PLoS ONE: Retigeric Acid B Udstillinger antitumoraktivitet gennem undertrykkelse af Nuclear Factor-KB Signaling i prostata cancer celler in vitro og in Vivo

Abstrakt

Tidligere rapporterede vi, at retigeric syre B (RB), en naturlig pentacyklisk triterpenic syre isoleret fra lichen, inhiberede cellevækst og apoptose i androgen-uafhængig prostatacancer (PSA) celler. Imidlertid er virkningsmekanismen for RB er stadig uklar. I denne undersøgelse fandt vi, at anvendelse af PC3 og DU145 celler som modeller, RB inhiberede phosphorylering niveauer af kBa og p65-underenheden af ​​NF-KB på en tids- og dosering-afhængig måde. Detaljeret undersøgelse afslørede, at RB blokeret den nukleare translokation af p65 og dets DNA bindende aktivitet, hvilket korrelerede med undertrykkelse af NF-KB-regulerede proteiner, herunder Bcl-2, Bcl-x

L, cyclin D1 og survivin. NF-KB reporter assay foreslog, at RB var i stand til at inhibere både konstitutive aktiverede NF-KB og LPS (lipopolysaccharid) -induceret aktivering af NF-KB. Overekspression af RelA /p65 reddet RB-induceret celledød, mens knockdown af RelA /p65 fremmes signifikant RB-medieret inhiberende virkning på celleproliferation, hvilket antyder afgørende inddragelse af NF-KB-vejen i denne begivenhed. Vi analyserede yderligere antitumoraktivitet af RB i

in vivo

undersøgelse. I C57BL /6 mus, der bærer RM-1 homografts, RB hæmmede tumorvækst og udløste apoptose primært gennem undertrykke NF-KB-aktivitet i tumorvæv. Derudover afslørede mikromatrice data globale ændringer i genekspressionen associeret med celleproliferation, apoptose, invasion og metastase i afhængighed RB behandling. Derfor er vores resultater viste, at RB udøvede sin anti-tumor effekt ved at målrette NF-KB-vejen i PCA-celler, og dette kunne være en generel mekanisme for anti-tumor effekt af RB i andre typer af cancere samt.

Henvisning: Liu YQ, Hu XY, Lu T, Cheng YN, Young CYF, Yuan HQ, et al. (2012) Retigeric Acid B Udstillinger antitumoraktivitet gennem undertrykkelse af Nuclear Factor-KB Signaling i Prostata Cancer Cells

In vitro

og

i Vivo

. PLoS ONE 7 (5): e38000. doi: 10,1371 /journal.pone.0038000

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: December 26, 2011; Accepteret: April 28, 2012; Udgivet: May 29, 2012 |

Copyright: © 2012 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (30973551, 30925038), og Shandong Scientific Technology Program (2008GG10002042). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatacancer (PCA) er en af ​​de mest almindelige maligne tumorer hos mænd [1]. Det går ud fra en lokaliseret, androgen-afhængig sygdom til invasive og metastatiske hormon-refraktær prostatacancer (HRPC), uden væsentlig prognostisk fordel til konventionelle antitumormidler [2]. Derfor er hidtil ukendte strategier rettet mod det molekylære grundlag for PCa progression tvingende nødvendig.

Den drejelige nukleare faktor KB (NF-KB), en veldokumenteret transkriptionel faktor, er afgørende vigtigt for styring af celleproliferation i pattedyr. I klassiske forløb, er de typiske NF-KB dimerer (p50 /p65), der normalt sekvestreres ved binding til kBa i cytoplasmaet. Den kBa underenheden phosphoryleres på serinrester 32 og 36 af IKK, og derefter nedbrydning gennem proteosomal vej, P50-p65-kBa heterotrimer dreje ind i p50-p65 heterodimer. Kernelokaliseringssignalerne af NF-KB-proteinet udsættes for, og dens p65 subunit er phosphoryleret, hvilket fører til nuklear translokation og transkriptionel aktivering potentiale, og endelig at inducere ekspressionen af ​​et stort antal af målgener. [3], [4] overbevisende beviser har blevet påvist, at afvigende NF-KB regulering er associeret med initiering og progression af forskellige typer af human cancer, herunder PCa, ved at regulere ekspressionen af ​​gener er vigtige for mange trin af tumorigenese og progression [2]. For eksempel er de typiske NF-KB-gener Bcl-2 og survivin, korreleret med celleoverlevelse; cyclin D1, korreleret med spredning; cyclooxygenase-2 (COX-2), korreleret med inflammation; matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9) og intercellulært adhæsionsmolekyle (ICAM), korreleret med invasion; vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) og plasminogen aktivator urokinase (Plau), korrelerer med angiogenese [3], [4], [5]. Det observeres, at nuklear lokalisering af NF-KB p65 i primære tumorer prøver [6], [7], hvilket antyder, at konstitutiv NF-KB-aktivering måske en tidlig begivenhed i PCa udvikling og har prognostisk betydning for primære tumorer. Derfor opsnappe NF-KB-signalering kan være en attraktiv antitumor tilgang [4], [5], [8], [9]. Undertrykkelse af NF-KB-aktivitet er blevet vist at undertrykke væksten af ​​en række af cancerceller både

in vitro

in vivo

. Endvidere anti-apoptotiske aktivitet af NF-KB spiller en rolle i resistensen af ​​tumorceller over for kemoterapeutiske reagenser og strålebehandling [8]. I kemoresistent androgen-uafhængige PCA-celler, er NF-KB konstitutivt aktiveres som følge af den konstitutive IKB kinase (IKK) aktivitet [4], [5].

Vores tidligere undersøgelse har vist, at retigeric acid B (RB) , en naturlig pentacyklisk triterpenic syre, besidder evnen til at inhibere cellevækst og inducerer apoptose i flere cellelinjer, herunder af PCA-celler [10]. Nedregulering af ekspressionen af ​​Bcl-2, som er en af ​​de NF-KB-afhængige gener, og aktivering af caspase signalering observeres i RB-behandlede PC3-celler [10], [11]. Derudover ligner strukturen af ​​RB, andre planteafledte triterpenoids herunder af acetyl-11-keto-β-boswellic syre (AKBA), ursolsyre og betulinsyre, er blevet rapporteret at interferere med NF-KB-vejen [12] [13], [14]. Disse resultater fik os til at teste hypotesen om, at RB kan udøve sine anticancer effekter i PCa gennem modulering af NF-KB-signalering. I den foreliggende undersøgelse, vi demonstreret, at RB nedreguleret p65 phosphorylering og nuklear translokation, og blokeret den konstitutive aktivering af NF-KB-signalering i androgen-uafhængige PC3 og DU145 celler og i C56BL /6 homografts mus.

Resultater

RB udviser hæmmende effekt på p65 fosforylering i carcinomceller

Vi indledte undersøgelse for at teste, om RB udløst apoptose gennem hæmme ekspression og aktivering af NF-KB i PC3 og DU145 celler, hvor NF-KB-signalering konstitutivt aktiveret og bidrog til deres modstand mod apoptose grund ekspression af NF-KB-modulerede antiapoptotiske proteiner. Som vist i figur 1A og 1B viste RB svagt hæmmende effekt på ekspressionen af ​​totale p65-underenheden af ​​NF-KB i PC3 og DU145 celler (1.1~1.3 gange fald for den højeste dosis), hvorimod betydeligt nedreguleret phosphorylering af p65 -Ser536 var både dosis- og tidsafhængig (4~6 gange fald for den højeste dosis eller 48 timer). Svarende til de observationer af protein niveauer af total p65, afslørede kvantitative PCR-data, at mRNA niveauet af p65 blev hæmmet af RB behandling i en moderat måde (figur 1C, 1D). Behandling af PC3 og DU145 celler med 10 uM af RB i 24 timer resulterede i et fald ~35% af mRNA-niveauet af p65 sammenlignet med vehikelkontrol (fig 1C, 1D).

(A) og (B ) RB lidt inhiberede ekspression af p65 i PC3 og DU145 celler, medens væsentligt for Ser-536-phosphorylering af p65 (

s-p65

), i både doseringen-afhængig og tidsafhængig måde. Lysater fra hele celler behandlet med RB af forskellige koncentrationer i 24 timer (A) eller med 10 pM RB for angivne tidspunkter blev anvendt til western blot (B). GAPDH tjente som lastning kontrol. Proteinmængden blev normaliseret til mængden af ​​GAPDH, og blev kvantificeret ved densitometri af røntgenfilm. Resultaterne af en af ​​mindst tre uafhængige eksperimenter er vist. (C) og (D) Rb moderat nedreguleret p65 mRNA-niveauet i PC3 og DU145 celler som påvist ved QRT-PCR-assay. Proceduren blev udført som beskrevet i

Materialer og fremgangsmåder

. De viste resultater er repræsentanter for tre uafhængige forsøg, p 0,05 (*), versus RB-ubehandlede kontrolgruppe henholdsvis

For at udvide vores observation af nedsat fosfor-p65 i PCA celler, vi påviste niveauer. af den samlede p65 og fosfor-p65 i andre kræftceller. Resultaterne viste, at RB var i stand til at reducere p65 fosforylering i et panel af karcinom cellelinjer, herunder human lever hepatocellulære celler HepG2-celler, human myeloid leukæmi K562 celler og adriamycin-resistente K562 /AO2 celler i angivne dosis, mens svag virkning på menneskers ovariecancer SKOV3 og humane lungeadenocarcinom A549-celler (Figur S1). Sammen dataene antydede, at RB spillede en dybtgående indvirkning på undertrykkelse af p65 phosphorylering, især i PCA-celler.

RB undertrykker nukleare translokation og aktivering af NF-KB i PCA-celler

Vi derefter testet, om RB-medieret suppression af fosfor-p65 førte til et fald i nuklear lokalisering af p65 i PC3-celler, som er nødvendig for NF-KB til at aktivere target gentranskription. Som vist i figur 2A, RB dramatisk reduceret overflod af fosfor-p65 i kernen i en dosis-afhængig måde, og en nedsat mængde fosfor-p65, i nogen grad blev observeret i cytoplasmaet samt. Immunofluorescens Resultaterne i figur 2B bekræftede endvidere, at i lighed med western blot assay faldt betydeligt nukleare akkumulering af p65 blev klart observeret, hvorimod p65 blev diffust præsenteret hele cytosolen og kernen i ubehandlede celler.

( A) RB inhiberede dosis-afhængigt den nukleare lokalisering af p65 Lysater fra cytoplasmaet og kernen henholdsvis efter behandling af PC3-celler med RB i 24 timer blev anvendt til western blot. GAPDH og H1 tjente som henholdsvis lastning kontrol. (B) Immunofluorescensanalyse af den inhiberende nukleare lokalisering af p65 ved RB-behandling i 12 timer i PC3-celler. For konfokal mikroskopi blev α-tubulin og p-p65 immunfarvet, med kerner farvet med DAPI. (Scale bar, 10 um). (C) Forbehandling af PC3-celler med RB inhiberede binding af kerneekstrakter til NF-KB-bindingssted, som påvist ved elektroforetisk mobility shift-assay. Lysater fra kerner efter behandling af PC3-celler med RB i 24 timer blev anvendt til EMSA. (D), (E) og (F) RB faldt NF-KB-aktivering i PC3 og DU145 celler, og hæmmede LPS-induceret NF-KB-aktivering i LNCaP-celler. Inhiberingen var mere signifikant, når pnf-KB-luciferase og RELA ekspressionsvektor cotransficeret. Forbigående transficerede celler blev præinkuberet med RB i 24 timer. Luciferase-assayet blev udført som beskrevet i

Materialer og fremgangsmåder

. I (D) – (F), Resultaterne er middelværdien ± S.E. af tre uafhængige forsøg, hver udført in triplo. p 0,05 (*), s 0,01 (**), s. 0,001 (***) versus RB-ubehandlede kontrolgruppe henholdsvis

Elektroforetisk mobilitet (EMSA) var næste færdig at teste, om RB påvirket NF-KB DNA-bindende evne i PC3-celler. Et stærkt bånd skift blev detekteret, når kerneekstrakt fra ubehandlede kontrolceller (bane 4 i figur 2C), mens bindingskomplekser mærkbart reduceret i RB-behandlede celler i dosisafhængig måde (figur 2C, bane 5 og 6). Specificiteten af ​​NF-KB-binding blev bekræftet i konkurrence-forsøg med en 100 gange molært overskud af umærket NF-KB (figur 2C, bane 2). AKBA, tjente som en positiv kontrol, faldt bindingsaktiviteten af ​​NF-KB samt (figur 2C, bane 3).

I et forsøg på at fastslå, om RB tilsvarende inhiberede NF-KB transkriptionel aktivitet, udførte vi forbigående transfektionsassays bruger reporterplasmid indeholdende 4 tandem KB-bindingssteder opstrøms for luciferasegenet. Som vist i figur 2D, RB forårsagede et signifikant fald (p 0,05) i NF-KB reporter-aktivitet i PC3-celler i sammenligning med de ubehandlede celler. Ektopisk ekspression af p65 (RELA) resulterede i en signifikant opregulering af NF-KB luciferaseaktivitet, som også kan være stærkt formindsket (p 0,001) efter behandling med RB (figur 2D). Lignende resultater blev opnået i DU145-celler under de samme eksperimentelle betingelser (figur 2E).

For at undersøge denne RB var i stand til at undertrykke inducerbar NF-KB-aktivitet, udførte vi NF-KB reporter assay i LNCaP-celler. I modsætning PC3 eller DU145 celler, er LNCaP-celler vides at have lav NF-KB-aktivitet. Som vist i figur 2F, var NF-KB-afhængige reporteraktivitet let forøget efter behandling med NF-KB-inducerende faktor LPS alene. Imidlertid blev luciferase produktion dybt augmented i celler ved overekspression af p65 (RELA). Aktiviteten af ​​NF-KB blev yderligere dramatisk reduceret i celler udsat for RB. Disse data viste, at RB undertrykt både den inducerbare (med LPS) og konstitutiv NF-KB-aktivitet i PCA-celler, eventuelt gennem RB-medieret nedregulering af phosphorylering, nuklear translokation og DNA-bindende evne af NF-KB.

RB inhiberer kBa phosphorylering og dens nedbrydning

for at undersøge om RB-medieret inaktivering af NF-KB blev tilskrevet hæmning af kBa nedbrydning, undersøgte vi ændringen af ​​kBa som reaktion på RB ved western blot-analyse. Som vist i figur 3A, behandling med forøgede koncentrationer af RB resulterede i overekspression af total kBa i begge PC3 og DU145 celler. Tilsvarende blev reduceret kBa phosphorylering bemærket efter behandling med 10-20 pM af RB i disse to cellelinier. Tid kinetiske undersøgelser afslørede, at RB opreguleret ekspression af total kBa, og forårsagede et fald i phosphoryleringen af ​​kBa fra ~12 timer i PC3-celler (figur 3B). Lignende virkning blev observeret i DU145-celler efter længere (24 timer) behandling med RB end den, PC3-celler (figur 3B). Proteasomaktivitet assay viste, at RB ikke udøver inhiberende virkning på rekombinante 20S proteasom enzym (figur 3C), som er nødvendig for phosphorylatoin-afhængig kBa nedbrydning. Derved dataene antydede, at nedreguleres af kBa nedbrydning og p65 phosphorylering kan skyldes en effektiv undertrykkelse af IKK-aktivering ved RB, der eventuelt føre til inhibering af NF-KB-aktivitet.

(A) Western blot analyse af udtryk for total kBa og fosfor-kBa (

s-kBa,

Ser32 /36) p-kBa. PC3 og DU145 celler blev behandlet med RB af forskellige doser som angivet. (B) Western blot-analyse af ekspression af total kBa og p-kBa. PC3 og DU145 celler blev behandlet med RB forskellige tidspunkter som angivet. I (A) og (B), var lig protein loading evalueret af GAPDH. Proteinmængden blev normaliseret til mængden af ​​GAPDH, og blev kvantificeret ved densitometri af røntgenfilm. Resultaterne af en af ​​mindst tre uafhængige eksperimenter er vist. (C) Effekten af ​​RB på det rensede 20S proteasomet

in vitro

. MG132 tjente som positiv kontrol. Resultaterne er middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg, p 0,05 (*), s. 0,01 (**), versus ubehandlede kontrolgruppe henholdsvis

RB undertrykker ekspression af NF-κB- regulerede gener, inducerer apoptose og nedsætter cellemigrering gennem inhiberingen af ​​NF-KB-vejen

Siden NF-KB regulerer en række gener, som er involveret i cellevækst, apoptose, angiogenese og metastase af tumorceller, undersøgte vi, om inhibering af NF-KB-aktivitet ved RB transkriptionelt kan føre til modulering af disse genprodukter. Behandling af RB faldt betydeligt ekspressionen af ​​Bcl-x

L, Bcl-2, survivin, og cyclin D1 både mRNA (figur 4A) og proteinniveauer (figur 4B) i enten PC3 eller DU145 celler i en dosis-afhængig måde. Survivin, en kendt antiapoptotisk protein, blev også markant reduceret i RB-behandlede celler som vist i figur 4B.

(A) RB dosis-afhængigt inhiberede mRNA-ekspression af Bd-x

L, Bcl- 2, survivin, og cyklin D1, som analyseres af QRT-PCR. GAPDH blev anvendt til normalisering. Resultaterne er middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg, som hver blev udført in triplo. p 0,05 (*), s 0,01 (**), s 0,001 (***) versus RB-ubehandlede kontrolgruppe henholdsvis. (B) RB dosering-afhængigt inhiberede ekspression af Bcl-x

L, Bcl-2, survivin, og cyclin D. Resultaterne af Western blot-analyse af hele cellelysater fra PC3 celler behandlet med forskellige doser af RB blev vist; GAPDH blev indbefattet som en loading kontrol. (C) RB inhiberede invasion af PCA-celler i en koncentration-afhængigt måde som detekteret ved Transwell assay (skala bar, 100 pm). Proceduren blev beskrevet i

Materialer og metoder

. (D) Antallet af celler, der invaderer gennem matrigel.

Hæmning af NF-KB ved RB førte os til yderligere at analysere virkningen af ​​RB på celle invasion. Som vist i figur 4C, invasivitet gennem matrigel var koncentrationsafhængigt faldt i RB-behandlede PC3 og DU145 celler sammenlignet med bærerbehandlede celler. Som opsummeret i figur 4D, RB behandling resulterede i signifikant blok af cellemigrering i en dosis-afhængig måde. Disse resultater viste, at nedsat aktivering af NF-KB ved RB efterfølgende undertrykt NF-KB-afhængige antiapoptotiske og invasive proteiner, der fører til fald i tumor celle invasion.

For at vurdere ændringerne i den globale genekspression i PC3 celler efter behandling med RB blev Affymetrix GeneChip human Genome U133 Plus 2.0 array, der indeholdt ca. 39.000 kendetegnet humane gener, anvendes til at udføre eksperimentet. I alt 855 gener blev opreguleret større end to gange forskel, og 763 gener nedreguleret i RB-behandlede PC3-celler sammenlignet med kontrolceller. Resultaterne i supplerende data (tabel S1) viste, at mRNA-niveauer af NF-KB familie og NF-KB-associerede gener, ud over andre celler spredningsfølsomme og overlevelse-associerede gener, og apoptotiske regulerende gener præsenteret naturligvis ændring ( = 1,5 gange). Disse resultater er for det meste på linje med beskrevet vores data. Mange typiske gener, såsom Bcl-x

L, cyclin D1, p27, p21, etc. blev nedreguleret i RB behandlede prøve (figur S2) derfor yderligere bekræftet RB inhiberer NF-KB-signalering og dets nedstrømsmål genekspression.

for at bestemme om p65 (RELA) spiller en vigtig rolle i RB-inducted apoptose i PCA-celler, testede vi virkningen af ​​RB på cellelevedygtighed i celler, der enten er over-udtrykt med eller ablateret for p65 af siRNA. Det blev observeret, at p65 ekspressionsplasmid endda forstærket ekspressions- og phosphorylering niveauer af p65 over basale niveauer (figur 5A), og resulterede i en delvis redning af konsekvenserne for RB-induceret celledød i begge PC3 og DU145 celler (figur 5B) , hvilket indikerer, at p65 tillagt celle resistens overfor apoptose induceret ved RB.

(a) og (B) RELA overekspression ved transfektion af en RELA ekspressionsvektor delvist afskaffet cytotoksicitet i PC3 og DU145 celler. Celler blev transficeret med siRNA af RELA (Relai) eller med en negativ kontrol siRNA (NCI) under anvendelse af en 50 nmol /l endelige siRNA koncentration. Efter 48 timer transfektion for RELA overekspression, virkningen af ​​RB på p65, p-p65, og PARP ekspression i RelA transficerede celler blev bestemt ved Western blot; cellelevedygtighed blev også bestemt efter yderligere eksponering i 24 timer til RB. (C) og (D) Silencing af RELA ekspression ved siRNA øget cytotoksicitet induceret af RB. Lignende procedure blev udført for undersøgelserne af RELA. Detaljerne er beskrevet i

Materiale og metoder

. I (A) og (C) blev de proteinniveauer af p65 og p-p65 normaliseret med GAPDH. De viste resultater er repræsentanter for tre uafhængige forsøg. I (B) og (D), s 0,05 (*), s 0,01 (**), s. 0,001 (***) versus RB-ubehandlede kontrolgruppe henholdsvis

i siRNA eksperimentet, valgte vi en af ​​p65-targeting siRNA, der udøves den stærke aktivitet at nedbryder p65-ekspression til evaluering af celleoverlevelse (data ikke vist). Som vist i figur 5C blev ekspressionen og phosphorylering af p65 mærkbart ophævet i celler transficeret med p65-targeting siRNA, sammenlignet med scramble siRNA. Knockdown af p65 undertrykte signifikant cellevækst (figur 5D), og RB behandling resulterede i meget lavere niveau af fosfor-p65 og PARP (116 kDa) i p65-udtømte celler og (figur 5C), hvilket fører til mere udtalt inhibering på celle levedygtighed. Derfor er disse resultater viste, at NF-KB p65 var essentiel for RB-induceret celledød.

RB udøver sin anti-tumor aktivitet gennem undertrykkelse af p65 phosphorylering i tumorvæv hos mus

under vist effekten af ​​RB til blokering NF-KB-signalering i PCA-celler i kultur, vi næste undersøgt dens potentiale antitumorvirkning hos mus. Især vi udførte studier for at undersøge ekspressionen og aktivering af p65 i tumorvæv af mus. For det første vi undersøgte den cytotoksiske aktivitet af RB og AKBA. RB og AKBA bemærkelsesværdigt reduceret RM-1 cellevækst (data ikke vist). Vigtigere, RB og AKBA undertrykte signifikant phosphorylering af p65 i RM-1-celler ved ønskede koncentrationer (figur 6A). Således er denne cellelinie er ækvivalent med sine menneskelige modstykker og blev anvendt til etablering af PCA homografts i C57BL /6 mus. Efter plantning RM-1-celler subkutant i C57BL /6-mus, vi behandlede mus ved daglige intraperitoneale injektioner med 25 mg /kg af RB startet 7 dage efter celleinokulering og fortsat i yderligere 18 dage. Gruppe af behandling med 25 mg /kg AKBA tjente som den positive kontrol. Sammenlignet med at modtage vehikelkontrolgruppe, Rb- eller AKBA-behandlingen reducerede den gennemsnitlige tumorvolumen efter 6., 12. og 18

th dages behandling, RB gruppe viste en kraftigere potentiale (figur 6B og 6C). Resultaterne i tabel 1 viste, tumorvægte blev også reduceret signifikant i RB og AKBA grupper sammenlignet med køretøjet kontrolgruppen (p 0,001). Inhiberingsforholdene satser for tumorvægt af RB og AKBA grupper var 49.60% og 30,01%, henholdsvis. TUNEL-farvning viste, at i modsætning til de tumorvæv modtager bærer, stigende antal TUNEL-positive farvede apoptotiske celler blev set i de tumorvæv fra RB eller AKBA behandlede mus (figur 6D, højre panel). Disse apoptotiske celler blev anerkendt i hele afsnit af tumor spørgsmål er behandlet med kemikalier. Histologisk H middelværdi ± SD; p 0,05 (*), s 0,01 (**), s 0,001 (***) versus medium kontrolgruppen henholdsvis. (C) Repræsentative tumorer fra de tre grupper er vist. (D) H disse resultater tyder på, at naturlige pentacyclic triterpenic syrer kan være brede inhibitorer af NF-KB-aktivering.

Men undertrykkelse af visse genprodukter efter pentacyclic triterpenic syrer synes at være selektiv Vores data viste, at VEGF og COX-2 udtryk forblev uændret i PC3 celler udsat for RB (data ikke vist). Andre gruppers undersøgelser har rapporteret, at AKBA undertrykker VEGF udtryk i plasmacytom U266 celler [18], og hæmmer COX-2 mRNA-ekspression induceret af TNF i KBM-5 celler [19]. I overensstemmelse med AKBA, ursolsyre og betulinsyre også udløse reduktion af VEGF og COX-2-niveau i andre cellelinjer, herunder human leukæmi cellelinje Jurkat, human epithelial cellelinie HCT116, lungecancer cellelinier A549, H3255 og Calu-6, human PCa cellelinje PC3, humane coloncancer-cellelinjer RKO og SW480. [13], [14], [20], [21]. Virkningerne af plante-afledte pentacyclic triterpenic syrer på NF-KB-signalvejen kan varieres på grund af de forskellige substituerede grupper i pentacyclic triterpener, og /eller celletype-afhængig.

Kollektivt, vores resultater tyder på, at RB fremmer apoptose gennem suppression af NF-KB-aktivering og NF-KB-afhængig antiapoptotisk genekspression i PCA-celler og dyremodeller, og NF-KB-signalvejen er et vigtigt molekylært mål for anticanceraktivitet af RB. Salg

Materialer og metoder

Kemi

Retigeric syre B (RB) blev isoleret fra lav

L. kurokawae

, og dets renhed og strukturbestemmelse blev beskrevet tidligere [22]. Acetyl-11-keto-β-boswellic syre (AKBA) blev isoleret og oprenset ved omvendt fase højtydende væskekromatografi som tidligere [22] beskrevne. Forbindelserne blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) ved 10 mM som stamopløsninger opbevares ved -20 ° C og fortyndet ifølge forsøgskravene når de anvendes. Ved anvendelsen af ​​RB i homograft modeller udviklede vi et opløsningsmiddel, der består af fysiologisk saltvand /DMSO /ethanol /Tween 80 (75:10:10:5, v /v).

Cell Kultur og Homografts

Menneskelig PCa LNCaP (The American Type Culture Collection, Rockville, MD), PC3, DU145 celler, og murine PCA RM-1 celler (The Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai) blev dyrket i RPMI 1640-medium (HyClone) suppleret med 10% FBS (HyClone). Humane lungeadenocarcinom A549-celler blev dyrket i Hams /F-12 (HyClone) suppleret med 10% FBS (HyClone). Human lever hepatocellulære HepG2, humane ovariecancerceller SKOV3, human myeloid leukæmi K562 og adriamycin-resistente K562 /AO2, blev dyrket i RPMI 1640-medium (HyClone) suppleret med 10% FBS (HyClone).

RM-1-celler fra C57BL mus prostatatumorer er androgen-uafhængig og kan transplanteres ind i syngene mus for at rekonstituere homotransplantation, som er egnet model til at simulere human PSA.