PLoS ONE: (-) – Epigallocatechin-3-gallate inducerer ikke-apoptotisk celledød i humane cancerceller via ROS-medieret Lysosomal Membrane Permeabilization

Abstrakt

(-) – Epigallocatechin-3-gallate (EGCG ) er den mest omfattende studerede te polyphenol for sin anti-cancer-funktion. I denne undersøgelse, rapporterer vi en ny virkningsmekanisme for EGCG-medieret celledød ved at identificere den kritiske rolle lysosomale membranpermeabilisering (LMP). Først blev EGCG-induceret celledød i humane cancerceller (både HepG2 og HeLa) fundet at være caspase-uafhængig og ledsaget af tydelig cytosolisk vakuolisering, kun iagttages, når cellerne blev behandlet i serum-frit medium. Den cytosoliske vakuolisering observeret i EGCG-behandlede celler blev sandsynligvis forårsaget af lysosomale dilatation. Interessant EGCG kunne forstyrre autophagic flux på nedbrydningen trin ved svækkelse af lysosomal funktion, og egcg celledød var uafhængig af Atg5 eller autofagi. De væsentlige resultater af denne undersøgelse er, at EGCG er i stand til at udløse LMP, som det fremgår af Lyso-Tracker Red farvning, cathepsin D cytosolisk translokation og cytosolisk forsuring. Konsekvent, et lysosomotropiske agent, chloroquin, effektivt redder celledød via undertrykke LMP-forårsagede cytosolisk forsuring. Endelig fandt vi, at EGCG fremmer produktionen af ​​intracellulær ROS opstrøms LMP og celledød, som det fremgår af øget niveau af ROS i celler behandlet med EGCG og de beskyttende virkninger af antioxidant N-acetylcystein (NAC) mod EGCG-medieret LMP og celledød . Taget sammen data fra vores undersøgelse afslører en hidtil ukendt mekanisme bag EGCG-induceret celledød involverer ROS og LMP. Derfor forstå denne lysosomer-associeret celledød pathway kaste nye lys på de anti-cancer effekter af EGCG

Henvisning:. Zhang Y, Yang ND, Zhou F, Shen T, Duan T, Zhou J, et al . (2012) (-) – Epigallocatechin-3-gallate inducerer ikke-apoptotisk celledød i humane cancerceller via ROS-medieret Lysosomal membranpermeabilisering. PLoS ONE 7 (10): e46749. doi: 10,1371 /journal.pone.0046749

Redaktør: Shi-Yong Sun, Emory University, USA

Modtaget: 16. juli 2012; Accepteret: September 4, 2012; Udgivet: 8. oktober, 2012 |

Copyright: © Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist støttet af forskningsbevillinger fra Kina National Natural Science Foundation (81028014 og 81172659 til ZXQ og SHM) og fra Singapore National Medical Research Council (NMRC /1260/2010-IRG09nov070 til SHM). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

fordelene ved te forbrug til sundhed er blevet godt etableret via forskellige undersøgelser i mennesker. De fleste af disse fordele, herunder forebyggelse af kræft og hjerte-kar-sygdomme, er blevet tilskrevet de polyphenoliske komponenter i te [1]. Som den mest rigelige og biologisk aktive bestanddel blandt de te polyfenoler, (-) – epigallocatechin-3-gallate (egcg) har modtaget en stor opmærksomhed i kræftforskningen [2]. Til dato har mekanismerne bag anti-cancer funktion af EGCG blevet omfattende undersøgt. Det er kendt, at egcg kan binde til multiple molekylære mål, herunder transmembrane receptorer, kinaser eller andre vigtige proteiner, påvirker således en række signalveje, hvilket resulterer i væksthæmning, apoptose eller undertrykkelse af invasion, angiogenese og metastase [3]. Blandt dem evne EGCG til induktion af celledød i cancerceller betragtes som en af ​​de vigtigste mekanismer i forbindelse med dens anti-cancer-funktion [4]. Alligevel de nøjagtige molekylære mekanismer for EGCG celledød er ikke blevet fuldt belyst. De fleste af tidligere rapporter har konkluderet, at EGCG inducerer caspase-medieret apoptose i forskellige tumorceller via mitokondrie pathway [5], [6] eller via dødsreceptoren [7], mens kun få undersøgelser demonstrerede ikke-apoptose celledød forårsaget af EGCG [8], [9].

Blandt forskellige mekanismer til EGCG-medieret celledød, reaktive ilt arter (ROS) og oxidativ stress synes at være særlig vigtig. Selvom EGCG med en pyrogallol-typen struktur på B-ringen behandler en stærk antioxidant aktivitet, er denne struktur viste sig at være ustabile i celle dyrket systemet [10]. Auto-oxidation af EGCG i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) frembringer væsentlig mængde af ROS, især H

2O

2, som spiller en vigtig rolle i den cytotoksiske virkning af EGCG mod cancercellelinier [11], [12]. Tilsætning af antioxidanter i dyrkningsmediet blev rapporteret at inhibere EGCG apoptose [13], [14]. For nylig, deltagelsen af ​​ROS og oxidativt stress i ikke-apoptotisk celledød eller nekrose har været stigende værdsat [15]. Det er derfor af interesse for at forstå rol- af ROS og oxidativt stress i EGCG-medieret celledød, herunder både apoptotiske og ikke-apoptotisk celledød.

Lysosomer er cytoplasmatiske membran-lukkede organeller, som indeholder hydrolytiske enzymer og at styre den intracellulære omsætning /nedbrydning af makromolekyler [16]. I de senere år har den biologiske funktion af lysosomer i stigende grad blevet værdsat, og det er kendt for at spille kritiske roller i forskellige fysiologiske processer, såsom autofagi og i humane sygdomme, såsom lysosomal storage sygdomme, cancer og neurodegenerative sygdomme [17]. Lysosomale proteaser, der afholdes i membranen under normale forhold, vil sive ind i cytosolen i både apoptose og nekrose [18]. En vigtig proces, der er kendt for at være tæt forbundet med den celledød proces er lysosomale membran permeabilisering (LMP) [19]. Den nøjagtige resultat af LMP er afhængig af omfanget af skader lysosomale membran. En massiv brud af lysosomer og hurtig frigivelse af deres sure indhold er ofte et afgørende skridt for nekrose; mens den delvise og selektiv lysosomale lækage ofte er forbundet med den apoptotiske proces [20], [21]. Der er mange kendte faktorer at forstyrre lysosomale membran integritet og forårsage LMP, herunder ROS, lysosomotropiske rengøringsmidler, mikrotubuli toksiner og nogle lipider [17], [19]. For eksempel er nogle anti-cancer midler, såsom vincristin og siramesine kendt for at forårsage lysosom-afhængig celledød [22], [23]. Indtil videre er det ikke vides, om lysosomer er impliceret i celledød induceret af EGCG i kræftceller.

I denne undersøgelse sigter vi til yderligere at undersøge de molekylære mekanismer bag EGCG-medieret celledød. Vores resultater viste først, at EGCG inducerer en form for caspase-uafhængig ikke-apoptotisk celledød, hvilket kan forøges væsentligt i serum-frit medium. For det andet, fandt vi, at EGCG udløser LMP, hvilket resulterer i lækage af sine vigtigste proteaser (cathepsin) ind i cytosolen, og celledød. Interessant sådan celledød er uafhængig af autofagi. Endelig har vi givet klare beviser for, at EGCG fremmer intracellulær ROS dannelse, der fungerer som en central proces, der fører til LMP og celledød. Derfor data fra denne undersøgelse identificerer en hidtil ukendt celledød mekanisme induceret af EGCG i cancerceller som involverer oxidativ stress, lysosomal beskadigelse og i sidste ende celledød.

(A) Serum deprivation fremmer EGCG-induceret celledød i en koncentration -afhængig og tidsforløbet måde. HepG2-celler blev behandlet med forskellige doser af EGCG i fuld eller serum-frit medium i 12 timer (venstre panel) eller med 60 pM EGCG for forskellige tidsrum som angivet (højre panel). Cellelevedygtigheden blev bestemt ved Hoechst-PI dobbelt farvning (n = 3, gennemsnit ± SD). (B) Repræsentative billeder af Hoechst-PI dobbelt farvning. HepG2 celler blev dyrket i fuldt medium (som kontrol); behandlet med 60 pM EGCG i 12 timer i serum-frit medium; eller inkuberet med 20 ng /ml TNFa og 10 ug /ml CHX i 12 timer i fuld medium (som en positiv kontrol for apoptose). (C) EGCG inducerer caspase-uafhængig celledød. HepG2-celler blev behandlet med EGCG (60 uM × 24 h) eller i fravær eller nærvær af 40 uM z-VAD-fmk. Co-behandling med TNFa (20 ng /ml) og CHX (10 ug /ml) i 12 timer blev anvendt som en positiv kontrol. Cellernes levedygtighed blev bestemt som beskrevet i panel A. **

s

0,005 sammenligne med gruppen uden z-VAD (Students

t

-test, n = 3). (D) nr caspase-3-aktivering og PARP-spaltning forårsaget af EGCG-induceret celledød. Cellerne blev behandlet med EGCG eller TNF /CHX som beskrevet i panel C, og cellelysater blev indsamlet og underkastet western blot.

Materialer og metoder

Kemikalier, reagenser og antistoffer

(-) – Epigallocatechin-3-gallate (EGCG, 90%) blev købt fra Zhejiang University Tea Research Institute. 5- (and-6) -chlormethyl-2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetat acetyl ester (CM-H

2DCFDA), blev Hoechst33342, og Lyso-Tracker® Rød (DND-99) opnået fra Invitrogen. z-VAD-fmk var formular Enzo. Acridinorange var fra immunokemisystemer Technologies. E-64D og N-acetylcystein var fra Merk. Propidiumiodid (PI), digitonin, chloroquin (CQ), bafilomycin A1 (Baf A1), pepstatin A og andre almindelige kemikalier blev alle anskaffet fra Sigma-Aldrich. De primære antistoffer anvendt i undersøgelsen omfatter følgende: anti-poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), anti-caspase-3 og anti-glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) fra Cell Signaling, anti-β-actin og anti-mikrotubulus-associeret protein 1 lette kæde 3 (LC3) fra Sigma-Aldrich, anti-P62 fra Abnova, anti-Atg5, anti-cathepsin D og anti-lysosom-associeret membranprotein (LAMP-1) fra Santa Cruz. Den sekundære antistoffer, peberrodsperoxidasekonjugeret gede-anti-muse-IgG, gede-anti-kanin-IgG og kanin-anti-gede-IgG, var alle fra Thermo Scientific.

(A) Morfologiske ændringer af EGCG-behandlede celler i serum -fri medium blev analyseret under anvendelse af lysmikroskopi. Repræsentative billeder af HepG2 celle behandlet med EGCG ved angivne koncentrationer i 12 timer (øverste panel) eller med 60 pM EGCG for angivne tidsforløb (nedre panel) er vist (skala bar: 50 pm). (B) HepG2-celler blev behandlet med EGCG (60 eller 240 pM) i 12 timer. Cellerne blev derefter fikseret og farvet ved hematoxylin, derefter analyseret ved lysmikroskopi (skala bar: 30 um). (C) vacuolen indholdet ikke lipiddråber. HepG2 celler blev EGCG (60 uM) i 12 timer. Dyrkede celler i fuld medium i 12 timer blev anvendt som en negativ kontrol, og celler behandlet med 1 mM oleat acid (OA) i DMEM-medium indeholdende 1% BSA i 12 timer blev anvendt som den positive kontrol. Cellerne blev fikseret og farvet med 0,5% Oil Red O og hematoxylin (skala bar: 30 um). (D) De vakuoler er af lysosom oprindelse. Immunofluorescens farvning af LAMP-1 blev udført i MEF celler efter behandling med eller uden EGCG (60 uM) i 9 timer (skala bar: 10 pm).

Cell Kultur og behandlinger

Menneskelig heptoma HepG2 var fra American Type Culture Collection. Mouse embryonale fibroblaster (MEF), både vildtype (WT) og m5-7 celler med inducerbare sletning af Atg5 blev leveret af Dr. N. Mizushima (Tokyo Medical og Dental University) [24]. Både af dem blev dyrket i DMEM (Sigma-Aldrich) indeholdende 10% føtalt bovint serum (HyClone) og 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen), i et CO 5%

2 atmosfære ved 37 ° C.

cellelevedygtighed Analyser

I denne undersøgelse blev cellelevedygtighed kvantificeret ved hjælp af PI udelukkelse test som tidligere beskrevet med modifikationer [25]. For hver prøve blev celler podet i en 96-brønds plade ved 5 × 10

3 per brønd. Den næste dag blev celler først behandlet som beskrevet i resultaterne, i figurteksterne, efterfulgt af inkubation med 10 ug /ml Hoechst33342 og 5 ug /ml PI i 15 minutter ved stuetemperatur. Hoechst kan plette alle cellerne i blå, mens de døde celler blev vist ved PI kernefarvning i rødt. For hver prøve blev omkring 500 celler visualiseret, tilfældig fanget og talt for cellelevedygtighed baseret på forholdet af PI-positive til negative celler under anvendelse af et omvendt fluorescerende mikroskop (Nikon ECLIPSE TE2000-S).

(A) EGCG øger LC3-II og p62-protein-niveau. HepG2 og MEF-celler blev behandlet med EGCG (60 uM) for angivne varigheder i fuld medium eller i serum-frit medium som angivet. Cellelysater blev indsamlet til western blot. (B) EGCG øger dannelsen af ​​GFP-LC3 puncta. MEF med stabil ekspression af GFP-LC3 (m5-7 celler) blev behandlet med eller uden 60 pM EGCG i 9 timer i serum-frit medium og analyseret ved konfokal mikroskopi (skala bar: 20 pm). (C) EGCG fremmer ikke autohpagic flux. HepG2-celler blev behandlet i serumfrit medium med 60 pM EGCG, 50 nM Baf A1, eller begge i 9 timer. Cellelysater blev opsamlet og underkastet western blot. (D) EGCG har ingen effekt på autophagosome-lysosom fusion. MEF celler med stabil ekspression af GFP-LC3 blev dyrket i serumfrit medium i 9 timer (som en kontrol); behandlet med EGCG (60 uM × 9 h) i serum-frit medium; eller dyrket i EBSS-medium i 2 timer (som en positiv kontrol). Celler blev derefter, kulørt LAPM-1 som beskrevet i figur 2D. Celler blev analyseret ved konfokal mikroskopi (skala bar: 10 pm).

Oil Red O for Lipid Droplet Farvning

Lipid dråbe farvning blev udført ved hjælp af en etableret metode [26]. Kort fortalt blev HepG2-celler podet til 24-brønds plade på en dækglas og dyrket natten over. For den positive kontrol blev celler behandlet med 1 mM oleinsyre i serumfrit DMEM indeholdende 1% BSA. Efter behandling blev cellerne fikseret med formaldehyd, og derefter farvet under anvendelse af 0,5% Olie-rød-O i isopropanol i 30 minutter og kerner blev modfarvet med hematoxylin.

immunfluorescensfarvning

I denne studere, lysosomet-associeret membranprotein (LAMP-1) blev undersøgt ved immunfluorescensfarvning, baseret på en etableret metode [27]. Behandlede celler blev fikseret med 4% paraformaldehyd i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur, og permeabiliseret med 0,01% saponin i PBS i 10 min. Efter blokering med 1% BSA i PBS i 30 minutter blev celler inkuberet med rotte-anti-muse LAMP-1 (1D4B) primært antistof (Developmental Studies Hybridoma Bank) i en 1:100 fortynding natten over ved 4 ° C, efterfulgt af Alexa Fluor 555 gede-anti-rotte-sekundært antistof (Invitrogen). Cellerne blev undersøgt under anvendelse af et konfokalt mikroskop (Olympus FluoView FV1000) og repræsentative celler blev udvalgt og fotograferet.

(A) MEF celler med inducerbar deletion af Atg5 (m5-7 celler) blev dyrket med eller uden 10 ng /ml Dox i 4 dage, derefter EGCG (60 uM × 6 H), og cellelysater blev opsamlet og underkastet western blot. (B) Dannelsen af ​​vakuoler er Atg5-uafhængig. m5-7 celler som beskrevet i panel A blev behandlet med EGCG (60 uM) i 12 timer og observeret under lysmikroskopi (skala bar: 30 um). (C) EGCG-induceret celledød er uafhængig af autofagi. m5-7 celler som beskrevet i panel A blev behandlet med EGCG (60 uM) i 24 timer. Cellelevedygtigheden blev bestemt ved Hoechst-PI dobbelt farvning (n = 3, gennemsnit ± SD).

Lysosomal Farvning

Lysosomal-farvning blev udført under anvendelse Lyso-Tracker, et lysosomotropiske probe (Invitrogen) [28]. De behandlede celler blev inkuberet i 30 min ved 37 ° C med 5 nM Lyso-Tracker. Cellerne blev undersøgt under anvendelse af et konfokalt mikroskop og repræsentative billeder blev fotograferet.

Fremstilling af membranfraktion af Digitonin Extraction

Fremgangsmåden til at adskille de cytosoliske fraktioner fra membranfraktioner blev anvendt som tidligere beskrevet [29 ]. Efter udpegede behandlinger, celler blev først suspenderet i ekstraktionsbuffer (250 mM saccharose, 20 mM HEPES pH 7,5, 10 mM KCI, 1,5 mM MgCl

2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, med tilføjelse af med 250 ug /ml digitonin (Sigma) i 10 minutter på is med gentagen hvirvelbehandling efterfulgt af centrifugering (90 sekunder, 13.000 rpm, 4 ° C). den resulterende supernatant blev derefter holdt som den cytosoliske fraktion og pelletten som membranfraktionen. Denne optimale koncentration af digitonin i udvinding buffer blev bestemt ved hvilken det giver effektiv ekstraktion af cytosoliske proteiner (analyseret af immunoblots bruger GAPDH som markør), mens du stadig efterlader lysosomale membraner intakt (ved hjælp af cathepsin D som markør).

Western blotting

ved afslutningen af ​​de udpegede behandlinger blev celler lyseret i helcelle lysepuffer (62,5 mM Tris-HCI ved pH 6,8, 20% glycerol, 2% SDS, 2 mM DTT, 100 uM PMSF og proteinase inhibitor cocktail). prøver med lige så stor mængde proteiner blev underkastet SDS-PAGE og overført til en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran (Bio-Rad). Efter blokering med 5% fedtfri mælk, probet med udpegede primære og sekundære antistoffer. Membranen blev udviklet med forøget kemiluminescens metoden (Thermo Scientific) og visualiseret med Kodak Image Station 4000R (Kodak).

(A) Effekt af EGCG på intracellulære sure rum. HepG2-celler var med EGCG (60 uM) for angivne varigheder eller med Baf A1 (50 nM) i 6 timer. De sure rum blev mærket med 5 nM Lyø-Tracker Red og undersøges ved konfokal (skala bar: 20 pm). (B) EGCG inducerer lækage af cathepsiner fra lysosom til cytosolen. Celle fraktionering blev udført for at separere lysosomale og cytosoliske fraktioner i HepG2 behandlet med 60 pM EGCG i serum-frit medium som angivet. Cathepsin D blev påvist ved western blotting i de forskellige fraktioner og helcellelysater. LAMP-1 blev anvendt som markør for lysosom. (C) EGCG forårsager lysosomale neutralisering og cytosolisk forsuring. HepG2-celler blev behandlet med 60 pM EGCG som angivet i serum-frit medium, efterfulgt af farvning med 5 ug /ml acridinorange (AO) i 30 minutter og analyseret ved konfokal (skala bar: 20 pm).

acridin orange (AO) Farvning

AO er en metakromatisk og svag base membran-gennemtrængelige fluorescerende farvestof, hvis fluorescensemission er koncentrationsafhængig, fra rød ved høje koncentrationer (i lysosomer) til grøn ved lave koncentrationer (i cytosolen), med gul som mellemprodukt i nogle betingelser [19]. I vores eksperimenter blev celler podet til en dækglas slide kammer ved 3 × 10

4 per brønd. Efter de udpegede behandlinger, blev de fyldt med AO (5 ug /ml) ved 37 ° C i 15 minutter, skyllet og derefter undersøgt under konfokal mikroskop med excitationsbølgelængde ved 488 nm, mens to separate emissionsbånd (505-570 nm og 615 -754 nm) blev samtidigt indsamlet.

Påvisning af Reactive oxygen Species

Analyse af intracellulær ROS produktion blev udført ved hjælp af en etableret metode [30]. Kort fortalt blev HepG2 celler med angivne behandlinger inkuberet med 10 pM CM-H

2DCFDA ved 37 ° C i 15 og analyseret under et fluorescensmikroskop. Repræsentative billeder af tidsforløb blev udvalgt og fotograferet.

Statistisk analyse

De numeriske data blev præsenteret som gennemsnit ± SD fra mindst 3 uafhængige forsøg. Statistisk analyse blev beregnet under anvendelse af Students

t

-test (to-halet distribution, ulige varians).

(A) Forskellige lysosomer inhibitorer har forskellige virkninger på EGCG-induceret celledød. HepG2-celler blev behandlet i EGCG (60 uM × 24 timer) i serumfrit medium i fravær eller nærvær af forskellige inhibitorer, herunder E64-D (10 pg /ml) + pepstatin A (10 ug /ml), chloroquin (CQ , 25 uM), Baf A1 (50 nM). Cellelevedygtigheden blev bestemt ved Hoechst-PI dobbelt farvning (n = 3, gennemsnit ± SD).

s

værdier blev bestemt ved hjælp af Students

t

-test (*

P

0,05, **

P

0,005). (B) CQ, men ikke Baf A1 blokerer den cytosoliske forsuring induceret af EGCG. HepG2-celler var med EGCG (60 uM), CQ (25 uM) eller Baf A1 (50 nM) i serum-frit medium i 6 timer efterfulgt af farvning med 5 ug /ml AO i 30 minutter og analyseret ved konfokal (skala bar: 20 pm).

(A) EGCG inducerer intracellulær ROS produktion. HepG2-celler blev behandlet med EGCG (60 uM) i 6 timer i fuld medium eller i serumfrit medium Behandling med H

2O

2 (200 uM) i 3 timer blev anvendt som en positiv kontrol. Den intracellulære ROS blev opdaget af CM-H

2DCFDA og analyseret under et fluorescensmikroskop. (B) NAC forhindrer ROS-dannelse induceret af EGCG i serum-frit medium. Cellerne blev behandlet med EGCG (60 uM × 6 timer) i fravær eller tilstedeværelse af N-acetylcystein (NAC, 5 mM). (C) Beskyttelse ved NAC af EGCG-induceret celledød. HepG2-celler blev behandlet ved EGCG (60 uM) eller H

2O

2 (200 uM) som vist i 12 timer i fravær eller nærvær af 5 mM NAC. Cellelevedygtigheden blev bestemt ved Hoechst-PI dobbelt farvning (n = 3, gennemsnit ± SD). **

P

0,005 sammenlignet med gruppen uden NAC (Students

t

-test). (D) NAC forhindrer cathepsin D translokation forårsages af EGCG. HepG2-celler blev behandlet med EGCG (60 uM × 6 timer) med eller uden 5 mM NAC. Både det lysosomale og cytosoliske fraktioner blev analyseret ved western blot. (E) NAC forhindrer EGCG-induceret cytosolisk forsuring. HepG2-celler blev behandlet med EGCG (60 uM × 6 timer) eller H

2O

2 (200 uM × 3 timer) med eller uden 5 mM NAC. Celler blev derefter farvet med AO i 30 minutter og analyseret ved konfokal (skala bar: 20 pm). (F) CQ undlader at påvirke ROS-produktion induceret af EGCG. HepG2 celler blev dyrket i serumfrit medium i 1 time, derefter tilsat 60 uM EGCG, med eller uden nærvær af 20 uM CQ i 6 timer. (G) Illustration til mekanismerne bag EGCG-medieret caspase-uafhængig celledød, der involverer ROS og LMP.

Resultater

Serum Sult Forbedrer EGCG celledød

EGCG tidligere er blevet rapporteret at inducere apoptotisk celledød i en række humane cancercellelinier [31]. En overraskende fund i løbet af vores undersøgelse er, at tilstedeværelsen af ​​10% serum har en stor indvirkning på cytotoksiciteten af ​​EGCG testet. Som vist i figur 1A, HepG2-celler var stort set resistent over for EGCG fuldt medium så højt som 240 uM dyrket i op til 36 timer, mens EGCG er i stand til markant at reducere cellelevedygtigheden af ​​HepG2-celler, når de behandles i serum-frit medium. Lignende virkninger blev observeret i andre humane cancercellelinier, såsom HeLa-celler (data ikke vist). Derfor er vores resultater antyder, at serum sult kan fremme EGCG-induceret celledød.

Næste satte vi at bestemme form for celledød induceret af EGCG i serum-frit medium. For at gøre dette, vi først undersøgt de morfologiske ændringer af kerner med Hoechst farvning. Som vist i figur 1B, var kernerne i celler behandlet med EGCG ikke vise nogen tydelige ændringer, mens tydelig cellekernekondensation blev observeret i celler behandlet med TNFa og CHX, som en positiv kontrol for typiske apoptotisk celledød. Desuden z-VAD-fmk, en generel caspaseinhibitor undladt at beskytte mod EGCG-induceret celledød, mens det fuldstændig forhindret celledød induceret af TNFa og CHX (figur 1C). Konsekvent, var der ingen aktiverede caspase-3 (17 kDa) eller spaltes PARP (89 kDa) detekteres ved western blotting (figur 1 D) i HepG2 celler behandlet med EGCG. I modsætning hertil blev der sådanne apoptose kendetegnende findes i celler behandlet med TNF og CHX og forebygges med z-VAD-fmk. Tilsammen er det tydeligt, at EGCG inducerer celledød under serumfrie betingelser sandsynligvis er caspase-uafhængig ikke-apoptotisk celledød.

EGCG Triggers Cytosoliske vakuolisering Grundet lysosom Dilation i serumfrit medium

En morfologisk træk iagttages under lysmikroskop blev cytosoliske vakuolisering i cellerne behandlet med EGCG i serum-frit medium og den tid og dosis-afhængige ændringer blev præsenteret i figur 2A. Især er en sådan vakuolisering fundet i celler behandlet med EGCG i fuld medium (figur 2B). Lignende resultater blev også fundet i HeLa-celler med den samme behandling (data ikke vist). Sådan vakuolisering var også synlig i celler farvet med hematoxylin, en nuklear farvestof (figur 2B). En anden synlig morfologiske træk i celler behandlet med den højeste koncentration af EGCG i serum-frit medium er tabt af cytosolisk indhold, med øget cellestørrelse (figur 2B).

I betragtning af det nære forhold mellem vakuolisering og celledød, vi derefter forsøgte at finde ud af naturens kilder til de cytosoliske vakuoler. Den vakuolisering blev rapporteret at blive induceret af en lang række induktive stimuli og involverede mange forskellige organeller og strukturer, såsom endoplasmatisk reticulum (ER), Golgi, og lysosom [32]. I vores undersøgelse, vi først afviste, at celleblærerne induceret af EGCG er lipid dråber, som de er negative for farvning med Oil Red O (figur 2C), i modsætning til celler behandlet med OA, der blev anvendt en positiv kontrol. Desuden blev sådanne vakuoler heller ikke forbundet med ER eller Golgi baseret på immunfarvning af respektive markørproteiner (data ikke vist). Interessant, fandt vi, at sådanne vakuoler godt co-lokalisere med lysosomale membranprotein LAMP-1 (figur 2D), hvilket tyder på, at celleblærerne var tæt forbundet med lysosomer.

EGCG Blocks Autophagic Flux

faktum, at serum sult øger EGCG celledød tilskynder os til at undersøge, hvilken rolle autophagy i EGCG-medieret celledød. Det er blevet fastslået, at sult inducerer autofagi og autofagi er nært involveret i celledød processen, enten som en pro-overlevelse eller pro-død mekanisme [33]. For at teste dette, vi først undersøgte autofagi niveauet i celler behandlet med EGCG, ved at analysere LC3-II-niveau, et meget anvendt markør for autophagosomes [34]. Som vist i figur 3A, der var signifikant stigning i LC3-II i EGCG-behandlede celler, i både HepG2 og MEF, i serum-frit medium, men ikke i fuld medium. Ligeledes var der en betydelig stigning af GFP-LC3 puncta i MEF med stabil ekspression af GFP-LC3 (figur 3B). I denne undersøgelse, brugte vi en række metoder til at undersøge, om de øgede autophagic markører observeret i EGCG-behandlede celler skyldes øget autophagic flux eller blokering af autophagosome modning eller nedbrydning på det sene tidspunkt. Første anvendte vi bafilomycin A1 (Baf A1), en inhibitor af lysosomal V-ATPase, at blokere autophagosome-lysosom-fusion [35]. Især Baf A1 ikke yderligere at øge LC3-II niveauer (figur 3C). For det andet undersøgte vi ændringen i P62 proteinniveau. Det er kendt, at p62 selektivt inkorporeres i autophagosomes gennem direkte binding til LC3 og effektivt nedbrudt af autofagi [34]. Vi observerede tydelig akkumulering af p62-protein i både HepG2 og MEF behandlet med EGCG (figur 3A, 3C). Endelig fandt vi, at EGCG behandling væsentligt forbedret co-lokalisering af autophagosome (markeret med GFP-LC3) og lysosomer (markeret med LAMP-1), sammenligne med kontrolcellerne med serum-udsultning (figur 3D). Tilsammen alle ovenfor beskrevne klart data indikerer, at EGCG er i stand til at hæmme autophagic flux ved at blokere den sene fase autolysosome nedbrydning.

EGCG-medieret celledød Uafhængigt af Autophagy

Efter oprettelse af hæmmende virkning af EGCG på autofagi, vi havde til formål at teste, om det sprængte autophagic flux bidrager til EGCG celledød. Her udnyttede vi de m5-7 celler med inducerbar Atg5 sletning [24]. Som vist i figur 4A, tilsætning af doxycyclin (Dox) elimineres Atg5 og skift af LC3-II. Interessant deletion af Atg5 havde ingen virkning på cytosoliske vakuolisering induceret af EGCG (figur 4B), og til sidst celledød (figur 4C). Derfor antages det, at EGCG-medieret celledød er uafhængig af Atg5 eller autofagi.

EGCG inducerer Lysosomal membranpermeabilisering (LMP)

Tidligere data fundet i denne undersøgelse viser muligheden for lysosomale skader forårsaget af EGCG. For yderligere at undersøge de ændringer i lysosomale funktion forårsaget af EGCG, vi først brugt Lyso-Tracker Red (LTR) til at mærke og spore de sure intracellulære rum (lysosomer) i levende celler. Som vist i figur 5A, tilsætning af EGCG markant reduceret fluorescensen i en tidsafhængig måde, hvilket indikerer en reduktion af intracellulære sure komponenter forårsaget af EGCG behandling. Som forventet, behandling af Baf A1 helt afskaffet LTR farvning grund afskaffet lysosomale forsuring.

Som en acidotropic sonde, den faldt LTR fluorescens ikke kun afspejler en stigning i lysosomal pH, men også foreslå muligheden for lysosomale membranpermeabilisering (LMP) [19]. For at bestemme om EGCG kan udløse LMP, fordelingen af ​​cathepsin B og cathepsin D, to centrale lysosomale enzymer, blev sammenlignet ved immunoblots mellem cytosoliske og membranfraktioner. Som vist i figur 5B, var der en tidsafhængig forøgelse af en moden form af cathepsin D i cytosolisk ekstraktion i celler behandlet med EGCG, svarende til reduktionen i membranfraktionen. En sådan tidsmæssig mønster er nemlig i overensstemmelse med nedsættelsen af ​​LTR-farvning er vist i figur 5A, hvilket indikerer en lækage af lysosomal indhold i cytosolen.

EGCG-induceret LMP blev yderligere bekræftet ved farvning af acridinorange (AO) , et lysosomotropiske metachromatisk fluorochrom, som normalt reagerer rødt inde lysosomerne, hvor det er meget koncentreret, og svagt grøn i cytosolen med en lavere koncentration [19]. Som vist i figur 5C, tidsafhængigt EGCG behandling førte til tab af røde puncta i lysosomer, og forøgelse af spredt rød fluorescens i cytosol, med en konsistent tidsmæssig mønster med LTR-farvning og lækage af cathepsin D tidligere vist. Sådanne iagttagelser antyder således, at EGCG forårsager sprængning af lysosom, som derefter udløser en frigivelse af sure indhold fra lysosomale lumen til cytosol, med reduktion af lysosomal syrning og dramatisk stigning i cytosolisk forsuring. Bemærkelsesværdige er nukleinsyre grøn fluorescens blev også forbedret med tiden, hvilket indikerer kerner syrning med forlænget behandling af EGCG (figur 5C). Betydningen af ​​sådanne ændringer i EGCG celledød stadig at blive yderligere undersøgt.

EGCG Fremkalde LMP-afhængige Cell Død

Op til dette punkt, har vi vist, at EGCG inducerer caspase-uafhængig celledød, uafhængigt af autofagi. Endnu vigtigere er, har vi identificeret lysosomet som det vigtigste mål for EGCG, fremgår af lysosomale membranpermeabilisering, tab af cytosolisk forsuring og lysosom dilatation. Her sigter vi at teste, om forringelse af lysosomer spiller en forårsagende rolle i EGCG-induceret celledød. Først brugte vi flere forskellige lysosomer hæmmere og blandt dem, chloroquin (CQ), en lysosomotropiske agent, tilbød den mest effektive beskyttelse mod EGCG-induceret celledød (figur 6A). To cathepsin-inhibitorer (E64-D og pepstatin A) var også effektive, skønt i meget mindre udstrækning.