PLoS ONE: Integrativ chip-seq /microarray analyse Identificerer en CTNNB1 Target Signatur Beriget i tarm Stamceller og tyktarmskræft

Abstrakt

Baggrund

Deregulering af kanoniske Wnt /CTNNB1 (beta-catenin) vej er en af ​​de tidligste begivenheder i patogenesen af ​​tyktarmskræft. Mutationer i

APC

eller

CTNNB1

er meget hyppige i tyktarmskræft og forårsage afvigende stabilisering af CTNNB1, som aktiverer transskription af Wnt målgener ved at binde til kromatin via TCF /LEF transkriptionsfaktorer. Her rapporterer vi en integrativ analyse af genom-dækkende kromatin belægningsprocent på CTNNB1 af kromatin immunopræcipitation kombineret med high-throughput sekventering (chip-seq) og genekspression profilering af microarray analyse på RNAi-medieret knockdown af CTNNB1 i tyktarmskræft celler.

Resultater

Vi observerede 3629 CTNNB1 bindende toppe hele genom og en signifikant sammenhæng mellem CTNNB1 binding og knockdown-induceret genekspression forandring. Vores integrativ analyse førte til opdagelsen af ​​en direkte Wnt target underskrift sammensat af 162 gener. Gene ontologi analyse af denne signatur afslørede en betydelig berigelse af Wnt pathway gener, hvilket tyder på flere feedback-reglerne i vej. Vi leverer dokumentation for, at dette gen signatur delvist overlapper med Lgr5

+ intestinal stamcelle signatur, og er betydeligt beriget i normale tarm stamceller samt i kliniske kolorektale cancer prøver. Interessant, mens ekspressionen af ​​CTNNB1 målgenet sæt ikke korrelerer med overlevelse, høj ekspression af negativ feedback regulatorer inden signaturen forudsiger bedre prognose.

Konklusion

Vores data giver et genom-dækkende billede af kromatin belægning og genregulering af Wnt /CTNNB1 signalering i colon cancerceller

Henvisning:. Watanabe K, Biesinger J, Salmans ML, Roberts BS, Arthur WT, Cleary M, et al. (2014) Integrativ chip-seq /microarray analyse Identificerer en CTNNB1 Target Signatur Beriget i tarm Stamceller og tyktarmskræft. PLoS ONE 9 (3): e92317. doi: 10,1371 /journal.pone.0092317

Redaktør: Ted S. Acott, Casey Eye Institute, USA

Modtaget: 30 oktober, 2013; Accepteret: 20 februar 2014; Udgivet: 20 Mar 2014

Copyright: © 2014 Watanabe et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Finansiering fra Susan G. Komen give KG110897 (XD), en amerikanske forsvarsministerium BCRP Postdoc Fellowship (KW W81XWH-10-1-0383), og National Institutes of Health indrømmer R01HG006870 (til XX). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Brian S. Roberts og William T. Arthur er tidligere ansatte i Rosetta Inpharmatics, LLC , Merck Co Inc. Michele Cleary er i øjeblikket ansat i Merck Co., Inc. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Baggrund

Wnt /CTNNB1 signalering er en konserveret vej der spiller fundamentale roller i fosterudviklingen, vævshomeostase og vedligeholdelse af stamceller. Ved normal tarm, denne vej er afgørende for udvikling og vedligeholdelse af intestinale stamceller [1], [2]. Aktivering af kanonisk Wnt signalering involverer stabilisering af cytoplasmatisk CTNNB1, som ellers nedbrydes af proteasomet gennem en nedbrydning kompleks sammensat af tumorsuppressorprotein APC, serin /threonin kinase GSK-3, og Axin. Stabiliseret CTNNB1 translokerer ind i kernen, hvor det binder til TCF /LEF transkriptionsfaktorer og aktiverer målgenekspression [2]. En vigtig indledning tilfælde af tarmkræft (CRC’er) er CTNNB1 stabilisering gennem tab af

APC

gen eller aktiverende mutationer i

CTNNB1

gen [3]. Denne genetiske begivenhed forekommer primært i den intestinale stamcellepopulation [4] – [6] og fører til unormal proliferation af muterede celler ved aktivering af target gener, såsom

MYC

og

CCND1

[7 ]. Men i betragtning af de divergerende cellulære roller Wnt /CTNNB1 signalering, andre målgener kan også bidrage til patogenesen af ​​CRC’er.

Således identifikation og karakterisering af CTNNB1 målgener genom-dækkende har været en vigtig forfølgelse i CRC undersøgelser. Transskriptionsprofilering blev anvendt til at identificere Wnt /CTNNB1 målgener i colon cancerceller [8]. Imidlertid er analyse af genekspression alene begrænset på grund af manglende evne til at skelne mellem primære og sekundære virkninger af Wnt-aktivering. For nylig chromatin immunoprecipitation (chip) efterfulgt af store DNA-analyse, såsom DNA-chip (chip-chip) eller høj-throughput sekventering (chip-seq) [9], [10] blev anvendt til at identificere det genomiske loci til som CTNNB1 eller TCF faktorer binder direkte [11] – [14]. Men chip-baserede undersøgelser af forskellige transkriptionsfaktorer antyder, at ikke alle bindende begivenheder identificeret korrelerer med transkriptionel regulering på et funktionelt niveau [15]. Derfor er det vigtigt at udføre en integrativ analyse inkorporerer både hele genomet chromatin belægning kortlægning og genekspression profilering i den samme type coloncancer celler for at identificere direkte og funktionelle Wnt /CTNNB1 målgener, som endnu ikke er blevet gjort i litteraturen.

i den aktuelle undersøgelse, kombinerer vi chip-seq med microarray analyse under anvendelse af SW480 human colon cancer cellelinje, hvor dereguleret Wnt signaleringsaktivitet er veldokumenteret. Vi rapporterer en signifikant sammenhæng mellem CTNNB1 binding og udtryk regulering, og identifikation af en kerne af 162 gener som ‘Wnt direkte målgener’, der er bundet og aktiveres af CTNNB1. Wnt målgen signatur blev beriget i normale intestinale stamceller og CRCs men undlod at forudsige prognosen for CRC patienter. Vores undersøgelse giver en vigtig ressource for forståelsen biologi Wnt signalering.

Resultater

chip-seq analyse af CTNNB1 kromatin belægning i SW480 celler

SW480 celler indeholder en inaktiverende mutation i

APC

gen, der resulterer i et højt niveau af konstitutivt stabiliseret CTNNB1 protein i kernerne [16], [17]. For at fange den formentlig dynamisk samspil mellem CTNNB1 med kromatin [18], [19], vi optimeret en chip protokol hjælp aminspecifikke protein-protein tværbindere før formaldehyd tværbinding kombineret med nukleare udvinding [20] (se metoder) . Specifik binding af CTNNB1 blev først godkendt af chip-PCR for kendte mål, herunder

MYC

og

LEF1

(figur 1A). DNA fra flere chip forsøg med anti-CTNNB1 antistof eller isotypekontrol IgG kontrol blev samlet for Solexa /Illumina sekventering, der gav ca. 26 millioner individuelle 36-nukleotidsekvens læser i hver kørsel. Kun læser entydigt mappes på det humane genom (15.776.628 for kontrol IgG og 17.112.552 for anti-CTNNB1) blev anvendt til den efterfølgende analyse (tabel 1). Model-Based Analyse af chip-Seq (MACS) [21] identificerede 3629 CTNNB1 bindende peak regioner (

s Drømmeholdet værdi ≤ 1E-5, FDR ≤ 5%) på tværs af hele genomet (tabel 1). Ca. 60% af toppene er placeret i en tæt nærhed af gen-kodende regioner herunder promotor (2-kb 5′-flankerende region, 21,5%), 5′-UTR (6,9%), exon (5,5%), intron (21,6 %), 3′-UTR (3,2%) og nedstrøms (2-kb 3′-flankerende region, 0,5%) regioner (figur 1B). Berigelse af CTNNB1 binding på projektlederne (21,5%) var statistisk signifikant (

s

0,001) sammenlignet med fordelingen af ​​tilfældigt genererede toppe af lignende størrelser (3,5 ± 0,2%). I overensstemmelse med en tidligere rapport [12], peak fordeling korreleret signifikant med nærheden af ​​de transkriptionelle start- sites (TSS) (figur 1C). Da en CTNNB1 /TCF-bundne enhancer kan virke fjernt fra TSS [18], søgte vi for TSSs der er placeret inden for 20 kb fra de observerede toppe, og identificeret 2794 gener, som blev anvendt i den efterfølgende analyse for at identificere de direkte målgener .

A.

chip optimering. Chip-PCR blev udført for kendte CTNNB1-bindende elementer i MYC og LEF1 gen regulatoriske regioner. * Anti-PYGO2 antistof blev anvendt som en positiv kontrol, som PYGO2 protein associerer med den CTNNB1-TCF /LEF proteinkompleks [51].

B.

Fordeling af CTNNB1-bindende regioner på genomet i forhold til RefSeq humane gener. A ‘promotor “defineres som 2-kb region opstrøms for TSS, hvorimod en” nedstrøms “region defineres som 2-kb region nedstrøms for transkriptionstermineringssted. Intergeniske region henviser til alle andre end ‘promotor’, 5′-UTR, “exon ‘,’ intron ‘,’ 3′-UTR” eller “downstream” steder.

C.

Afstand fra midten af ​​hver CTNNB1 bindende spids til TSS af den nærmeste genet. Den røde linje repræsenterer en tilfældigt fordelt mønster genereret ved at tage 1000 tilfældige permutationer af toppene.

D.

MEME program identificerer en konsensus TCF /LEF-bindende motiv inden chippen-seq toppe.

Brug flere EM for Motif Elicitation (MEME), en de novo motiv opdagelse programmet [22], analyserede vi de unikke CTNNB1 toppe for tilstedeværelsen af ​​en eventuel konsensus motiv. En udvidet TCF /LEF konsensussekvens [12], [13] dukket som de højest rangerede motiv (E value = 7.9e-1135) (figur 1D). Der blev også identificeret en række andre kandidatlande sekvenser; men de syntes at repræsentere repetitive sekvenser, som er fælles artefakter af denne analyse (data ikke vist). Disse data bekræfter, at CTNNB1 binder til kromatin primært gennem TCF /LEF DNA-bindende proteiner [11]. Dette sagt, vi kan ikke udelukke de potentielle bindende motiver, som ikke er opdaget af MEME, samt eksistensen af ​​andre tilknyttede motiver, der ligger uden for chippen peak regioner [12], [14]. Faktisk en k-mer search [23] viste, at AP-1 konsensus sekvens (TGAYTCA) signifikant er beriget i forhold til tilsvarende størrelse tilfældige genomiske fragmenter (

s

= 1.78e-50), i overensstemmelse med tidligere arbejde rapportering berigelsen af ​​AP-1 motiver i CTNNB1-bindende elementer [12].

Brug af UCSC Genome browser (NCBI36 /hg18) [24], vi visualiseret CTNNB1 binding til kendte Wnt /CTNNB1 målgener.

Axin2

er et klassisk mål og indeholder flere TCF /LEF bindende regioner i dets promotor og første intron [25]. Vores chip-seq analyse faktisk identificeret flere toppe i

AXIN2

, med deres positioner svarer godt med de rapporterede bindingssteder (figur 2A). Vi har detekteret også toppe ved de rapporterede regioner af andre kendte målgener herunder

MYC

[12] og

LEF1

[26] (Figur 2B og C).

Vist er resultater for CTNNB1 og IgG distributioner på Ref-seq gens. Røde felter angiver positionerne for konsensus TCF /LEF-bindende motiver. H3K4me1 og H3K4me3 domæner fra flere Encyclopedia of DNA Elements (KODE) cellelinjer er vist som henvisninger til forstærker /promotor og promotorområder henholdsvis.

Kombinatorisk analyse af kromatin bindende og genekspression data identificerer en direkte CTNNB1 målgenet signatur indeholder feedback-regulatorer af Wnt signalvejen

at identificere direkte og funktionelt relevante CTNNB1 målgener, vi analyserede chip-seq datasæt mod transkriptionelle profilering data for kontrol og CTNNB1-udtømte SW480 celler [27] . Som tidligere beskrevet [27], knockdown af CTNNB1 blev opnået under anvendelse af to forskellige CTNNB1-specifikke siRNA’er, som når det afprøves i et funktionelt assay under anvendelse af en beta-catenin-Aktiveret Reporter (BAR) [28] var i stand til at undertrykke BAR aktivitet ved -99 % og ~97% hhv. Vi udførte Gene sæt berigelse analyse (GSEA) ved hjælp af den modificerede Kolmogorov-Smirnov (KS) test [29] for at evaluere de CTNNB1-bundne gener for deres fordeling i microarray datasæt, hvor generne blev rangordnet efter deres differentielle ekspression mellem kontrol og CTNNB1-depleterede celler. KS-test afslørede en yderst signifikant korrelation (

s

= 0) mellem CTNNB1 binding og genekspression ændringer efter CTNNB1 knockdown, og dette var sandt med begge siRNAs (figur 3A og data ikke vist). Et flertal af CTNNB1-bundne gener blev positivt korreleret, medens et lille antal af de gener var negativt korreleret med CTNNB1 ekspression (figur 3B). Dette er i overensstemmelse med CTNNB1 hovedsagelig fungerer som en transskriptionel aktivator, men også er i stand til at undertrykke ekspressionen af ​​visse gener [30].

A-B

. KS plots viser korrelation mellem CTNNB1 binding og udtryk regulering. De 2794 CTNNB1-bundne gener blev sammenlignet for deres korrelation med udtryk ændringer efter siRNA knockdown af CTNNB1. Gener i microarray blev sorteret efter

s Drømmeholdet værdi (

En

,

s

= 4.4e-16) eller fold forøgelse (

B

,

s

= 0) i hver GSEA

Brug en kombinatoriske kriterier, dvs. nedregulering i microarray analyse med

s

. 0,01 og log forholdet -0,2 efter behandling af både siRNAs og vise CTNNB1 bindende toppe inden for ± 20 kb fra TSS, vi identificeret 162 gener som direkte og funktionelle Wnt mål (tabel S1). Inkluderet i dette mål signatur er kendte mål som

AXIN2, CDX2, ID2, LEF1, LGR6, MSX1, NKD1, NKD2, SP5, TDGF1

og

TNFRSF19

med angivelse af gyldigheden af underskrift. Vi prøver også 10 gener fra listen, og brugte chip-PCR for at bekræfte CTNNB1 binding på de forventede steder (Figur 4A). Brug af en shRNA mod CTNNB1 der er forskellig fra de to siRNAs anvendt i microarray analyse, vi valideret at knockdown af CTNNB1 resulterede i en signifikant nedregulering af de fleste af de testede gener, herunder

FASLG, IL10, LMO2, MPZL2, NOTUM , PPP1R2

og

TREM2

(figur 4B).

A

. Chip-PCR-analyse af de angivne gener ved anvendelse af en selvstændigt udarbejdet kromatin prøve.

LEF1

og

GAPDH

tjene som positive og negative kontroller, hhv.

B

. Kvantitativ RT-PCR af de angivne gener. Gennemsnit ± standardafvigelse for 4 uafhængige eksperimenter er vist.

s

værdier beregnes med to-tailed standard

t-

test. NS: ikke signifikant, *:

s

0,05, og **:

s

0,01

Gene Ontology (GO) sigt berigelse af. Database til Annotation, Visualisering, og integreret Discovery (DAVID) [31] i den 162-target-signatur foreslog vigtige udviklingsmæssige funktioner i Wnt-vejen, herunder embryonale vedhæng morfogenese, hjerte, eller muskel udvikling (tabel S2). GO analyse også afsløret gener involveret i flere signalveje, der tyder på potentielle cross-samtaler mellem Wnt signalering og disse veje. Konkret betydeligt opdaget vej GO vilkår omfatter cytokin signalering (

FASL, BMP7, CXCL4, CXCL6, CXCL14, EDAR, IL10RA, IL10, TNFRSF1B, TNFRSF11B, TNFRSF19

), veje i kræft (

FASL, GLI3 , AXIN2, FGF3, FGF9, FGF19, LEF1, WNT6, WNT11

), eller pindsvin signalvej (

GLI3, BMP7, WNT6, WNT11

) (tabel 2).

GO analyse også identificeret gener, der koder Wnt signalering komponenter CTNNB1 mål og vi genereret en udvidet liste over potentielle feedback-regulatorer (tabel 3).

AXIN2, LEF1, NKD1

NKD2

er blevet beskrevet som negative eller positive tilbagemeldinger regulatorer af vejen [25], [32], [33].

WNT6

WNT11

encode Wnt-ligander, der har potentielle tumorfremmende roller selv i CRC’er med

APC

mutationer [34], og som har kapacitet til at signalere til det stromale komponenter til at modulere tumormikromiljøet [35]. Andre potentielle feedback-regulatorer omfatter

APCDD1

,

NOTUM, PPP1R2

, og

ZNRF3

.

APCDD1

rapporteres at negativt regulere pathway ved ligandreceptorinteraktion trin og dets mutation er ansvarlig for en autosomal dominant hårtab sygdom, arvelig hypotrichosis simplex [36].

NOTUM

koder et secerneret α /β-hydrolase, som er kendt for at antagonisere Wnts ved at frigive glypicans fra celleoverfladen [37].

PPP1R2

genprodukt hæmmer proteinphosphatase 1-kompleks, som regulerer phospholyration status GSK3 [38] og følgelig CTNNB1 nedbrydning [39].

ZNRF3

koder en E3 ubiquitinligase der specifikt fremmer ubiquitinering og nedbrydning af Frizzled receptorer [40], [41]. Som vist ovenfor, har vi bekræftet

NOTUM

og

PPP1R2

at være i god tro mål for CTNNB1. Tilsammen tyder disse data, at Wnt signalering er underlagt komplekse feedback-regler.

Den CTNNB1 mål signatur er beriget i tarm stamceller og CRC’er, men ikke korrelerer med overlevelse CRC patienter

Lgr5

+ tarmcellerne aktivt cykling stamceller og Wnt /CTNNB1 signalvejen spiller en afgørende rolle i deres selv-fornyelse [2]. Vi sammenlignede derfor CTNNB1 target signatur identificeret i denne undersøgelse med en nylig rapporteret gen signatur (et sæt af 510 generne identificeret fra microarray-baserede transskriptionsprofilering og massespektrometrisk proteinprofilering), der er beriget i Lgr5

+ intestinale stamceller [42 ]. En statistisk signifikant overlap (

s

8.9e-07, repræsentation faktor 4,1; sammenligne med tilfældig chance) blev fundet: 17 gener (~ 10%) i CTNNB1 målgenet signatur var også en del af den Lgr5

+ intestinal stamcelle signatur (figur 5A, tabel 4). GSEA på en microarray datasæt fra en EphB2 beriget tarm stamcelle population af humane colon epitelceller (GSE31257) [43] afslørede også berigelsen af ​​vores 162-target-signatur i disse celler [Normaliseret Berigelse Score (NES) = 1,81, FDR

q

-værdi = 0,0; Figur 5B]. Disse data tyder på, at de direkte CTNNB1 målgener i SW480 celler også aktiveres i normale tarm stamceller.

A

. Overlap mellem CTNNB1 målgenet sæt og Lgr5

+ intestinal stamcelle gen sæt.

s Drømmeholdet værdi og repræsentation faktor fremhæve statistisk signifikans i forhold til tilfældig chance. Beregning var baseret på den antagelse, at det samlede antal gener er 20000.

B-C

. GSEA for de 162 gener ved hjælp af sammenlignelige data mellem EphB2

høj human tarm stamcelle og EphB2

lave nonstem cellepopulationer (

B

), eller mellem tyktarmskræft og normale vævsprøver (

C

).

for at sondere relevansen af ​​162-target-signatur i kliniske prøver, vi udførte GSEA på genekspression data fra prøver menneskelig tyktarmskræft (GSE41328) [44] . Denne analyse viste en slående berigelse af CTNNB1 mål signatur i tyktarmskræft prøver sammenlignet med normale colon væv (NES = 2.01, FDR

q

-værdi = 0,0, figur 5C). Vi brugte også en offentligt tilgængelig genekspression datasæt at teste, om den 162-target-signatur kan forudsige resultatet af patienter tyktarmskræft [45]. På trods af den berigelse af signaturen i prøver tyktarmskræft, vi ikke observere nogen signifikant sammenhæng mellem den overordnede udtryk for underskrift og sygdomsfri efter kirurgi overlevelse af patienter med tyktarmskræft (figur 6A). Dette sagt, udtryk for flere af de negative feedback-regulatorer, som vi identificerede i dette arbejde korreleret med en bedre sygdomsfri overlevelse sats. For eksempel patienter med høj gennemsnitlig udtryk for

AXIN2, APCDD1, NKD1, NKD2

, og

NOTUM

viste signifikant længere sygdomsfri overlevelse i forhold til den lave expresser gruppen (figur 6B). Sammen vores resultater viser en berigelse af direkte CTNNB1 målgener i intestinale stamceller og kliniske CRC prøver. Men en signifikant korrelation med prognosen for CRC patienter er begrænset til en udvalgt delmængde af CTNNB1 målgener, nemlig den negative feedback faktorer, snarere end hele target signatur.

I alt 232 patienter blev kategoriseret i høj ( rød) eller lave expressers (blå) baseret på ekspressionen af ​​de 162 gener (

A

) eller fem negativ feedback gener (

AXIN2, APCDD1, NKD1, NKD2, NOTUM) Hotel (

B

).

s

værdier blev beregnet ved log rank analyse.

Diskussion

Vores uvildig screening genom-skala for CTNNB1 målgener kombinerer chip-seq og microarray-analyser giver en vigtig ressource for tyktarmskræft forskning. På trods af den signifikant sammenhæng mellem kromatin binding og genekspression regulering, vores arbejde afdækker et lille antal (162) af gener som direkte, funktionelle CTNNB1 mål i SW480 kolon kræftceller. Dette tal er betydeligt mindre end den for CTNNB1-bundne loci eller CTNNB1-responsive gener, hvilket tyder på, at ikke alle bundne loci er funktionelt udnyttes i SW480 celler til transkriptionel regulering, og at meget af de ændringer i genekspression forekommer som indirekte følger af CTNNB1 udtømning. Vi kunne have gået glip af nogle beskedent regulerede mål ved at kræve genekspression ændring forekomme ved behandling med to forskellige siRNAs og ved hjælp af strenge afskæringsværdier. Nogle af CTNNB1-bundne loci kan reguleres i en kontekst-specifik måde; for eksempel kan gener, der har yderligere lag af regulering som dem til tavshed ved hjælp af DNA methylering eller overvejende styret af andre transkriptionelle /translationelle regulatorer i SW480 celler ikke vise en signifikant fald i transskription på CTNNB1 udtynding. Det er stadig muligt, at sådanne loci reguleres af CTNNB1 i andre cellulære sammenhænge.

Vores validering eksperimenter antyder en 80% succesrate i identifikationen af ​​bona fide CTNNB1 mål ved hjælp af genomisk tilgang. En forskel i knockdown effektivitet blandt si /shRNAs eller off-target effekter af si /shRNAs kan forklare de “falske positiver”. Den CTNNB1 mål underskrift 162 gener præsenterer nogle interessante funktioner. Mest slående er tilstedeværelsen af ​​feedback-regulatorer af vejen. Feedback regulering af Wnt /CTNNB1 vej er blevet veletableret baseret på studier af de enkelte gener [25]. Brug af seriel analyse af kromatin belægning (SACO), har CTNNB1 belægning af bestanddele af den kanoniske Wnt signalvejen blevet opdaget [11]. Vores konklusion om, at Wnt pathway komponenter er overrepræsenteret i CTNNB1 målet signatur tilføjer yderligere beviser til støtte for denne vigtige form for regulering. Notatet vores undersøgelse og SACO undersøgelse [11] afdække stort set distinkte Wnt pathway gener som CTNNB1 mål: ud af de 15 gener, der blev identificeret i SACO undersøgelsen, kun 2 gener (

AXIN2

og

WNT11

) blev fundet i vores liste over 10 Wnt pathway-gener (tabel 2). Desuden når man sammenligner med en anden CTTNB1 chip-seq undersøgelse, der brugte HCT116 celler [12], blev fundet en overlapning på 161 CTNNB1-bundne gener mellem de 988 gener er identificeret i denne undersøgelse, og de 2794 gener identificeret i aktuelle undersøgelse. Selvom overlapningen er statistisk signifikant (

s

4.8e-07), et betydeligt antal målgener var specifik for hver undersøgelse. Dette kan til dels skyldes en forskel i parameter indstilling eller potentielle lyde i analysen, men kunne også afspejle en reel forskel i CTNNB1 funktion mellem CRC cellelinjer (HCT116 vs. SW480), der anvendes i de to undersøgelser. Faktisk en forskel i DNA methyleringsmønstre af Wnt målgener mellem HCT116 og SW620, en lymfeknude metastatisk variant af SW480, er blevet rapporteret [46]. Som sådan, vores arbejde afslører nye facetter af feedback regulering af Wnt /CTNNB1 signalering. Fin-tuning Wnt signalering output af flere feedback-mekanismer kan være vigtigt for den præcise Spatiotemporal regulering af dens aktivitet under væv mønster og vedligeholdelse af væv homeostase. Desuden kan fejl i disse ordninger bidrager til patologiske tilstande som kræft [47].

Selv for et relativt lille antal gener i 162-target-signatur, de relaterede funktionelt synes udefineret og forskelligartet. Dette er i overensstemmelse med de divergerende biologiske virkninger af Wnt /CTNNB1 signalering [2]. Signaturen indeholder en række transkriptionelle regulatorer (tabel S1), implicerer eksistensen af ​​sekundære /indirekte transkriptionelle mål. Identifikationen af ​​direkte CTNNB1 /TCF mål ved andre [11] – [14], og dette arbejde giver en ramme for at dissekere de relative bidrag af direkte og indirekte målgener til de biologiske virkninger af vejen

Det er. almindeligt anerkendt, at deregulering af Wnt /CTNNB1 vej er en central initiering trin af intestinal tumorigenese [48]. Denne deregulering menes at opstå i den intestinale stamcellepopulation at brændstoffer tumorvækst [5], [6]. I overensstemmelse med dette begreb, vi fandt CTNNB1 mål signatur er betydeligt beriget i isolerede tarm stamceller samt i kliniske CRC prøver. Men vi ikke oplever en betydelig korrelation mellem ekspressionen af ​​målet underskrift og prognosen for CRC patienter. Dette er interessant i betragtning af at forhøjet ekspression af en intestinal stamcelle signatur forudsiger dårlig prognose af CRC patienter [46], [49], og at dereguleringen af ​​Wnt-vejen har været kendt som et kendetegn for CRC [50]. Det forhold, at CTNNB1 målrette signatur omfatter en række feedback-faktorer kan komplicere scenariet. For eksempel kan undertrykkelse af den negative feedback regulatorer tænde den onkogene Wnt signalering aktivitet i cancerceller, men da disse tilbagemeldinger faktorer selv er Wnt mål, kan den samlede Wnt målgenekspression mønster synes ikke at korrelere med prognose. Faktisk silencing af Wnt målgener ved promotor-methylering er blevet bemærket i CRCs med dårlig prognose [46]. Vores resultater viser, at ekspressionen af ​​udvalgte negativ feedback faktorer fra vores gen listen faktisk korrelerer positivt med overlevelsen af ​​CRC patienter (figur 6B). I sådanne tilfælde, hvor den negative feedback regulatorer af reaktionsvejen er tavse, kan den gennemsnitlige målgenekspression ikke afspejler den faktiske signalering aktiviteten af ​​vejen. Således er den aktuelle undersøgelse og andre [46] tyder på, at grundige overvejelser af de komplekse regler og kontekst afhængighed er berettiget vedrørende den kliniske anvendelighed af forskellige Wnt target gen-apparater, der er opstået i litteraturen. Vores undersøgelse bidrager til et samlet overblik over Wnt signalering regulering i CRC’er, der er blevet undersøgt i årtier, men endnu ikke fuldt forstået.

Konklusion

Vores data giver et genom-dækkende billede af gen regulering af Wnt /CTNNB1 signalering i CRCs. Målgenet analyse afslørede flere lag af feedback regulering af Wnt /CTNNB1 pathway. Den CTNNB1 direkte målgen signatur var stærkt udtrykt i tarm stamceller populationer og kræftceller, men viste ikke signifikant sammenhæng med overlevelse CRC patienter. Denne undersøgelse giver en vigtig ressource til at forstå de komplekse og divergerende funktioner Wnt /CTNNB1 vej.

Metoder

Cell kultur

SW480 celler blev opnået fra ATCC og vedligeholdes i Dulbeccos modificerede eagle medium suppleret med 10% føtalt bovint serum.

chromatin immunoprecipitation (chip) og høj-throughput sekventering

chip blev udført ifølge protokollen fra Millipore med visse modifikationer. SW480-celler blev tværbundet først med en cocktail af protein-protein tværbindingsmidler [0,67 mM disuccinimidyl sulfat (DSS), 0,67 mM disuccinimidylglutarat (DSG), og 0,67 mM ethylen glycolbis (succinimidylsuccinate) (EGS)] [20] i 45 minutter ved stuetemperatur, og derefter i 0,75% formaldehyd i 10 minutter ved 37 ° C. Efter vask blev kromatin forskudt i ~100-300-bp fragmenter ved anvendelse af en Bioruptor (Diagenode Inc.). Lysater blev for-klaret med Dynabeads protein A (Invitrogen) i en time ved 4 ° C, og små portioner af den udvundne supernatant blev udsat for omvendt tværbinding og oprensning af DNA (som input prøver). Input prøver blev anvendt til at måle koncentrationen af ​​kromatin DNA og immunfældning blev udført med 25 ug DNA-holdigt chromatin ved 4 ° C natten over med kontrol-IgG (Santa Cruz Biotechnology, sc-2027) eller anti-CTNNB1 antistof (Santa Cruz Biotechnology, sc-7199). Immuno-komplekser blev derefter renset med Dynabeads protein A og revers tværbundet ved inkubering med 200 mM NaCl ved 65 ° C i 5 timer. Efter proteinase K-behandling i 1 time blev ChIP DNA udvundet ved anvendelse af QIAquick PCR oprensningskit (Qiagen, 28104). Bibliotek generation blev udført ved hjælp af samleprøver chip DNA-prøver fra fire uafhængige chip præparater ved anvendelse af Illumina-protokollen. Kort fortalt blev ChIP DNA-fragment ender repareres og phosphoryleret under anvendelse af Klenow, T4 DNA-polymerase og T4-polynukleotidkinase (Illumina kitkomponenter). Efter ligering af Illumina adaptere, DNA størrelse valgt af geloprensning og derefter PCR-amplificeret under anvendelse Illumina primere. Sekventering blev udført på Ambry Genetik på en Illumina Genome Analyzer IIx, én vognbane per prøve, 36-bp singleton sekventering.

validering blev udført ved hjælp af chip-PCR med primere, der er anført i tabel S3.

microarray analyse

analysen blev offentliggjort tidligere [27], og eksperimentelle detaljer er som følger. To-farve microarray blev udført i dubletter for SW480 celler transficeret med kontrol (siRNA mod luciferasegenet) og to uafhængige siRNA’er mod CTNNB1 (CTNNB1 # 1 fremad, CUAUCUGUCUGCUCUAGUATT, reverse, UACUAGAGCAGACAGAUAGTT, CTNNB1 # 2 frem, CUGUUGGAUUGAUUCGAAATT, reverse, UUUCGAAUCAAUCCAACAGTT), henholdsvis. Fireogtyve timer efter transfektion blev RNA ekstraheret fra celler under anvendelse af RNeasy kittet (Qiagen, Valencia, CA). cDNA blev syntetiseret med Cy3 (kontrol) og Cy5 (CTNNB1 siRNA) mærkning, ved anvendelse af en tilpasset automatiseret version af aminoallyl MessageAmp II kit (Life Technologies). Mærkede prøver blev hybridiseret med Rosetta /Merck Humant 44k 1,1 microarray (GPL4372) ved inkubering ved 40 ° C i 48 timer i en roterende karrusel. Efter vask for at fjerne ikke-specifikke hybridiserede prøver blev mikroarrays tørret i en ozon-fri nitrogen kammer. Mikroarrays blev scannet ved hjælp af Agilent LP2 laserscanner. Scanneren output er en TIFF-fil, der indeholder kvantitative hybridisering data fra hver enkelt microarray. TIFF filer blev derefter behandlet ved hjælp af Rosetta tilpasset funktion udvinding software, som udfører fejl modellering. Data blev derefter behandlet i den Rosetta Resolver® systemet, som udfører en squeeze operation, der kombinerer replikater af den samme sekvens i et array, mens anvendelse fejl vægtning. Fejlen vægtning bestod af justering for additiv og multiplikativ støj.