i tumoren eksplantatvævet, kunne dette ikke udføres på grund af begrænsningen af ​​eksplantatvævet størrelse, vi har modtaget fra kirurgi. Vores resultater viser, at NCM ikke signifikant påvirker DC modning eller cytokinsekretion, hvilket indikerer, at den normale tilstødende væv kan have funktionel immunitet. Der var ingen tegn på en immunosuppressiv felt effekt.

VEGF er etableret som en vigtig faktor, der bidrager til tumorvækst ved at inducere angiogenese. VEGF er et terapeutisk mål i flere kræftformer, herunder kolorektal cancer, hvor humaniseret anti-VEGF mAb, Bevacizumab (Avastin) er ansat. Tidligere undersøgelser har vist, at VEGF hæmmer DC modning og DC’er evne til at aktivere T-celler [5], [8], [22]. I denne undersøgelse viser vi, at VEGF inhiberer ekspressionen af ​​CD80 og CD54, men ikke CD86 eller HLA-DR, sammenholder data med Alfaro

et al.

[22]. Interessant nok fandt vi, at VEGF behandlede DC’er udskilte signifikant reducerede niveauer af IL-12p70 som reaktion på LPS; en konstatering af, at der ikke tidligere er blevet dokumenteret. Anvendelsen af ​​LPS at modne DC’er, versus modning cocktail bestående af TNFa, IFNa og poly I: C anvendt af Alfaro

et al

kan forklare de observerede i virkningen af ​​VEGF på DC modning og IL forskelle. -12p70 sekretion. Vores fund, at VEGF-stimulering af DC’er ikke påvirker T-celleproliferation og cytokinsekretion er konsistent med Alfaro

et al.

, Men de fandt en inhibitorisk virkning af VEGF når til stede ved differentiering fase af DC udvikling, hvilket indikerer, at opdelte DC’er kan være mindre responsive over for virkningerne af VEGF [22]. Vores undersøgelse viste også, at vores kolorektal cancer patienter eksplantatvæv udskilles høje niveauer af CCL2, CXCL1 og CXCL5, i forhold til VEGF. Interessant, CCL2, CXCL1 og CXCL5 niveauer i TCM korreleret med CD83-ekspression på TCM behandlede DC’er. Det er første gang er blevet observeret denne sammenhæng, og foreslår, at patienter med højere niveauer af CCL2, kan CXCL1 eller CXCL5 have forøgede niveauer af CD83 på DC’er. CD83 er meget vigtigt for naiv T-celle og B-celle-aktivering [28], [29], men vi fandt også, at forøget ekspression af CD83 på DC’er behandlet med TCM korreleret med reduceret IL-12p70 udskillelse fra TCM behandlede DC’er. Det er tidligere blevet rapporteret, at mens forskellige stimuli kan modne DC’er til tilsvarende niveauer, med lignende ekspression af CD83, CD80 og CD86, profilen af ​​cytokiner, som de udskiller forskellige; stimuli, såsom IFN-γ kan resultere i IL-12-secernerende CD83 + DC’er, der stimulerer Th1-reaktioner, mens andre stimuli, såsom prostaglandin E2 resultat i CD83 + DC’er, der udskiller ingen IL-12, men effektivt fremme et Th2-respons [30].

Mens det er blevet rapporteret, at CCL2, CXCL1 og CXCL5 er vigtige for tumorvækst, proliferation og angiogenese [31], [32], virkningen af ​​disse chemokiner på DC’er har ikke tidligere været dokumenteret. CCL2, CXCL1 og CXCL5 niveauer i TCM korrelerede omvendt med IL-12p70 udskillelse, det er første gang er blevet observeret denne sammenhæng, og foreslår, at med stigende niveauer af CCL2, CXCL1 og CXCL5 i TCM, IL-12p70 udskillelse fra DC’er er reduceret. CCL2 er en kemoattraktant for monocytter, memory T-celler og dendritiske celler [26], [31]. CCL2 er også tidligere blevet rapporteret at inducere angiogenese [17], som er vigtig for tumorvækst og metastase. Både pro- og anti-tumor effekter af CCL2 er observeret gennem dets virkning på monocytter og makrofager [31], mens her viser vi, at CCL2 også kan påvirke immunresponset anti-tumor ved at påvirke evnen af ​​DC’er til at udskille IL-12p70 men ikke andre cytokiner, herunder IL-10, IL-1β, IL-6, IL-8 eller TNF-α som reaktion på LPS-stimulering. I modsætning hertil Braun

et al.

Har tidligere vist, at CCL2 kan hæmme IL-12p70 produktionen fra monocytter og dette er pertussistoksin følsom, men de gjorde ikke overholder denne reduktion i IL-12p70 sekretion fra dendritiske celler behandlet med enten SAC + IFNy eller CD40L + IFNy [33]. Alternativt Omata

et al., Fundet DC’er differentieret fra monocytter i nærvær af CCL2 havde en reduceret kapacitet til at udskille IL-12p70 efter stimulering med CD40-ligand, en effekt ikke følsom over for pertussis toxin. Disse forfattere rapporterede ingen effekt af CCL2 på differentiering eller modning af DC’er. [34]. Derfor er den præcise mekanisme, hvorved CCL2 udøver sin virkning på DC’er stadig at blive fuldstændigt belyst.

Mens virkningen af ​​CXCL1 og CXCL5 på DC modning og cytokinsekretion ikke tidligere er blevet undersøgt, deres kendte funktion er at tiltrække og aktivere neutrofiler [14], [15], som igen har været impliceret med tumorcellevækst, angiogenese og metastase [35]. Da udviklingslandene udtrykker CXCR2 [19], som er receptoren for CXCL1 og CXCL5, er det ikke overraskende, at CXCL1 og CXCL5 kunne have en effekt på DC-funktion. Kemokiner såsom CCL2, CXCL1 og CXCL5 signalere gennem G-proteinkoblede receptorer, og som kontrollerer intracellulære cAMP-niveauer og forøget cAMP-niveauer korrelerer med nedsat IL-12-produktion [36]. Imidlertid er den mekanisme, hvormed disse chemokiner reducerer IL-12p70 udskillelse fra DC’er ikke kendt, og det vil være genstand for vores fremtidige undersøgelser.

Interessant CXCL1 og VEGF har en additiv inhibitorisk virkning på IL-12p70 udskillelse. De virker på forskellige receptorer, der tidligere har været vist at være til stede på DCs [7], [19], derfor de kunne aktivere forskellige signalveje samtidigt, eller de kunne aktivere den samme vej mere effektivt. VEGF har vist sig at forbedre phospho-ERK1 ERK2 i udviklingslandene og denne vej negativt regulerer monocytafledt DC modning [7], [37]. Som signalveje aktiveres af CXCL1 gennem CXCR2 i dendritiske celler er endnu ukendt, men undersøgelser i forskellige celletyper, såsom cancerceller, viser, at CXCR2 signalering kan aktivere NF-KB, STAT3 og ERK pathways [38], [39] , [40]. Derfor er der en række potentielle mekanismer, hvormed CXCR2 ligander kan inhibere sekretionen af ​​IL-12p70 af DC’er. Imidlertid immun nedbryder en af ​​disse cytokiner alene eller i kombination med neutraliserende antistoffer ikke vende den inhibitoriske virkning af TCM. Dette beviser, at det er sandsynligvis flere forskellige faktorer, der virker sammen, at årsagen DC hæmning. Dette er i overensstemmelse med tidligere forskning viser, at blokering af en enkelt faktor, VEGF i supernatanter af RCC-10 celler ikke havde en signifikant effekt på DC-aktivering [22].

Vi observerede, at CCL2, CXCL1, CXCL5 og VEGF ikke blokerer DC modning, heller ikke påvirker DC migration eller T-celleproliferation. I modsætning til udviklingslandene behandlet med TCM har de enkelte inflammatoriske mediatorer ikke øge IL-10 men de alle hæmmede IL-12p70 sekretion; en effekt der ikke tidligere vist for CCL2, CXCL1, CXCL5 og VEGF. Eksplantatet tumorvæv udskiller mange forskellige opløselige faktorer, og det er ikke meget overraskende, at nogle få isolerede faktorer på egen hånd ikke har en virkning svarende til TCM. Det er meget sandsynligt, at mange forskellige faktorer secerneret til TCM ved eksplantatet tumor handling sammen til inhibering DC modning og funktion. Imidlertid evne CCL2, CXCL1, CXCL5 og VEGF at reducere IL-12p70-produktion af DC’er er vigtig, da dette potentielt kan resultere i en reduceret anti-tumor Th1-respons

in vivo

.

Afslutningsvis fandt vi, at TCM inhiberer DC modning, og inducerer IL-10, mens inhibering IL-12p70 sekreter fra DC’er. TCM komponenter CCL2, CXCL1, CXCL5 og VEGF synes at spille en rolle i modulering af inflammatoriske respons gennem hæmning af IL-12p70 udskillelsen af ​​DC’er, eventuelt at beskytte tumoren fra en potent immunologisk respons mod det. Desuden CXCL1 og VEGF handle i fællesskab i inhibering af IL-12p70 udskillelse fra DC’er. Selvom CCL2, CXCL1, CXCL5 og VEGF er til stede i TCM i høje niveauer, er de ikke de vigtigste komponenter i TCM som påvirker DC modning og funktion. Afslutningsvis har vi vist, hvor vigtigt det tumor konditioneret medium i reguleringen dendritiske celle funktion i kolorektal cancer patienter, men de underliggende mekanismer stadig skal belyses.

Materialer og metoder

Ex vivo tumor eksplantation kultur

Alle væv blev opnået med informeret skriftligt samtykke fra patienten, og protokollen blev godkendt af den etiske komité St. Vincents Universitetshospital.

Kirurgisk resektion kolorektal cancer tumorvæv ( n = 21) og normalt væv ( 10 cm fra tumoren, n = 5) blev opnået fra patienter fra Center for kolorektal sygdom s eksplantatvæv bio-bank på St. Vincents Universitetshospital, Dublin (12 mænd, 9 kvinder, median alder 67, en fase II, 5 Trin III, 15 trin IV tyktarmskræft). Det eksplanterede væv blev skåret i mindst 4 lige store stykker af ca. 5 mm

3 og dyrket som tidligere beskrevet [20]. Kort fortalt, de eksplanterede tumorvæv blev dyrket i 72 timer (i plader med 24 brønde) i 2 ml RPMI 1640 indeholdende 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 4 ug /ml Fungizone, 30 ug /ml gentamicin (Invitrogen; Carlsbad , California) og suppleret med 20% føtalt bovint serum (Invitrogen). Efter 72 timer i kultur, blev Tumor konditionerede medier (TCM) og normale konditionerede medier (NCM) opsamlet og opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse til analyser.

dendritisk celle isolering og dyrkning

Humane monocytafledte umodne dendritiske celler (IDCS) blev genereret fra perifere mononukleære blodceller (PBMC’er) opnået fra buffy coat præparater (National Blood Centre, St. James Hospital, Dublin). Monocytter blev isoleret ved positiv selektion under anvendelse af CD14-magnetiske perler (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland) og podet ved en tæthed på 1 x 10

6 celler /ml i plader med 6 brønde i 3 ml RPMI 1640 indeholdende 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 4 ug /mL Fungizone og suppleret med 10% defineret Hyclone kalvefosterserum (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), human granulocyt-makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF; 50 ng /ml, Immunotools, Friesoythe, Tyskland), og human IL-4 (70 ng /ml; Immunotools). Celler blev fodret på dag 3 ved at erstatte halvdelen af ​​mediet og tilsætning af frisk cytokiner. På dag udstillet 6 cellerne en umoden DC fænotype (CD14

-, CD11c

+, CD86

-, CD54

lav, CD83

-, CD80

– og HLA DR

lav).

Stimulering af monocytafledt DC

Frisk isolerede IDC blev udpladet i tredobbeltbestemmelse i 96 brønd plader ved 1 x 10

5 celler /200 pi i RPMI 1640 medier suppleret med 10% defineret Hyclone FBS (Thermo Fisher Scientific), og stimuleret med 1 i 2, 1: 4 og 1 i 10-fortynding af tumor konditionerede medier (TCM) fra 4 dyrkede eksplantatpartikler væv i 4 timer før tilsætning af 1 ug /ml

Escherichia coli

lipopolysaccharid (LPS, Alexis Biochemicals, Lausen, Schweiz) at bestemme den bedste dosis af TCM. Efterfølgende DC’er blev behandlet med en 1 i 2 fortynding TCM af alle 21 patientprøver eksplantatpartikler væv i 4 timer før tilsætning af 1 ug /ml LPS. Desuden blev DC’er behandlet med en 1: 2 fortynding af NCM af 5 patientens eksplantatpartikler væv i 4 timer før 1 ug /ml LPS blev tilsat. I separate eksperimenter 1 × 10

5 IDC /200 pi medier blev behandlet med humant rekombinant 50 ng /mL CCL2 (MCP-1), 100 ng /mL CXCL1 (GROa), 100 ng /mL CXCL5 (ENA-78)