PLoS ONE: Matrix Stivhed Regulerer Cancer Cell Growth ved at modulere Cellular Metabolisme og Protein Synthesis

Abstrakt

Baggrund

Tumor celler

in vivo

støder forskellige typer mikromiljøer både på stedet for den primære tumor og på steder med fjernmetastaser. Forstå, hvordan de forskellige mekaniske egenskaber af disse mikromiljøer påvirker biologi tumorceller under sygdomsprogression er kritisk at identificere molekylære mål for kræftbehandling.

Metodologi /vigtigste resultater

Denne undersøgelse anvender fleksible polyacrylamidgeler som substrater for cellevækst i forbindelse med en hidtil ukendt proteomisk tilgang til at identificere de egenskaber stivhed-afhængige cancercellelinier, der bidrager til deres differential vækst på bløde og stive substrater. Sammenlignet med celler, der vokser på mere stiv /stive substrater ( 10.000 Pa), celler på bløde substrater (150-300 Pa) udviste en længere cellecyklus, skyldes overvejende en forlængelse af G1-fasen af ​​cellecyklussen, og var metabolisk mindre aktiv, viser nedsat niveau af intracellulær ATP og en markant reduktion i proteinsyntese. Brug stabil isotop mærkning af aminosyrer i kultur (SILAC) og massespektrometri, vi målte satserne for protein syntese af over 1200 cellulære proteiner under vækstbetingelser på bløde og stive /stive underlag. Vi identificerede cellulære proteiner, hvis synteser blev enten fortrinsvis inhiberet eller konserveret på bløde matricer. Den førstnævnte kategori omfattede proteiner, der regulerer cytoskeletstrukturen (f.eks tubulins) og glykolyse (f.eks phosphofructokinase-1), mens sidstnævnte kategori omfattede proteiner, der regulerer vigtige metaboliske veje, der kræves for at overleve, fx nicotinamid phosphoribosyltransferase, en regulator af NAD bjærgning sti.

konklusioner /betydning

de cellulære egenskaber af stivhed-afhængige kræftceller vokser på bløde matricer minder om egenskaberne af hvilende kræftceller, f.eks langsom vækstrate og nedsat metabolisme. Vi foreslår, at anvendelsen af ​​relativt bløde geler som celledyrkningssubstrater ville tillade molekylære veje, der skal undersøges under betingelser, der afspejler de forskellige mekaniske miljø støder cancerceller ved metastase til fjerne steder i

​​Henvisning:. Tilghman RW, Blais EM, Cowan CR, Sherman NE, Grigera PR, Jeffery ED, et al. (2012) Matrix Stivhed Regulerer Cancer Cell Growth ved at modulere Cellular Metabolisme og proteinsyntese. PLoS ONE 7 (5): e37231. doi: 10,1371 /journal.pone.0037231

Redaktør: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, England

Modtaget: Februar 14, 2012; Accepteret: 16. april, 2012; Udgivet: 18. maj 2012 |

Copyright: © 2012 Tilghman et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud National Institutes of Health (NIH) -Nationale Cancer Institute (NCI) CA40042 (JTP) og NIH 1U54 GM64346 (JTP og JWF) (www.nih.gov) og finansiering fra Coulter Foundation Translationel Partners Award (www. whcf.org) (JTP). EMB blev støttet af NIH-NCI T32 CA09109. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Sensing de mekaniske egenskaber af den ekstracellulære matrix (ECM) er en central mekanisme til regulering af differentiering og spredning af en lang række celletyper både

in vitro

in vivo

. Rigelige beviser implicerer ændringer i de signalveje, der regulerer responset af celler til microenvironmental signaler som kritiske hændelser i tumorinitiering, progression, metastase og måske tumor hviletilstand [1], [2]. Desuden er stigningen i vævet stivhed på grund af lokal ophobning af en tæt, tværbundet collagen matrix er et kendetegn for cancer progression i blødt væv og er grundlaget for påvisning af mange typer af tumorer ved fysisk palpation [3], [4].

Analyse af humane cancercellelinier i cellekultur er næsten altid udføres under anvendelse af celler dyrket på stift plast, eller, sjældnere, i Matrigel eller blød agar, de mekaniske egenskaber er dårligt defineret og /eller vanskelige at modulere. Vi har tidligere beskrevet en simpel high-throughput fremgangsmåde til dyrkning af tumorceller på biologisk relevante fleksible substrater ved hjælp af ECM konjugeret polyacrylamid (PA) geler, som kan spænde over en stivhed interval omfatter elasticitetsmoduler på 100 pascal ([Pa] eller N /m2) -150.000 Pa [5]. I dette assay bruger vi en 96-brønds assay-system, der arrays PA geler af forskellig stivhed i definerede intervaller brugerdata på tværs af [6] plade. Vi har anvendt dette assay til at vurdere, hvordan ændringer i stivheden af ​​ECM modulere de biologiske egenskaber af tumorceller, herunder vækst, morfologi, og migrerende egenskaber. De testede cancer cellelinjer blev inddelt i to kategorier baseret på deres spredning profiler: “stivhed afhængig” linjer udviste stigende cellevækst som ekstracellulær stivhed øges, mens “stivhed uafhængig” linjer voksede lige godt over hele testede spektret af matrix stivhed. Vigtigt er det, celler, der voksede dårligt på bløde geler udviste nedsat spredning og migration under disse betingelser og voksede dårligt når den indføres i det bløde væv miljø af lungen. Stivheden-afhængige lungecarcinom A549 svarede til kultur på bløde geler ved at udtrykke den differentierede epithelial markør E-cadherin og faldende ekspressionen af ​​mesenchymale transskriptionsfaktoren Slug. Tilsvarende har stivhed også vist sig at modulere epitel-til-mesenkym overgang i normale epitelceller [7]. Disse observationer viser, at de mekaniske egenskaber af matrixen miljø spiller en væsentlig rolle i reguleringen af ​​spredning og de morfologiske egenskaber af cancerceller, og at “stivhed profil” er en iboende egenskab ved hver cancercellelinie.

Mange cancer cellelinjer reagerer på mindre stive mikromiljøer ved prolifererende langsommere; Men ændringer i cellulær metabolisme som følge af ændringer i stivhed mikromiljø er ikke blevet godt karakteriseret. Cellulære ændringer i metaboliske processer, såsom proteinsyntese kan være særligt relevante som tumorceller indgå en “hvilende” tilstand, primært på steder for fjernmetastaser hvor cellerne er blevet indført til et fremmed mikromiljø [8], [9]. I dette studie undersøgte vi egenskaberne af stivhed-afhængige cancercellelinier, der bidrager til deres differential vækst på bløde og stive polyacrylamid substrater. Sammenlignet med celler, der vokser på mere stiv /stive substrater, celler på bløde substrater (150-300 Pa) udviste en længere cellecyklus, skyldes overvejende en forlængelse af G1-fasen af ​​cellecyklussen, og var metabolisk mindre aktive, viser nedsat niveau af intracellulær ATP og en markant reduktion i proteinsyntese. At identificere de proteiner, som udviser differentielle syntesehastigheder når cellerne dyrkes på blødt versus stive geler, anvendte vi en nylig udviklet anvendelse af stabile isotoper mærkning af aminosyrer i kultur (SILAC) og massespektrometri til at måle hastighederne for proteinsyntese på over 1200 cellulære proteiner under vækstbetingelser for bløde og stive /stive underlag [10]. Ud fra følgende betragtninger overordnede satser for proteinsyntese falde markant i stivhed-afhængige celler dyrket på bløde underlag, vi identificerede cellulære proteiner, hvis synteser blev fortrinsvis hæmmet ved dyrkning på bløde underlag og proteiner, hvis synteser blev forholdsvis bevares, når vokser på bløde matricer. Den førstnævnte kategori omfattede proteiner, der regulerer cytoskeletstrukturen (f.eks tubulin underenheder) og glykolyse (f.eks phosphofructokinase P-1 og ATP syntase), mens sidstnævnte kategori omfattede proteiner, der regulerer vigtige metaboliske veje, der er nødvendige for at modvirke skader fra reaktive ilt arter, såsom aldo-keto-reduktase familiemedlemmer og nikotinamid phosphoribosyltransferase, en regulator af NAD bjærgning vej. De cellulære egenskaber af stivhed-afhængige kræftceller vokser på bløde matricer minder om egenskaberne af hvilende kræftceller, dvs., langsom vækst og nedsat metabolisme. Disse data understøtter ideen om, at stivheden af ​​mikromiljøet kan modulere tumorcelleproliferation ved modulering fundamentale cellulære processer. Endvidere kan den bløde plade teknologi giver en unik platform for studiet af kræftceller undergår dynamisk regulering af proliferation som reaktion på ændringer i den mekaniske miljø, hvilket giver indsigt i, hvordan microenvironmental ændringer modulere kræft cellevækst i eksperimentelle dyremodeller og hos patienter.

Resultater Salg

cellecyklusprogression stivhed-afhængige celler på bløde geler

Vi har tidligere vist, at et panel af cancercellelinjer kan adskilles baseret på evnen til at proliferere på bløde ( 1000 Pa) kollagen-coatede geler. A549-celler (lungecancer) og MDA-MB-231 celler (bryst carcinom) er klassificeret som “stivhed-afhængige” og udviser en fordobling gange, er mindst 2 gange længere på bløde versus stive matricer. I modsætning hertil “stivhed-uafhængige” mPanc96 celler (pancreas carcinoma) vokser lige godt på bløde i forhold til stive matricer og har lignende fordoblingstider under disse betingelser ([5], upublicerede observationer).

For at forstå molekylære basis for den langsomme vækst i stivhed-afhængige cancercellelinier på bløde matricer, målte vi nøgleregulatorer af cellecyklusprogression samt den tid der kræves for celler for tværgående cellecyklussen på bløde eller stive substrater. Cyclin D1 er kritisk for celler til at komme ind i cellecyklus, og tabet af cyclin D1-ekspression er en markør for celler, som har forladt cellecyklus og er hvilende [11]. Derudover har cyclin D1-ekspression blevet vist at være reguleret af matrix stivhed gennem FAK-afhængig aktivering af Rac i utransformerede celler [12]. Ekspressionen af ​​cyclin D1 i stivhed-afhængig cancerceller blev målt for at bestemme om cellerne forlade cellecyklen, når de dyrkes på bløde geler. Stivhed-afhængig A549 eller MDA-MB-231-celler blev dyrket på 150 Pa, 4800 Pa, eller 19200 Pa geler til 2 eller 5 dage, og cyclin D1-ekspression blev målt ved Western blot. Begge cellelinier udtrykte stadig cyclin D1 selv når de dyrkes på de bløde (150 Pa) geler (figur 1). Disse data indikerer, at stivhed-afhængige celler ikke afslutter cellecyklussen, selv om bløde geler hvor cellerne udviser langsommere vækst.

A549-celler og MDA-MB-231-celler blev dyrket på 150 Pa, 4800 Pa, eller 19200 Pa polyacrylamidgeler til 2 eller 5 dage. Cellerne blev lyseret og analyseret ved Western-blot for ekspression af cyclin D1 (øverste panel). Ekspressionen af ​​GAPDH blev analyseret som en loading kontrol (nederste panel). Blottet repræsenterer tre forsøg.

Siden stivhed-afhængige A549-celler ikke afslutter cellecyklussen når udpladet på bløde geler, og kun ~ 5% af cellerne undergår apoptose under disse betingelser [5 ], fremsatte vi den hypotese, at disse celler skrider gennem cellecyklussen langsommere end når de vokser på stive substrater. For at undersøge hastigheden for progression gennem specifikke faser af cellecyklussen, blev stivheden-afhængige lungecarcinom A549 dyrket på bløde (150 Pa) eller stive (19200 Pa) geler i to eller fem dage og derefter pulseret i 30 minutter med den nukleotidanalog bromdeoxyuridin (BrdU) at mærke populationen af ​​celler, som undergår DNA-syntese. Tid tilbragt i hver fase af cellecyklussen blev bestemt ved FACS til at spore BrdU-positive population som cellerne skred gennem S- og G2 faserne og akkumuleret i G1-fasen [13]. Som vist i figur 2, celler på bløde geler skred langsomt gennem G1-fasen af ​​cellecyklussen i forhold til de samme celler, der vokser på stive matricer (figur 2), i overensstemmelse med en global reduktion i cellulær metabolisme eller anabolske processer, der påvirker den cellulære “vækst” fase af cellecyklussen. Fordi cellecyklussen profiler er ens efter 2 og 5 dage på bløde geler, er det sandsynligt, at dette repræsenterer en steady-state måling, i modsætning til den mulighed, at cellevækst er gradvist aftagende over tid. Baseret på den beregnede længde af cellecyklussen for celler vokser på blød versus stive geler, efter 5 dage forholdet mellem celler på blød versus stive matricer ville være 1:4.3. Det samme forhold af vækst på blødt versus stive geler (1:4.3) blev observeret ved manuelt at tælle antallet af celler til stede på fem dage, hvorved validering BrdU puls-chase-beregninger.

A549-celler blev pulseret med BrdU i 30 minutter efter vækst på bløde eller stive geler i 2 dage. A. Mærkning celler med BrDU for cellecyklus analyse. Celler pulset med BrdU i 30 minutter, og BrdU-positive population følges over tid, da det overgange gennem faserne af cellecyklussen. B. Spredningsdiagram histogrammer af BrdU-mærkede celler på blød (øverste felt) eller stive (nederste panel) geler, farvet for DNA-indhold (x-aksen) og BrdU (Y-aksen). De angivne tidspunkter er de tidspunkter, i timer, efter BrdU puls. C. cellecyklusprogression analyse blev udført på scatter plot histogrammer fra celler dyrket på geler i 2 dage (venstre) eller 5 dage (til højre).

Cellular metabolisme i stivhed-afhængige celler dyrket på bløde geler

G1 fasen af ​​cellecyklus stærkt afhængig cellulære metaboliske begivenheder og er kritisk for syntesen af ​​strukturelle proteiner og enzymer, der bidrager til dannelsen af ​​nye organeller og den samlede vækst i cellen. Fordi G1-fasen af ​​cellens cyklus blev forlænget i stivhed-afhængige celler dyrket på bløde geler, vi den hypotese, at der kan være metaboliske ændringer under vækstbetingelser af bløde substrater. Dyrkning stivheden-afhængige A549 eller MDA-MB-231 celler på bløde geler til 2 dage resulterede i en reduktion i ATP-niveauer omkring 50% sammenlignet med celler, der vokser på stive geler (figur 3). Ligesom forlængelse af G1-fasen, de lavere niveauer af cellulær ATP er i overensstemmelse med et fald i cellulær metabolisme når stivhed-afhængige celler dyrkes på bløde geler. Salg

ATP-niveauer blev målt i A549-celler (venstre) eller MDA-MB-231 celler (til højre) efter kultur på polyacrylamidgeler i 2 dage. Dataene repræsenterer gennemsnittet af to eksperimenter udført i triplikat ± S.E., af celler på bløde (300 Pa) eller stive (19200 Pa) geler. Total ATP niveauer var normaliseret til celle numre. * P. 0,05

Virkning af stivhed på proteinsyntese i celler dyrket på bløde geler

På grund af den langvarige G1-fasen og faldet i ATP-niveauer i celler dyrket på bløde geler vi afgøres, om matrix stivhed kan regulere netto proteinsyntese i stivhed-afhængige celler. For at vurdere ændringerne i den globale proteinsyntese, og til at identificere proteiner, der kan være forskelligt syntetiseret under bløde versus stive forhold, brugte vi en nylig udviklet anvendelse af stabile isotoper mærkning af aminosyrer i cellekultur (SILAC), sammenholdt med massespektrometri [10 ]. Stivhed-afhængige A549-celler og stivhed-uafhængig mPanc96 celler blev dyrket i SILAC medier for to generationer på plast vævsdyrkningsskåle til fuldt ud at mærke det proteom med “tunge” aminosyrer (figur 4A). Celler blev derefter udpladet på enten bløde eller stive geler og yderligere dyrket i “tunge” aminosyrer i yderligere 4 dage. Celler blev derefter inkuberet i 24 timer ( “puls”) i “lette” medier (normal vævskultur medier), og cellulære proteiner blev isoleret fra hver af prøverne og opløst på SDS-PAGE. Proteiner til stede i bløde og stive prøver blev analyseret ved at tage ti gelskiver fra hvert protein spor og underkaste hver at fordøjelse med trypsin. Netto proteinsyntese i en 24 hour “puls” blev målt ved at bestemme forholdet af tunge til lette peptider ved massespektrometri for proteiner i de bløde og stive prøver. Et indledende forsøg med A549 celler dyrket på plastik gav tunge til lys-forhold (H /L forhold) af peptider, der var magen til dem af A549 celler dyrket på stive geler (0,6246 ± 0.2326 for plast vs. 0,5482 ± 0.1785 for stive geler). Figur 4B viser boxplots for H /L-forhold af proteiner identificeret for A549 og mPanc96 celler på bløde og stive geler hjælp SILAC. Den gennemsnitlige tung /let-forhold af peptider i A549 celler på bløde geler var signifikant højere (p 0,05) end i cellerne på stive geler, indikerer, at netto proteinsyntese blev reduceret i celler på bløde geler, (dvs. færre lys amino syrer blev inkorporeret under pulsen i celle vokser på bløde substrater sammenlignet med stive substrater). I modsætning hertil de tunge /lette forhold af peptider i mPanc96 celler var ikke signifikant forskellig mellem celler, der vokser på bløde eller stive geler (p 0,05). (Figur 4B)

A549-celler blev udsat for SILAC analyse for at bestemme satser for proteinsyntese på bløde eller stive geler. A. Oversigt over SILAC procedure. A549-celler blev dyrket på bløde eller stive geler i 4 dage i nærvær af “tunge” medier, efterfulgt af en 24-timers inkubation med “light” medier. Cellerne blev lyseret, cellulære proteiner blev spaltet med trypsin, og de resulterende peptider blev analyseret ved massespektrometri. B. Boxplots af tung for lys (H /L) forhold af proteiner fra A549-celler (venstre) eller mPanc96 celler (højre) dyrket på stive (19200 Pa) eller bløde (150 Pa) substrater. H /L-forholdet distributioner er signifikant forskellig mellem stiv og blød for A549-celler, men ikke for mPanc96 celler under anvendelse tosidige uparrede t-test. Kasserne indeholder data mellem de 25 og 75 percentil, og linjen i boksen angiver medianen. Den stiplede linje i toppen af ​​grafen markerer den øvre grænse, over hvilken afvigende værdier blev afkortet.

massespektrometrianalyse identificeret 631 unikke proteiner i A549-celler og 729 unikke proteiner i mPanc96 celler (tabel S1 og S2). Relative til syntese (H /L-forhold) for individuelle proteiner blev derefter sammenlignet mellem celler dyrket i stive og bløde krav for fastlæggelse proteiner, som differentielt “udtrykt” eller oversat. Da fordelingen af ​​H /L-forhold afveg mellem stive og bløde eksperimenter, blev H /L-forhold og skønnet variation normaliseret uafhængigt for A549 og mPanc96 prøver (se Metoder), og vi identificerede proteiner med væsentligt forskellige H /L-forhold (p 0,05 ) anvendelse af t-tests. Figur 5 viser scatterplots af normaliserede H /L-forhold mellem prøver vækst på stive og bløde substrater. Proteiner, som har et betydeligt mindre H /V-forhold (konserveret syntese) i blød i forhold til stive geler er angivet i rødt og proteiner, som har en betydeligt højere H /V-forhold (langsommere syntese) i blød end stive geler er angivet med grønt. Den stiplede linje viser den forventede H /V-forhold under nulhypotesen, at proteiner opretholde samme H /L-forholdet i forhold til middelværdien.

H /L-forhold på proteiner identificeret i både stive og bløde prøver afbildet mod hver andre til A549 celler (til venstre) og mPanc96 celler (til højre). H /L-forhold fra figur 4 var fraktil normaliseret og t-tests blev udført ved anvendelse anslået variabilitet (se fremgangsmåder) at identificere individuelle proteiner med relativt forskellige syntesehastigheder mellem stive og bløde prøver. Proteiner, der syntetiseres hurtigere (relativt lavere H /L-forholdet og p-værdi 0,05). I bløde prøver (sammenlignet med stive prøver) er vist i rødt, og proteiner, der syntetiseres langsommere i bløde prøver er vist med grønt

fra proteiner identificeret ved massespektroskopi, vi udskilt de proteiner, der udviser signifikant forskellige H /L-forhold (p 0,05) mellem celler dyrket på stive og bløde geler (tabel S3 til A549 celler; tabel S4 for mPanc96 celler). I A549 celler, flere proteiner med fælles biologiske funktioner grupperet i kategorien af ​​langsommere syntese på bløde geler (tabel 1). Disse omfattede proteiner involveret i proteinsyntese, såsom ribosomale proteiner og forlængelsesfaktorer. Underenheder af mikrotubuli (tubulins) også grupperet i kategorien af ​​langsommere syntese på bløde geler. Interessant, to proteiner med afgørende roller i ATP produktion vises også langsommere syntese satser på bløde geler: 6-phosphofructokinase type C (PFKP-1) og en underenhed af ATP syntase. Disse data antyder, at når A549-celler dyrkes i et blødt mikromiljø, en undergruppe af proteiner – herunder dem der er involveret i oversættelse og mikrotubulusdynamik – syntetiseres langsommere i forhold til den gennemsnitlige syntese end når de dyrkes på stive geler

Omvendt proteiner, der havde højere syntese satser end hovedparten af ​​de cellulære proteiner, når udpladet på bløde geler omfattede medlemmer af aldo-keto reductase familie, som er involveret i beskyttelse mod reaktive oxygenarter, og nicotinamid phosphoribosyltransferase, som er vigtig for opretholdelse fysiologiske niveauer af nicotinamid cofaktorer (dvs. NADPH), som er vigtige for disse redoxreaktioner (tabel 2). Derudover proteiner med roller i endocytose og vesikeltrafik, specifikt annexiner og Rab proteiner, viste sig også at være konserveret i A549-celler dyrket på bløde geler. Dataene i denne tabel tyder på, at når A549 celler dyrkes i en blød mikromiljø, er syntesen af ​​proteiner, der er vigtige for reguleringen af ​​reaktive ilt arter og membran dynamik bevaret.

Svarende til A549 celler dyrket på bløde geler blev adskillige ribosomale proteiner syntetiseres også langsommere i mPanc96 celler, der var dyrket på bløde geler (tabel 3). Men i modsætning til A549-celler, blev adskillige proteiner med roller i oversættelse også fundet, at have højere syntese satser i mPanc96 celler ved dyrkning på bløde geler (tabel 4). Og mens de A549-celler viste proteiner involveret i vesikeltrafik og oxidativ stress veje som havende konserverede syntese satser på bløde geler, proteiner involveret i disse processer, såsom coatomer underenheder og superoxiddismutase henholdsvis blev syntetiseret langsommere i mPanc96 celler dyrket på bløde geler (tabel 3), hvilket antyder, at disse processer kan nedreguleres, når mPanc96 celler vokser i bløde mikromiljøer. Interessant, flere proteiner, der er involveret i reguleringen af ​​celle-matrix vedhæftning og actin dynamik, herunder Rac familiemedlem RhoG, fascin, og omvendt formin-2, viste sig at have højere syntese når mPanc96 celler dyrkes på bløde geler (tabel 4), foruden to proteiner (citratsynthase og malat dehydrogenase), som har afgørende roller i citronsyrecyklussen, en vigtig metabolisk proces til produktion af ATP og aminosyre-forstadier. Disse data antyder, at når stivheden-uafhængig cellelinie mPanc96 dyrkes i et blødt mikromiljø, der er et fald i syntesen af ​​proteiner involveret i vesikeltrafik og oxidativ stress veje, mens der er en stigning i syntesen af ​​proteiner involveret i actin dynamik og citronsyrecyklus.

Da disse data afspejler kun syntesen af ​​proteiner, og de overordnede niveauer af proteiner bestemmes af balancen mellem syntese og nedbrydning, vi søgte at teste, om denne ændring af proteinsyntese faktisk påvirker de cellulære niveauer af disse proteiner. Lysater fra A549 og mPanc96 celler dyrket på bløde eller stive geler blev underkastet western blot for actin, et protein, som havde viste ingen signifikante ændringer i den relative syntese, når de dyrkes på bløde geler, og to proteiner, der viste høj følsomhed for stivhed, nemlig tubulin og phosphofructokinase-1. Niveauerne af proteinerne blev normaliseret til GAPDH som en loading kontrol, fordi der ikke var en signifikant forskel i den relative syntese af GAPDH mellem bløde og stive geler (p = 0,55, se tabel S1, linie 275). Som vist i figur 6, blev actin udtrykt på tilsvarende niveauer ved dyrkning på bløde eller stive geler, mens niveauerne af tubulin og PFKP-1 var lavere på de bløde geler i A549-celler, hvilket antyder, at den lavere syntese af disse proteiner observeret i SILAC data reflekteres af lavere niveauer af disse proteiner i celler. I modsætning hertil udviste mPanc96 celler ingen ændringer i tubulin eller PFKP-1-niveauer ved dyrkning på bløde geler. Disse data indikerer, at i det mindste for de undersøgte proteiner (tubulin og PFKP-1), en langsommere syntese svarer til lavere niveauer af cellulært protein.

A. Niveauerne af actin, tubulin, og phosphofructokinase-1 i A549-celler dyrket på bløde (150 Pa) eller stive (19200 Pa) geler blev analyseret ved western blot. Bundpaneler viser niveauer af GAPDH som en loading kontrol. B. Niveauerne af actin, tubulin, og PFKP-1 i mPanc96 celler dyrket på bløde eller stive geler som analyseret ved western blot. Bundpaneler viser niveauer af GAPDH i cellelysater som en loading kontrol. C. Kvantificering af Western blot resulterer i (A) og (B). Niveauerne af hvert protein blev normaliseret til mængden af ​​GAPDH i hver prøve. Niveauerne af protein i prøver fremstillet ud fra stive geler blev sat til 100%, og niveauet af protein i de bløde prøver vises i procent udtryk for disse prøver. Resultater viser middelværdien ± S.E. af mindst tre forsøg. * P. 0,05 i forhold til niveauet af actin udtryk

Diskussion

I dette papir, vi viser, at stivhed af den ekstracellulære matrix regulerer cellulær metabolisme og proteinsyntese i kræft celler. Stivheden-afhængige cancercellelinjer A549 og MDA-MB-231 opretholder ekspressionen af ​​cyclin D1, når de dyrkes i serum på polyacrylamidgeler, som har mekaniske egenskaber, der svarer til den for blødt væv, såsom lunge eller bryst. Trods cyclin D1-ekspression, A549-celler, når de dyrkes på bløde geler, viser en forlængelse af G1-fasen af ​​cellecyklussen, hvilket antyder, at der kan være fejl i syntesen af ​​de strukturelle og enzymatiske bestanddele nødvendige for overgangen til S-fasen . Følgelig Stivheden-afhængige cellelinier viser lavere niveauer af cellulære ATP-niveauer ved dyrkning på bløde geler. Derudover proteinsyntese i A549-celler er langsommere under denne betingelse, med syntesen af ​​specifikke strukturelle proteiner og glycolytiske enzymer, såsom tubulin, phosphofructokinase, og ATP syntase særligt følsomme over for faldet i ekstracellulære stivhed. Proteiner, der var mindre følsomme over for ændringer i stivhed inkluderet enzymer såsom aldo-keto-reduktase og nicotinamid phosphoribosyltransferase, der er involveret i metabolismen af ​​ROS produkter.

Matrix stivhed er blevet foreslået at være en mekanisme ligger til grund for vævstropisme af cancer metastaser, fordi væksten af ​​carcinoma cellelinier på bløde eller stive geler korrelerer med deres evne til at vokse i bløde eller stive væv [5], [14]. Men mekanismen (er), der regulerer væksten af ​​cancerceller i en vævsspecifik måde er utvivlsomt kompliceret. Vores observationer tyder på, at én måde, hvorpå stivhed-afhængige cancerceller kan reagere på en mindre end gunstigt vævstype-matrix miljø er at mindske deres metaboliske tilstand, som tilbyder en potentiel mekanisme for den observerede væv tropisme af tumorceller, og måske væv-afhængig tumor vækstdvale.

tumor vækstdvale er defineret som en etape i kræft progression, hvor residual sygdom er til stede, men er asymptomatisk [15]. Hvilende kræftceller kan opholde uopdaget på steder fjernt fra den primære tumor, indtil en senere vækst og klinisk recidiv [16]. Nylige undersøgelser støtter en model, hvor cancerceller fra den primære tumor vil udbrede tidligt under sygdomsprogression, så at på det tidspunkt detekteres den primære tumor, kan der være hvilende cancerceller allerede opholder sig på fjerne steder [17]. Disse celler er enten midlertidigt Non-proliferativ, eller der er en balance mellem proliferation og celledød, eller immunsystemet er at holde celletal i skak. Interessant sidstnævnte mulighed er kommet under kontrol på grund af undersøgelser, der viser en mangel på tumor tilbagefald hos kræftpatienter, der har undergået immunosuppressiv behandling [18].

Nylige undersøgelser har impliceret den mikromiljø som en central regulator af tumor celle vækstdvale og tilbagevenden. Specifikt kan egenskaberne af den ekstracellulære matrix ved steder med metastase spille vigtige roller ved bestemmelse af tilstanden af ​​disseminerede tumorceller [9]. Men mekanistisk indsigt i, hvordan hviletilstand forekommer er knappe, da hvilende cancerceller er vanskelige at detektere og studere in vivo, og der er en mangel på in vitro-modeller for tumorcelle hviletilstand. Indtil for nylig har sådanne modeller blevet begrænset til celler dyrket på fosterhinder (CAMs) eller på 3D matrix afledt fra Engelbreth-Holm-Swarm tumor (EHS matrix eller Matrigel) [19], [20]. Matrigel er en blanding af laminin, collagen IV, og nidogen, foruden en række proteaser og vækstfaktorer, såsom TGF, FGF, EGF, PDGF og IGF [21]. Fordi det er genereret fra en tumor, er den specifikke sammensætning af Matrigel ikke veldefineret, og den kan variere fra batch til batch, der producerer variabilitet i eksperimentelle resultater [22]. Mens de mekaniske egenskaber af Matrigel er blevet analyseret, de også er underlagt variabilitet, fordi dens polymerisering påvirkes af dens sammensætning og andre eksperimentelle faktorer, såsom temperatur [23]. Desuden øjeblikket den eneste måde at ændre de mekaniske egenskaber af Matrigel er at tilføje yderligere matrixbestanddele, såsom collagen I [24], som også kan komplicere fortolkningen af ​​eksperimentelle resultater.

For nylig in vitro modeller for tumor hviletilstand har udvidet til at omfatte anvendelse af polyacrylamidgeler som vækstsubstrater [25]. I modsætning til Matrigel, polyacrylamid er en stabil, homogen polymer, og dets mekaniske egenskaber er ikke følsomme over for ændringer i temperatur [26]. Dens stivhed er let, variabelt ved at modulere mængden af ​​bis tværbinder uden at påvirke dets evne til at binde ECM molekyler til dets [6] overflade. Polyacrylamid-hydrogeler kan omfatte et spektrum af elasticitetsmoduler, der omfatter en række humane væv fra fedt til skeletmuskel [27], og en række ECM-molekyler kan konjugeres til dens overflade, herunder collagen, fibronectin og upolymeriseret Matrigel. Desuden blev en high-throughput-system nylig udviklet for at muliggøre screening af småmolekylære inhibitorer med celler dyrket på polyacrylamidgeler spænder over en række elastiske moduli [5], [6].