PLoS ONE: CBL Er Ofte Altered i lungekræft: dens forhold til mutationer i MET og EGFR tyrosinkinaser

Abstrakt

Baggrund

Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er en heterogen gruppe af sygdomme med en række genetiske og proteom ændringer. c-CBL er en E3 ubiquitin ligase og adaptormolekyle vigtigt i normal homeostase og cancer. Vi bestemt de genetiske variationer af c-

CBL

, forhold til receptortyrosinkinaser (EGFR og MET), og funktionalitet i NSCLC.

Metoder og Resultater

Brug arkivering formalin -Fast paraffin indstøbt (FFPE) udvindes genomisk DNA, viser vi, at c-CBL mutationer forekommer i somatisk mode for lungekræft. c-CBL mutationer var ikke gensidigt udelukkende af markedsøkonomisk eller EGFR-mutationer; men de var uafhængige af p53 og KRAS-mutationer. I normal /tumor parvis analyse, der var betydeligt tab af heterozygositet (LOH) til c-

CBL

locus (22%, n = 8/37), og ingen af ​​disse prøver afsløret nogen mutation i den resterende kopi af c-CBL. Den c-

CBL

LOH også positivt korreleret med EGFR og MET mutationer observeret i de samme prøver. Brug vælge c-CBL somatiske mutationer såsom S80N /H94Y, Q249E og W802 * (fås fra kaukasisk, taiwanske og afrikansk-amerikanske prøver henholdsvis) transficeret i NSCLC cellelinjer, blev der øget cellernes levedygtighed og celle motilitet.

konklusioner

på hele mutationsgrad af c-CBL at være en kombination som somatisk missense mutation og LOH, er det klart, at c-CBL er stærkt muteret i lungecancere og kan spille en væsentlig rolle i lunge tumorgenese og metastase

Henvisning:. Tan Y-HC, Krishnaswamy S, Nandi S, Kanteti R, Vora S, onel K, et al. (2010) CBL ofte Altered i lungekræft: dens forhold til mutationer i MET og EGFR tyrosinkinaser. PLoS ONE 5 (1): e8972. doi: 10,1371 /journal.pone.0008972

Redaktør: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center, USA

Modtaget: 28 oktober, 2009; Accepteret: 9. januar 2010; Udgivet: 29 januar, 2010

Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Public Domain erklæring hvori det hedder, at når det først er i det offentlige rum, dette arbejde kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål

Finansiering:. Støttet af National Institutes of Health (NIH) /National Cancer Institute (NCI) Tilskud: 5RO1CA125541-03, 3RO1CA125541-03S109 , 5RO1CA129501-02, 3RO1CA129501-02S109, 1R21CA140003-01, MARF, V-Fonden, Cancer Research Foundation og amerikanske Respiratory Health Association of America (RS) og tildele NSC96-2628-B-006-048-MY3 fra National Science Rådet , Taiwan. Denne forskning blev støttet af Intramural Research Program for NIH, National Cancer Institute, Center for Cancer Research. De finansieringsordninger agenices havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i USA alene, cirka hvert år 219,400 mennesker er diagnosticeret med lungekræft, hvoraf mere end 145.000 af dem bukker under for sygdommen [1]. Dette nummer svarer nogenlunde til de kombinerede dødelighed af kræft i bryst, prostata, colon, lever, nyre og melanom [1]. Desuden er prognosen normalt fattige og de fem-års overlevelse er mindre end 15%. Der er også betydelige etniske forskelle for lungekræft, og resultatet er værre for sorte i forhold til hvide. Kønsforskelle er også slående med kvinder, der har signifikant bedre prognose i forhold til mænd. Der er en række genetiske ændringer, der kan forekomme i lungekræft. Som et eksempel, i NSCLC, mutationer i KRAS, p53, EGFR og MET er blevet identificeret. Mange af disse veje, især receptortyrosinkinaser (RTK’er) er styret af c-CBL.

CBL

(Casitas B-slægt lymfom) er en mammal gen lokaliseret på humant kromosom 11q23.3 [2] og er involveret i cellesignalering og protein ubiquitinering [3]. CBL proteiner tilhører RING finger klasse af ubiquitin ligaser (E3), og der er tre homologer

c-CBL

,

CBL-b

,

CBL-3

[4 ].

c-CBL

CBL-b

gener allestedsnærværende udtrykkes med de højeste niveauer i hæmatopoietiske væv [5].

c

-CBL består af fire regioner, der koder for funktionelt forskellige proteindomæner: det N-terminale tyrosin kinase binding (TKB) domæne, linker-regionen, det katalytiske RING finger domæne, den prolinrige region og c terminal ubiquitin-associeret (UBA) domæne, som også overlapper med en leucin-zipper (LZ) domæne [3]. Både TKB og ringfinger domæner er afgørende for ligand-induceret ubiquitinering af RTK’er [6], [7], [8], [9]. Ringfingeren domæne er nødvendig for ansættelse af E2 ubiquitin-konjugering enzymer. Den TKB domæne indbefatter fire-helix bundt (4H), en calcium-biding EF hand, og en modificeret SH2-domænet, som binder til phosphotyrosinrester [3], [10], [11], [12]. Desuden kan den prolinrige region af c-CBL associere med SH3-domænet af Grb2, der indirekte kan rekruttere c-CBL til RTK’er via Grb2 adapter protein [7], [13], [14].

c-CBL også binder til EGFR og fungerer som E3, som målretter EGFR for ubiquitinering og nedbrydning. Desuden CBL desensibiliserer EGF signalering og er imod cellulær proliferation induceret af EGF [15]. aktivering EGF synes også at aktivere tyrosinkinaseaktivitet SRC, som phosphorylerer c-CBL og igen aktiverer ubiquitinering og nedbrydning af EGFR [16], [17], [18]. En nylig undersøgelse viser, at defekte endocytose af EGFR er kendetegnet ved en deletionsmutant og punktmutationen L858R, hvorved dens association med c-CBL og efterfølgende ubiquitinering forringes [19]. For nylig blev der rapporteret de første menneskelige c-CBL mutationer i akut myeloid leukæmi (AML) patienter [20]. Mutationen R420Q inhiberer FMS-lignende tyrosinkinase 3 (FLT3) internalisering og ubiquitinering [20].

Ikke alene kan E3-aktivitet være vigtig i onkogenese, c-CBL har en dobbelt men separat funktion som en signaloverføringsmolekyle . Vi har tidligere vist, at c-CBL er vigtig i binding CRKL og BCR /ABL i hæmatopoietiske celler. Ligeledes kan det binde og modulerer funktioner af cytoskelet ved at binde til proteiner, såsom talin og paxillin. Den TKB domæne er vigtig i binding til et antal molekyler, og de derefter fungere i signaltransduktion.

I betragtning af den kritiske rolle CBL i normal homeostase og cancer, vi antager, at det kan være muteret i lungecancere. I denne undersøgelse, rapporterer vi nye c-CBL somatiske mutationer S80N /H94Y, Q249E og W802 * hos kaukasiske, taiwanske og afroamerikanske lungekræftpatienter, hhv. Udtrykke disse mutationer i NSCLC cellelinjer føre til øget spredning og celle motilitet. Vi viser, at c-CBL mutationer forekommer med eller uden markedsøkonomisk eller EGFR-mutationer, men er gensidigt udelukkende af et LOH på c-

CBL

locus. Derudover c-

CBL

LOH er forbundet med enten markedsøkonomisk behandling eller EGFR mutationer. Vi derfor hypotesen, at c-CBL-mutationer kunne bidrage til den onkogene potentiale MET og EGFR i lungekræft.

Metoder

Etik Statement

Skriftligt samtykke på al forskning på menneskelige emner er blevet opnået fra Institutional Review Board, University of Chicago og dækker al forskning udført i laboratoriet. Følgende er deres kontaktoplysninger: Institutional Review Board, The University of Chicago, McGiffert Hall, 5751 S. Woodlawn Ave., 2. sal, Chicago, IL 60637. skriftlige informerede samtykke blev modtaget fra alle patienter, hvis væv prøver blev anvendt til denne undersøgelse .

vævsprøver

Lungekræft væv og parrede tilstødende normale lungevæv blev opnået fra 50 kaukasiske, 29 afrikansk-amerikanere og 40 taiwanske NSCLC patienter, der blev rekrutteret på University of Chicago Hospital (Chicago , USA) (kaukasiske og patienter afrikansk-amerikanske) og Taipei Veterans General Hospital i Taiwan (taiwanske patienter) efter at have opnået passende Institutional Review Board tilladelse og informeret samtykke fra patienterne. Ud af 119 prøver, 77 var mænd, 38 kvinder og fire var ukendt med alderen ved diagnose spænder fra 47 til 90 år. I form af tumortyper, 53 var adenocarcinom, 32 var pladecellekræft og 34 var store celle karcinom. 49 blev fase I, 14 var fase II, 34 var fase III, og 13 var stadie IV (tabel S1).

Cell Culture

Menneskelig ikke-småcellet lungekræft celler A549 og H358 blev opretholdt i DMEM og RPMI-1640 hhv. Humane embryonale nyre 293T-celler blev dyrket i DMEM. Medier blev suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Celler blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig inkubator indeholdende 5% CO

2.

c-

CBL

Gene mutationsanalyse

exon 2 til 16 i C –

CBL

genet blev individuelt amplificeret ved polymerasekædereaktion (PCR). Primere er listet i tabel S2. PCR-betingelserne var 1 cyklus ved 95 ° C i 5 minutter; 35 cykler ved 94 ° C i 30 sekunder, 58 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 2 minutter; og en cyklus af 72 ° C i 10 minutter. PCR-produkter blev behandlet med ExoSAP-IT (USB Corporation, Cleveland, OH) og sekventeret ved Big-Dye Terminator kemi (Applied Biosystems, Foster City, CA). Sekventering blev udført på frem kodende streng med bekræftelse af

c-CBL

ændringer udført ved sekventering af revers streng samt. Chromatogrammer blev analyseret for mutationer ved hjælp Mutation Surveyor v2.61 (Softgenetics, State College, PA).

plasmidkonstrukter og mutagenese

vildtype c-

CBL

cDNA insert blev subklonet i pAlterMax ekspressionsvektor under anvendelse

Xho

i og

Sal

i restriktionsenzymsites (Promega, Madison, WI). Ved hjælp af denne forældrenes plasmid pAlterMax-c-

CBL

, at TKB domænet dobbelt mutation (S80N /H94Y), det punkt mutation (Q249E), og C-terminale punktmutation W802 * af c-

CBL

blev skabt ved anvendelse af følgende primere: 5′-GCTGGCGCTAAAGAATAACCCACCTTATATCTTAGAC-3 ‘og 5′-CTACCAGATACCTACCAGTATCTCCGTACTATCTTGTC-3′ for det dobbelte mutation S80N /H94Y; 5’-CTTTACCCGACTCTTTGAGCCCTGGTCCTCTTTGC-3 ‘for Q249E, og 5′-CAGCTCCTCCTTTGGCTGATTGTCTCTGGATGGTGATC-3’ for W802 * sammen med deres komplementære primere under anvendelse af QuickChange steddirigeret mutagenese XL kit (Stratagene, La Jolla, CA) ifølge producentens instruktioner. Konstruktionerne blev bekræftet for punktmutationer ved standard DNA-sekventering af begge strenge.

Tab af heterozygositet (LOH) Analyse

Fem mikrosatellitter på kromosom 11 (3 på 11q på eller inden for 200 kb op eller nedstrøms for c-

CBL

gen og 2 kontrolpunkter markører på 11 p) blev udvalgt til analyse (tabel S3). Etablerede mikrosatellitmarkører og respektive primersekvenser blev udvalgt fra GeneLoc databasen (https://genecards.weizmann.ac.il/geneloc/index.shtml, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel). Primere blev special designet og hver fremadrettet primer blev fluorescensmærket ved 5 ‘enden med FAM, PET, NED, eller VIC (Applied Biosystems). Primerannealing temperaturer og duplex scoringer blev vurderet med NIST Primer Tools (https://yellow.nist.gov:8444/dnaAnalysis/primerToolsPage.do; Nationale Institut for Standarder og Teknologi, Gaithersburg, MD). Primere blev verificeret ved udførelse af PCR med kontrol-DNA (isoleret fra TK6 celler) og løse produkterne på agarosegeler. Bånd blev visualiseret med en UV-transilluminator. Genomisk DNA blev ekstraheret fra tumorprøver og parret normalt lungevæv. Primere blev grupperet i multiplex kombinationer vist i tabel S4. Marker D11S929 tjente som en intern kontrol for at tjekke for konsistens i PCR’er og toppe fra kapillarelektroforese. Multiplex PCR’er blev udført i et volumen på 10 pi, der indeholdt 1 pi genomisk DNA (20-50 ng), 0,5 uM af hver primer (1,0 uM total for hvert primerpar), 400 uM dNTP’er, 1 x PCR-buffer indeholdende MgCl

2, og 0,2 U

Taq

DNA-polymerase. PCR blev udført på ABI GeneAmp 9700 PCR System under følgende betingelser: 5 minutter ved 94 ° C; 30 cykler af 30 sekunder ved 94 ° C, 1 min ved 60 ° C, 1 min ved 72 ° C; og 5 min ved 72 ° C. PCR-produkterne blev separeret ved kapillarelektroforese på en ABI 3130XL DNA Analyzer. Chromatogrammer blev analyseret med Peak Scanner 1.0 og GeneMapper 3.7 software (Applied Biosystems) for allele ændringer. Arealet af toppene produceres af DNA PCR-produkter blev kvantificeret for hver allel. Forholdet mellem allele områder blev beregnet for hver tumor og parret normalt DNA prøve. Når qLOH (allele ratio for tumor toppe divideret med allele forholdet mellem parrede normale prøve) blev ≤0.5 eller ≥2.0 for c-

CBL

og mindst én anden 11q markør i mindst to separate forsøg, prøven blev betragtet som havende en allel ubalance og fortolkes LOH. Prøverne blev evalueret i mindst to separate eksperimenter og prøver viser prospektiv LOH på c-

CBL

gentaget en tredje gang som omfattede en ny kontrol markør på

BAX

locus (data ikke vist) på kromosom 19 for at kontrollere integriteten af ​​prøve-DNA.

Transfektion af c-

Cbl

konstruktioner

A549-cellelinje blev transficeret ved hjælp af Fugene HD (Roche, Nutley, NJ) reagens ifølge producentens anvisninger. Otte ug plasmid DNA, der indeholder enten ingen indsatsen (tom vektor), vildtype c-

CBL

, S80N /H94Y c-

CBL,

Q249E c-

CBL

eller W802 *

CBL

blev anvendt til transfektion i en 6-brønds dyrkningsplade. Celler blev høstet 48 timer efter transfektion og analyseret for ekspression.

c-

CBL

Knockdown

c-

CBL

knockdown blev udført ved hjælp af lentiviral transduktion hjælp MISSION lentiviral transduktion partikler (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i henhold til producentens instruktioner. Kort fortalt, 1 x 10

5 H358 celler /brønd blev podet i plader med 6 brønde og inficeret den følgende dag med c-

CBL

lentiviral shRNA konstruktioner. For at generere stabile c-CBL knockdown cellelinier blev celler udvalgt i 2 dage med 1 pg /ml puromycin. c-CBL-niveauer blev bestemt ved anvendelse af hele cellelysater ved immunoblotting med anti-CBL-antistof (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA).

cellelevedygtighed Assay Salg

Celler blev transficeret som beskrevet ovenfor i transfektionsassayet. Otteogfyrre timer efter transfektion blev levedygtigheden af ​​celler vurderet ved anvendelse trypanblåt udelukkelse.

sårheling Assay Salg

A549-celler blev podet i plader med 6 brønde og dyrket i 48 timer indtil 100% konfluente . Mediet blev derefter ændret, og cellerne blev transficeret som beskrevet i transfektionsassayet. Tolv timer efter transfektion blev en lige ridse lavet på tværs af cellelaget anvendelse af en 1 ml pipettespids. Cellerne blev derefter forsigtigt vasket med 1 × PBS for at fjerne cellerester og medierne blev udskiftet. Fotografier blev taget af såret region hver 12 h indtil 48 h.

Western blot-analyse

Otteogfyrre timer efter transfektion blev cellerne opsamlet og vasket to gange i 1X PBS, lyseres derefter i is- kold lysepuffer (0,5 M Tris-HCI med pH 7,4, 1,5 M NaCl, 2,5% deoxycholsyre, 10 mM EDTA, 10% NP-40, 0,5 mM DTT, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid, 5 ug /ml leupeptin, og 10 ug /ml aprotinin) i 5 minutter. Lysatet blev centrifugeret ved 13.000 rpm i 20 minutter ved 4 ° C, og proteinindholdet af supernatanten blev målt. Totale cellelysater (50 ug /brønd) blev separeret ved SDS-PAGE elektroforese og gelerne overført til nitrocellulosemembraner (Whatman, Piscataway, NJ). Membraner blev blokeret med 5% fedtfri tørmælk i phosphatpufret saltvand indeholdende Tween-20 (PBST) (1X PBS, 0,1% Tween-20) i 1 time ved stuetemperatur og inkuberet med det passende primære antistof ved 4 ° C natten over. Membraner blev derefter vasket tre gange med PBST og probet med passende peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur. Membranerne blev igen vasket tre gange i PBST, og bånd blev visualiseret under anvendelse af Western blot kemiluminescens-reagens (BioRad, Valencia, CA) på en Chemidoc Gel dokumentationssystem (BioRad, Valencia, CA). Antistoffer blev opnået fra Santa Cruz Biotechnologies og bruges på følgende fortyndinger (c-CBL, 1:5000 c-MET, 1:5000, EGFR, 1:5000, ubiquitin, 1:1000 HA, 1:5000 og p- actin, 1:10,000).

flowcytometri

Cell cyklus analyse blev udført ved flowcytometri. Ca. 2 × 10

6 celler blev dyrket i medier, der indeholdt 10% FBS. Cellerne blev høstet ved trypsin /EDTA-behandling, vasket med 1X PBS tre gange og fikseret med iskold 70% ethanol i 2 timer. Celler blev vasket igen med kold PBS og farvet med en opløsning indeholdende 25 ug /ml propidiumiodid, 200 ug /ml RNase A, og 0,1% Triton X-100 i 30 minutter i mørke. Cellecyklusanalyse blev udført under anvendelse af en Guava PCA-96 flowcytometer (Guava Technologies, Millipore, Billerica, MA).

ubiquitinligaseaktivitet

293T-celler blev holdt i kultur i DMEM suppleret med 10 % FBS og 1% penicillin (100 enheder /ml) og streptomycin (100 ug /ml) blev transficeret med 0,2 ug EGFR-pcDNA3 og 2 ug HA-mærkede c-

CBL

konstruktioner som angivet ved hjælp af calciumphosphat ifølge med producentens protokol (profection, Promega, Madison, WI). Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne udsultet natten over i DMEM suppleret med 0,5% FBS, og derefter behandlet med eller uden EGF (100 ng /ml) i 15 min. Cellerne blev opsamlet og vasket to gange i iskold PBS indeholdende 0,2 mM natriumorthovanadat derefter lyseret i iskold lyseringspuffer (10 mM Tris HCI, pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X100, 10% Glycerol, 2 mM natriumorthovanadat og proteasehæmmere). Lysater blev renset for rester ved centrifugering ved 16.000 g i 10 minutter ved 4 ° C. EGFR immunopræcipitationer blev udført på 200 ug af klaret lysat under anvendelse 250 ng kanin-anti-EGFR og protein A /G Plus Sepharose natten over ved 4 ° C. Udfældninger blev vasket 5 gange i lysisbuffer før kogning i Laemmli buffer. Elueringer blev immunblottet med anti-ubiquitin og EGFR. Tyve mikrogram af klaret lysat blev immunoblottedes for hver af c-

CBL

konstrukter ved anvendelse af anti-HA.

Statistical Analysis

mutationsrater mellem forskellige grupper blev sammenlignet ved anvendelse af Fishers eksakte prøve. For kontinuerlige variabler blev gruppesammenligninger udført ved anvendelse af variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Sidak tilpasning for multiple sammenligninger. Forsøg med gentagne målinger over tid blev analyseret ved hjælp af gentagne målinger ANOVA med Greenhouse-Geisser tilpasning til frihedsgrader. Analyser blev udført ved hjælp af STATA (v10.1) software (Stata Corporation, College Station, TX).

Resultater

c-

CBL

genmutationer i lungekræft

for at undersøge betydningen af ​​c-

CBL

i lungekræft, vi analyserede sin genomisk DNA i tumor og parrede normale prøver trukket fra flere etniske grupper. De lunge tumor prøver repræsenterede kaukasere (n = 50), afrikansk-amerikanere (n = 29), og taiwanske (n = 40) lungekræftpatienter. Vi designede 12 par primere til at sekventere den kodende region af c-

CBL

gen, der spænder over exonerne 2 til 16 (Tabel S2). Vi identificerede 8 unikke somatiske mutationer i c-

CBL exoner

blandt 8 forskellige patienter. En variation L620F, en kendt SNP (rs2227988) i exon 11 blev også påvist. Vigtigt er det, blev de otte hidtil ukendte ikke-synonyme mutationer bekræftet ved sekventering begge strenge af c-

CBL

genomisk DNA opnået fra lunge tumorprøver (tabel 1). Desuden er ingen af ​​de 8 mutationer blev påvist i den tilsvarende normale væv, hvilket indikerer, at disse var somatiske mutationer. Fire synonyme enkelt nukleotid variationer (SNVs) blev også identificeret, men blev ikke brugt yderligere i denne undersøgelse.

Tre af de 8 nye ikke-synonyme mutationer blev placeret i TKB (tyrosin kinase bindende) domæne ( S80N, H94Y, og Q249E), en i RING finger domænet (V391I), en i prolinrige region (72515_72517 del ATG), og tre i den C-terminale region (W802 *, R830K, og A848T) af c-CBL-proteinet (figur 1A og figur S1). I figur 1B viser vi model kromatogrammer af repræsentative prøver.

(A) Skematisk illustration af de forskellige c-CBL-mutanter med hensyn til de forskellige funktionelle domæner. Tre mutationer: S80N, H94Y blev Q249E placeret på TKB område; V391I var placeret på ringfingeren domæne; 72515_72517 del ATG (et ikke-rammeskift deletion) og L620F (en kendt SNP, rs2227988) blev placeret på Pro-rige region og W802 *, R830K, og A848T blev fundet i den C-terminale region af c-CBL. De viste tal repræsenterer aminosyrepositioner. Foreningen af ​​c-CBL mutationer blandt forskellige etniske befolkningsgrupper er vist i tabellen (∧ kendt SNP). (B) Repræsentative eksempler på sekventering kromatogrammer af mutationen region i normal (N) og tumor (T) prøver. Pilene angiver heterozygot mutation i tumorprøven. (C) Tab af heterozygositet (LOH) analyse af 37 tumor og parrede normale prøver fra taiwanske patienter. En værdi på 0,5 indikerer en LOH på c-

CBL

locus. (D) Skematisk af kromosom 11 markører valgt til LOH analyse og repræsentative eksempler på LOH kromatogram analyse. Efter forstærkning ved hjælp kromosom 11 specifikke mikrosatellitmarkørerne primere, blev PCR-produktet adskilt af kapillarelektroforese og bånd blev kvantificeret i henhold til intensitet.

11q LOH af c-

CBL

Gene

Forbundne lungetumor og normale lunge vævsprøver fra taiwanske patienter (n = 37) blev undersøgt for LOH. Otte (21,6%) viste LOH ved C-

CBL

locus på kromosom 11, medens 29 prøver (78,4%) afslørede normale allel bidrag på mikrosatellitmarkører (figurerne 1C og D).

c-CBL Mutationer i forskellige etniske grupper

c-CBL dobbelt mutant S80N /H94Y blev fundet i den samme patient og den samlede mutation sats for c-CBL i lungetumorer var 6,7% (8/119). Hyppigheden af ​​c-CBL mutation var højest i storcellet carcinom (14,7%; 5 ud af 34 patienter) efterfulgt af pladecarcinom (6,3%; 2 af 32 patienter) og blev observeret mindst i adenocarcinom (AD) (1,8%; 1 af 53 patienter), selv om disse satser ikke var statistisk signifikant (p = 0,292). Mutation satser var 6,0% blandt kaukasere (0 af 20 i AD; 0 af 10 i SQ og 3 af 20 i LC), 13,8% i afrikansk-amerikanere (1 af 10 i AD, 1 af 10 i SQ, og 2 af 9 i LC), og 2,5% (0 af 23 i AD, 1 af 12 i SQ og 0 af 5 i LC) i den taiwanske befolkning. Derudover to patienter taiwanske med lungekræft (én skvamøs og én adenocarcinom) havde den kendte SNP L620F. Etniske forskelle var ikke statistisk signifikante, men magt til at påvise forskelle var lav.

Mutationer i

MET

og

EGFR

kan co-associeret med c-CBL Ændringer

Da østasiater med lungekræft har en højere frekvens af

EGFR

MET

mutationer i lungetumorer [21], [22], har vi også bestemt mutationer i

EGFR

MET

i de samme taiwanske kohorte prøver og sammenlignet resultaterne med den observerede c-

CBL

ændringer (LOH og /eller mutationer). I de 37 testede prøver, vi fandt ikke nogen overlapning mellem c-

CBL

mutationer og c-

CBL

LOH (figur 2). Af de tre c-CBL mutanter (herunder den kendte L620F SNP, rs2227988), en af ​​prøverne havde en MET mutation (N375S) og den anden havde en EGFR mutation (L858R). Blandt de 8 prøver, der havde en LOH på c-

CBL

locus 5 havde en yderligere mutation i MET (N375S) og 2 havde en

EGFR

exon 19 sletning. Tyve-seks prøver havde hverken c-

CBL

mutation eller c-

CBL

LOH (3 patienter havde en c-

CBL

mutation, men ingen c-

CBL

LOH). Blandt disse 26 prøver 9 havde en MET-mutation (8 N375S, en L211W), 13 havde en

EGFR

mutation (7 exon 9 sletning, 6 L858R) og 4 havde ingen anden MET eller EGFR mutation. Således hastigheden af ​​markedsøkonomisk eller EGFR-mutationer blandt patienter med LOH på c-

CBL

locus (7 af 8) svarede til den, der ses hos patienter uden c-

CBL

mutation eller LOH ( 22 af 26 patienter) (p = 0,99). Disse 4 patienter uden identificerbare mutation i c-

CBL

,

MET

eller

EGFR

repræsenterede 10,8% af de 37 patienter, der er analyseret i den taiwanske patient kohorte. Omvendt 89,2% taiwanske lungekræftpatienter har en identificerbar mutation i enten c-

CBL

,

MET

eller

EGFR

eller en kombination af de tre gener (figur 2) . Desuden har vi bestemt

p53

og

KRAS

mutationer i disse taiwanske kohorter. To

p53

og en

KRAS

mutation blev opdaget. Det indre

KRAS

mutation overlappede med en

p53

mutation. Denne patient havde også den

EGFR

exon 19 sletning, men havde ingen c-

CBL

mutation. Den anden

p53

mutation prøve havde en c-

CBL

LOH med samtidig MET N375S mutation. Således i de taiwanske analyserede prøver,

p53 /KRAS

mutationer og c-

CBL

mutationer var gensidigt udelukkende (data ikke vist).

37 taiwanske prøver blev analyseret for mutationer i c-

CBL

,

MET

og

EGFR

til LOH analyse i c-

CBL

locus. Dataene viser 21,6% (8/37) havde LOH, mens 8% (3/37) havde en c-CBL-mutation (herunder kendte SNP L620F), disse prøver var gensidigt udelukker hinanden. Derudover 5 af 8 LOH prøver også havde mødt N375S mutation og 2 havde

EGFR

exon 19 sletning. I prøverne med c-

CBL

mutation, en også havde mødt N375S mutation, mens en anden havde EGFR L858R mutation. I prøver, der ikke huser nogen c-

CBL

mutation (70%, 26/37), 22 havde enten en

MET

eller

EGFR

mutation og kun 4 ikke havde en mutation i nogen af ​​disse 3 gener.

Cellular funktioner c-

CBL

Ændringer i Baggrunden for Lung tumorigenese

a. E3-aktivitet er intakt i de mutante c-CBL-proteiner.

For at undersøge om de forskellige c-CBL mutationer påvirker E3-aktivitet, blev EGFR valgt som en model substrat for c-CBL E3 funktion. Alle de c-CBL mutanter testet forøget ubiquitinering af det aktiverede EGFR ligner vildtype-c-CBL-protein. Dette resultat viser, at den katalytiske aktivitet af c-CBL-mutanter ikke forringes, når EGFR var substratet. (Figur 3A).

(A) c-CBL mutanter ikke ændrer ubiquitinering af EGFR. Celler blev co-transficeret med EGFR og forskellige c-CBL mutanter blev stimuleret med EGF, immunpræcipiteret med anti-EGFR-antistof og blottet med anti-ubiquitin antistof. Immunoblot med anti-EGFR-antistof fungerede som IP-kontrol, mens det anti-HA-blot blev anvendt som input kontrol. (B) Cellelevedygtighed blev målt ved trypanblå eksklusion og sammenlignet med tom vektor kontrol. c-CBL vildtype (WT) og mutanter S80N /H94Y viste Q249E, og W802 * 66,7%, 132,3%, 120,8%, og 147,9% cellelevedygtighed henholdsvis A549-celler 48 timer efter transfektion. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer og de gennemsnitlige data vises. Fejlsøjler indikerer standardafvigelse. (C) Protein ekspressionsniveauer for de forskellige mutanter blev analyseret ved Western-blots ved anvendelse af c-CBL-antistof. (D) Cell cyklus analyse af forskellige c-CBL mutanterne 48 timer efter transfektion i A549 celler.

B. Påvirkning af lungekræft cellelevedygtighed.

Virkningen af ​​en repræsentativ c-CBL mutant fra hver af de tre etniske baggrunde på lungekræft cellelevedygtighed i cellelinjer blev bestemt. S80N /H94Y dobbelt mutation, Q249E, og W802 * blev identificeret i lunge tumor prøver fra en kaukasisk, en taiwansk og en afrikansk-amerikansk hhv. Som beskrevet i fremgangsmåder, blev c-CBL vildtype (WT) og de ovennævnte tre mutanter udtrykt efter kloning dem i pAlterMax vektor i A549-celler. Disse celler udtrykker relativt lave basale niveauer af endogene c-CBL (data ikke vist). Transfektionseffektivitet var sammenlignelige mellem forskellige grupper og antallet af celler transficeret med c-

CBL

vildtype-konstruktionen var omkring 70% sammenlignet med kontrol celler, der var transficeret med tom vektor. Celler transficeret med S80N /H94Y, Q249E og W802 * c-CBL mutante konstruktioner resulterede i øget antal levedygtige celler, der var 132,3%, 120,8% og 147,9% højere, i forhold til de tomme vektor kontrol transficerede celler og signifikant forskellig fra den vilde -type konstruere (p = 0,022, p = 0,049 og p = 0,008, henholdsvis) (figur 3B). Relative niveauer af c-CBL-protein i helcellelysater fremstillet ud fra prøver opnået fra en parallel eksperiment blev bestemt. De c-CBL-proteinniveauer i prøver, der repræsenterer ikke-transficerede og tom vektor transficerede celler var sammenlignelige og dem, der repræsenterer c-CBL WT og de tre c-CBL mutanter var sammenlignelige (figur 3C).

C. Virkning på cellecyklus.

For at undersøge om stigningerne i cellelevedygtighed i forskellige c-CBL mutanter er på grund af øget celleproliferation, blev udført en celle cyklus analyse. A549-celler blev transficeret med c-CBL WT eller de tre forskellige mutanter: S80N /H94Y, Q249E og W802 *. Den tomme vektor transfektant blev anvendt som kontrol. Otteogfyrre timer efter transfektion cellecyklus-analyse blev udført som beskrevet i materialer og fremgangsmåder. Der var ingen signifikant ændring i subG1, G1 eller S-fasen af ​​cellecyklussen mellem de forskellige mutanter sammenlignet med WT-konstruktionen (p = 0,64, p = 0,40 og p = 0,28, henholdsvis). G2 /M-fasen af ​​cellens cyklus viste en stigning i celleantal for de tre mutanter, S80N /H94Y, Q249E og W802 *, sammenlignet med WT men igen forskellen var ikke statistisk signifikant (p = 0,25) (figur 3D ).

D. Virkning på celle motilitet.

For at undersøge effekten af ​​ekspressionen af ​​de ovennævnte tre c-CBL mutanter på celle migration, vi udført sårheling assay som beskrevet i materialer og metoder. Lukningen af ​​bunden eller såret blev overvåget ved 0, 12, 24, 36, og 48 timer. (Figur 4A). I alle de prøver, der repræsenterede celler transficeret med mutanter, såret var forskellen meget mindre end den, der ses i prøven, der repræsenterede celler transficeret med c-CBL WT (p 0,001). Vi bestemt også hastigheden af ​​sårlukning for alle de fem grupper. Efter 48 timer viste vildtype-c-CBL transfektanter 61,1% åbent sår, mens S80N /H94Y, Q249E og W802 * mutanter viste 18,7%, 23,9% og 34,3% åbent sår (p 0,001). (Figur 4B)

(A) sårheling assay blev udført i A549-celler transficeret med WT c-CBL eller forskellige mutanter. Tom vektor (EV) blev anvendt som kontrol. Repræsentative billeder (Lysfelt og fase kontrast) fra hvert tidspunkt vises. (B) Den åbne sår på hvert tidspunkt blev kvantificeret og normaliseret til 0 timer.