PLoS ONE: hæmmende effekt Pseudolaric Acid B på mavekræft og multiresistens via Cox-2 /PKC-α /P-gp Pathway

Abstrakt

Sigt

For at undersøge hæmmende effekt af pseudolaric syre B på subkutane xenotransplantater af menneskelig gastrisk adenocarcinom og de underliggende molekylære mekanismer involveret i multiresistens.

Metoder

humane gastriske adenocarcinom SGC7901 celler og lægemiddel-resistente SGC7901 /ADR celler injiceret i nøgne mus til at etablere en subkutan xenograft model. Virkningerne af pseudolaric syre B med eller uden adriamycin behandling blev sammenlignet ved at bestemme tumorens størrelse og vægt. Cyclooxygenase-2 blev protein kinaseC-α og P-glycoprotein ekspressionsniveauerne bestemt af immunhistokemi og western blot.

Resultater

Pseudolaric acid B signifikant undertrykte tumorvækst fremkaldt af SGC7901 celler og SGC7901 /ADR-celler. Kombinationen af ​​pseudolaric syre B og den traditionelle kemoterapi narkotika adriamycin udstillet mere potente hæmmende på væksten af ​​mavekræft in vivo end behandling med enten pseudolaric syre B eller adriamycin alene. Protein ekspressionsniveauer af cyclooxygenase-2 blev protein kinaseC-α og P-glycoprotein inhiberet af alene eller i kombination med adriamycin i SGC7901 /ADR celle xenotransplantater pseudolaric syre B.

Konklusion

Pseudolaric syre B har en signifikant inhiberende virkning og et additiv inhiberende virkning i kombination med adriamycin på væksten af ​​gastrisk cancer in vivo, som vender multilægemiddelresistens af gastrisk neoplasme til kemoterapi narkotika ved nedregulering Cox-2 /PKC-α /P- gp /MDR1 signalvejen

Henvisning:. Sun Q, Li Y (2014) Den hæmmende effekt af Pseudolaric Acid B på mavekræft og multiresistens via Cox-2 /PKC-α /P-gp pathway. PLoS ONE 9 (9): e107830. doi: 10,1371 /journal.pone.0107830

Redaktør: Soumitro Pal, Børnehospital Boston Harvard Medical School, USA

Modtaget: 15. maj 2014; Accepteret: August 20, 2014; Udgivet: 24 september, 2014

Copyright: © 2014 Sun, Li. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Science Program Foundation of Shenyang Municipal Videnskab og Teknologi Bureau (1091136-9-02). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er en af ​​verdens mest almindelige kræftformer [1], og kemoterapi er en vigtig strategi mod mavekræft [2]. Fordi flere kemoterapeutiske lægemidler af forskellige klasser anvendes til behandling af gastrisk cancer, følsomheden af ​​anticancerlægemidler til gastrisk cancer aftager gradvist, og kan forekomme resistens over for mange forskellige lægemidler med forskellige kemiske strukturer og forskellige virkningsmekanismer. Denne type resistens kaldes multilægemiddelresistens (MDR) og signifikant nedsætter effektiviteten af ​​behandlingen på mavekræft. MDR er ved at blive et stort problem for en vellykket behandling af kræft [3]. Det har vist sig, at den største årsag til MDR i cancer er overekspressionen af ​​P-glycoprotein (P-gp), et produkt fra det humane MDR1-gen. P-gp er en ATP-afhængig efflux pumpe, der kan formindske akkumulering i cancerceller. Det foreslås, at P-gp, et godt accepteret biomarkør for MDR, også skal betragtes som en molekylært mål i multiresistente cancer [4]. Nylige undersøgelser har vist, at i cancerceller med MDR, er ekspressionsniveauerne af cyclooxygenase-2 (COX-2) og en isoform af protein kinaseC (PKC-α) både opreguleres, og deres inhibering kan vende neoplastisk MDR [5] – [10].

Pseudolaric syre B (PAB, figur 1), en diterpen syre isoleret fra roden og stammen bark af træet

guldlærk kaempferi

Gordon (Pinaceae), der bruges i traditionel kinesisk medicin for sit brede spektrum af biologiske funktioner, såsom anti-fungale virkninger og anti-fertilitet virkninger. Desuden dets antiangiogene virkninger er også blevet gradvist anerkendt i de senere år [11], [12]. Nyere undersøgelser har vist, at PAB inducerer væksthæmning cellecyklusstop og apoptose. Desuden PAB vender multilægemiddelresistens af cancerceller [13], [14]. PAB undertrykker væksten af ​​mavens neoplastisk AGS cellelinie og inducerer dets apoptose [15]. Vores tidligere forskning vist, at PAB har også en dramatisk hæmmende virkning på human gastrisk cancer SGC7901 celler in vitro [16]. Men in vitro-undersøgelser af anticancer effekt af PAB er sjældne, og hverken in vivo effekten af ​​denne roman urte sammensatte mod tumorer eller dens præcise molekylære mekanisme mod MDR er fuldt undersøgt.

Formålet med den foreliggende undersøgelse er at vurdere antineoplastisk effekt af PAB in vivo, herunder tilbageførsel af MDR under anvendelse af en xenotransplantat-model i nøgne mus og undersøge, om PAB underliggende molekylære mekanisme er relateret til inhiberingen af ​​MDR via Cox-2 /PKC-α /P-gp-vejen.

Materialer og metoder

Materialer

RPMI-1640 dyrkningsmedium og føtalt bovint serum (FBS) til celledyrkning blev indkøbt fra Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA. Kanin-anti-COX-2-monoklonalt antistof muse-anti-PKC-a og muse-anti-P-gp monoklonale antistoffer blev indkøbt fra Santa Cruz Corporation, CA, USA. Sekundære antistoffer mod kanin- og museantistoffer, streptavidin-peroxidase (SP) kits, og 3,3′-diaminobenzidin (DAB) blev opnået fra Beijing Zhongshan Biotechnology, Kina. BCA proteinassay kits og SDS-PAGE-gel forberedelsesmateriale blev opnået fra Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, Kina. PAB blev købt fra Liaoning Institute for Drug Control Kina No. 201.003 (renheden: 98%). Adriamycin (ADR) blev opnået fra Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Ltd., Kina No. 120906. Tween80 og polyethylenglycol blev købt fra Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA.

Cell kultur

Humane gastriske adenocarcinom SGC7901 celler blev dyrket i det centrale laboratorium Shengjing Hospital Tilknyttet til Kina Medical University [16], og adriamycin-resistente SGC7901 /ADR celler blev begavet fra Institut for Digestive Diseases i Xijing Hospital Tilknyttet til fjerde Military Medical University [17]. Humane gastriske adenocarcinom SGC7901 celler og adriamycin-resistente SGC7901 /ADR-celler blev dyrket i RPMI-1640 medium suppleret med 10% FBS og antibiotika (100 U /ml penicillin og streptomycin) med 5% CO

2 i en fugtig inkubator ved 37 ° C. ADR (1 ug /ml) blev tilsat til SGC7901 /ADR cellekulturmedium for at bevare deres MDR. Celler i den logaritmiske vækstfase blev centrifugeret og fortyndet med RPMI-1640-medium til fremstilling af enkelt-cellesuspensioner med en koncentration på 2,5 × 10

6 /ml til såning.

Etablering af en nøgen mus xenograftmodel

in vivo antitumor effekt af PAB blev undersøgt i en murin xenograft model. For modellen, 4-6 uger gamle mandlige og kvindelige immundefekte BALB /c (nu /nu) mus, der vejer 18 til 22 g, blev købt fra Beijing HFK Bioscience Co, Ltd (Kina) og holdes i akkrediterede faciliteter under standardbetingelser for gnavere (SPF klasse) i Institut for Laboratory Animal Science. Halvtreds mus blev udvalgt i tilfældig orden i to grupper (25 per gruppe). I alt 25 mus blev subkutant injiceret med 2,5 x 10

6 /ml SGC7901 celler i 0,2 ml RPMI-1640 medium ind i venstre aksillerne, og de andre 25 mus blev injiceret med SGC7901 /ADR-celler i den højre armhulen under kimfri betingelser.

Eksperimentelle grupper og medicin

Syv dage efter celleimplantation, tumorerne blev palpable (tilnærmelsesvis 3 mm x 3 mm i diameter), og derefter, de to grupper injiceret med to forskellige typer celler blev tilfældigt inddelt i fem undergrupper (5 mus pr gruppe): normalt saltvand (NS) kontrolgruppen, TWEEN kontrolgruppen, ADR gruppe, PAB gruppe, og PAB + ADR gruppe. For PAB grupper, PAB (25 mg /kg /d i 0,1 ml) opløst i en vandig opløsning af 6% polyethylenglycol, 3% ethanol, og 1% Tween80 blev administreret intraperitonealt (i.p.) dagligt i 20 dage [13]. Et identisk volumen af ​​vandig opløsning eller NS blev injiceret i TWEEN kontrolgruppen eller NS kontrolgruppen henholdsvis. For ADR gruppe, ADR (1,25 mg /kg i 0,1 ml) fortyndet i NS blev administreret intraperitonealt dagligt i 20 dage [18]. Tumorbærende mus fik indgivet både Pab (25 mg /kg /d) og ADR (1,25 mg /kg /dag) i.p. i samme periode i PAB + ADR gruppe. Efter behandling blev mus fra hver gruppe aflivet, og tumorprøver bilaterale armhuleregioner blev vejet og resektion til immunhistokemisk og western blot-analyser. Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af Udvalget for den etiske af dyreforsøg i Shengjing Hospital Tilknyttet til Kina Medical University (Permit nummer: 2013PS144K). Mus blev aflivet under 10% chloralhydrat anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

Måling og beregning af tumor volumen og vægt

Kropsvægten blev overvåget hver dag, og to vinkelrette diametre (længde og bredde i millimeter) af tumorer blev målt hver anden dag med passere hele behandlingsperioden. Tumorvolumener blev estimeret ved hjælp af to-dimensionelle målinger og beregnes som følger: tumor volumen (mm

3) = længde (mm) x bredde

2 (mm) /2. Den relative tumorvolumen (RTV) blev beregnet som følger: RTV = (middel tumorvolumen under behandling) /(gennemsnitlig tumorvolumen i begyndelsen af ​​behandlingen). De antitumorvirkninger af PAB og /eller ADR blev estimeret med den gennemsnitlige inhibering rate (IR) af tumorvækst ved hjælp af følgende ligning: IR (%) = [(1-middelværdi RTV af lægemiddel-behandlede gruppe /middelværdi RTV NS kontrolgruppe ) × 100] [19]. Den relative kropsvægt af mus blev beregnet ved hjælp af W

t /W

0-indeks, hvor W

t var kropsvægten på dagen for målingen, og W

0 var kropsvægt ved den første behandlingsdag. Ændringen i kropsvægt på dag 1 og 20, der repræsenterer begyndelsen og slutningen af ​​forsøget, henholdsvis blev brugt til at evaluere og analysere virkningerne af lægemidler på kropsvægt [20].

immunhistokemisk farvning for ekspression af Cox-2 blev PKC-a og P-gp

tumorprøver fikseret med paraformaldehyd, behandlet rutinemæssigt ved indlejring i paraffin, og derefter skåret i 4-um snit. Efter hematoxylin og eosin (HE) farvning blev celler af mavekræft xenotransplantater observeret under et lysmikroskop. Ekspressionsniveauerne af Cox-2, blev PKC-α og P-gp i høstede tumorceller bestemt under anvendelse af SP-metoden. Kort fortalt, efter at være blevet afvokset og rehydreret blev objektglassene inkuberet i 0,3% H

2O

2-opløsning og tørret i en mikrobølgeovn i citronsyre-buffer i 15 min for at hente antigener. Skiverne blev blokeret med normalt gedeserum i 30 minutter ved 37 ° C og probet med et kanin-monoklonalt antistof til Cox-2 og muse-monoklonale antistoffer mod PKC-α og P-gp ved 4 ° C natten over (alle antistoffer blev fortyndet ved 1 :300). Biotinyleret anti-kanin-IgG og anti-rotte IgG blev tilsat og inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter før enzym konjugeret HRP-streptavidin blev tilsat. Desuden, 3, 3′-diaminobenzidin (DAB) anvendt som chromogen. Objektglas blev modfarvet med hematoxylin, dehydreret i alkohol, og monteret på neutral balsam. Kontroller blev fremstillet ved hjælp af kun sekundære antistoffer. Fem områder af hvert afsnit fra hver mus i hver gruppe blev udvalgt til billedsamling. Resultaterne blev analyseret og sammenlignet statistisk ved anvendelse af NIS-Elements Br 3,0 software, og den gennemsnitlige optiske densitet blev opnået at kvantificere ekspressionsniveauerne af Cox-2, PKC-α og P-gp.

Western blot af Cox -2, PKC-α og P-gp i nøgne mus xenotransplantater

i alt 100 mg af frisk-frosne tumorvæv fra mindst tre mus fra hver gruppe blev vejet og suppleret med radio immunpræcipitationsassay (RIPA) lysepuffer [indeholdende 100 ug /ml phenylmethansulfonylfluorid (PMSF)]. Efter pulveriseret ved anvendelse af en saks, blev ekstrakter homogeniseret ved hjælp af ultralyd. Efter centrifugering ved 14.000 rpm ved 4 ° C i 30 minutter blev en supernatant prøve nedfrosset ved -80 ° C i western blotting. Proteinkoncentrationen af ​​ekstrakterne blev bestemt under anvendelse af en bicinchoninsyre (BCA) proteinassaykit. I alt 100 ug protein pr mus under denaturerende betingelser (100 ° C, 5 min) blev elektroforesebehandlet under anvendelse af natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) på 8% separation gel og elektrooverført til PVDF-membraner ved hjælp af en våd transfersystem på 100 V (Cox-2, PKC-α, β-actin i 100 min, og P-gp i 3 timer). Efter blokering med 5% fedtfri tørmælk i 1 × TBST (Tris-bufret saltvand indeholdende 0,1% Tween 20) i 90 minutter blev membranerne derefter inkuberet med det primære antistof [kanin-monoklonalt antistof til Cox-2 (1:400) eller muse monoklonale antistoffer mod PKC-α (1:200) og P-gp (1:200), med β-actin som en intern kontrol for protein loading] natten over ved 4 ° C. Antistoffet binding blev visualiseret ved anvendelse af en peroxidase-koblet sekundært gede-anti-kanin-antistof (1:2000) og gede-anti-muse-antistof (1:2000) i 1,5 time ved stuetemperatur. Derefter blev membranerne visualiseret ved forøget kemiluminescens (ECL) reagens. Resultaterne blev analyseret ved anvendelse Billede J software.

Statistisk analyse

Alle data præsenteres som middelværdier ± standardafvigelse, og flere sammenligninger mellem hvilke som helst to af de behandlede grupper blev evalueret ved en- vejs ANOVA under anvendelse SNK og LSD metoder med SPSS 17.0 software. Forholdet mellem legemsvægtændring og tumorvolumen blev analyseret ved Pearson korrelationsanalyse. p-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

hæmmende virkning af PAB på væksten af ​​humane mavekræft

Tumorer i alle behandlede grupper dannet umiddelbart efter implantation af enkelt-cellesuspensioner, og dannelseshastigheden var 100%. Når xenotransplantater blev klart, var der ingen signifikante forskelle i den gennemsnitlige størrelse af de xenotransplantater mellem de forskellige grupper (tabel 1), og tumorvolumener blev overvåget på forskellige tidspunkter i alle grupper. Kurver af tumorvækst af de to cellelinier blev afbildet grafisk (figur 2A, 2B). Som vist i tabel 1, for SGC7901 celle-behandlede grupper, blev der ikke observeret nogen signifikant forskel mellem PAB gruppen og ADR gruppe i de gennemsnitlige relative mængder af xenotransplantaterne (p 0,05), og IR var 56,4% og 59,0%, henholdsvis. Tilføjelsen af ​​ADR til PAB resulterede i højere antitumoraktivitet end PAB alene eller ADR alene (p 0,05) med en IR på 88,1%. Den inhiberende virkning af PAB gruppen var stærkere sammenlignet med den for ADR gruppe på xenotransplantater af SGC7901 /ADR-celler, og IR-værdier var 64,1% og 21,9% (p 0,05). Tumorvæksthæmning var mere tydelig i mus behandlet med PAB kombineret med ADR, med en IR på 85,8%. Resultaterne af tumorvægt i forskellige grupper yderligere understøttet vores resultater med hensyn til mængden af ​​mus xenotransplantater. Figur 2C og 2D viser ændringerne i den relative legemsvægt af musene i de ti grupper. Kroppen vægt var ens mellem kontrolgrupperne og PAB-behandlede grupper. Imidlertid kropsvægten faldt, i kombination-behandlede grupper og ADR-grupper, og faldet i ADR grupperne var mere indlysende (p 0,05). Desuden Figur 3 giver en direkte sammenligning af tumor størrelser af SGC7901 celler og SGC7901 /ADR celler i de forskellige grupper. Forholdet mellem legemsvægtændring og tumorvolumen var ikke signifikant (p 0,05). De doser testede blev godt tolereret af musene, og ingen dyr dødelighed blev observeret under forsøget

A:. Vækstkurve af SGC7901 celle implanteret B: vækstkurve af SGC7901 /ADR celle implanteret C: relative kropsvægt ændring af mus med SGC7901 celle implanteret D: relative kropsvægt ændring af mus med SGC7901 /ADR celle implanteret. SGC7901 celler og SGC7901 /ADR-celler (2,5 x 10

6 /ml) blev injiceret subkutant i de axillære områder af nøgne mus, og hvor der blev observeret tydelige tumorer, modtog musene en daglig dosis på 25 mg /kg pseudolaric syre B og /eller 1,25 mg /kg adriamycin eller normalt saltvand (kontrol) /Tween-opløsning (kontrol) (n = 5 pr gruppe). Tumorvolumener blev overvåget på forskellige tidspunkter (Day1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19). IR af tumorvækst i de lægemiddelbehandlede grupper blev sammenlignet med den i kontrolgrupperne ved slutningen af ​​eksperimentet ved envejs ANOVA. *

s

0,05 vs kontrolgruppe

A:. Isolerede tumorer i SGC7901 celler (ovenfor) og SGC7901 /ADR celler (herunder) B: subkutane xenotransplantater af SGC7901 cellelinje i nøgne mus C: subkutane xenotransplantater af SGC7901 /ADR cellelinje i nøgne mus. (Gruppe 1): NS kontrolgruppe (gruppe 2): TWEEN kontrolgruppen (gruppe 3): ADR gruppe (gruppe 4): PAB-gruppe (gruppe 5): PAB + ADR gruppe

immunohistokemisk farvning for ekspressionen af ​​cox-2, PKC-α og P-gp

Alle tumorer i hver gruppe, via immunhistokemisk farvning, viste positiv ekspression af cox-2, PKC-α og P- gp proteiner. Cox-2 og PKC-α ekspression blev defineret som positiv, hvis den farvede region af tumorcellerne var i cytoplasmaet, og P-gp-farvning blev betragtet positiv, hvis farvning blev observeret i membranen og cytoplasma. Proteinerne blev farvet gul eller brun under optisk mikroskop observation (figur 4). For SGC7901 /ADR-cellelinie, farvningen af ​​disse proteiner i kontrolgrupperne var stærkere end i de andre grupper (p lt; 0,05). PAB behandling reducerede intracellulære farvning af Cox-2, PKC-α og P-gp sammenlignet med ADR-behandlede gruppe (p 0,05). Efter PAB og ADR behandling, den intracellulære farvning af disse proteiner var sparser og svagere sammenlignet med de andre grupper. For xenotransplantater af de to NS kontrolgrupper, farvningen af ​​P-gp i SGC7901 celler var signifikant lavere end den for SGC7901 /ADR-celler (p 0,05). Analysen af ​​farvning intensiteten af ​​Cox-2, PKC-α og P-gp-ekspression afslørede de samme resultater (tabel 2)

A:. Ekspression af COX-2 i mus xenotransplantater B: ekspression af PKC- α i mus xenotransplantater C: ekspression af P-gp i mus xenotransplantater D: negativ kontrol E: xenotransplantat af HE F: normal gastrisk væv ved HE. Væv blev fikseret, indlejret, monteret og farvet ved SP metode eller HE farvning anvendelse af standardprocedurer. Scale bar, 25 um.

Effekt af PAB på Cox-2, PKC-α, og P-gp-ekspression i mus implanteret

For at belyse den molekylære mekanisme er involveret i tilbageførslen virkninger PAB på SGC7901 /ADR xenotransplantater in vivo, ekspressionen af ​​cox-2, PKC-α og P-gp i tumorer fra forskellige reagens-behandlede grupper blev bestemt ved Western blot-analyse. Som vist i figur 5, for NS kontrolgruppen, blev ekspressionsniveauerne af Cox-2, PKC-α, og P-gp i SGC7901 celle xenotransplantater lavere sammenlignet end de i SGC7901 /ADR celletumorer (p 0,05) . For tumorer i SGC7901 /ADR-celler, ekspressionsniveauerne af de tre proteiner af interesse i kontrolgruppen og TWEEN kontrolgruppen NS var signifikant højere sammenlignet med de andre grupper (p lt; 0,05), og der var ingen signifikant forskel mellem to grupper (p 0,05). Ekspressionsniveauerne af Cox-2, PKC-α, og P-gp i PAB-behandlede gruppe var signifikant lavere sammenlignet med dem for ADR-behandlede gruppe (p 0,05). Udtrykket af β-actin blev anvendt som en intern kontrol, og ekspressionsniveauerne af Cox-2, PKC-α, og P-gp blev nedsat sekventielt blandt kontrolgrupperne, ADR gruppe, PAB-gruppe og PAB + ADR (p 0,05 vs kontrolgruppen

Diskussion

PAB er en af ​​de vigtigste biologisk aktive komponenter i roden bark af lægeplante

guldlærk kaempferi

og viser betydelig cytotoksicitet mod flere cancer cellelinjer. In vitro undersøgelser har også vist, at det vender MDR af karcinom ved at hæmme overekspression af P-gp uden åbenlyse bivirkninger [13], [15], [20], [21]. Det er også blevet påvist, at PAB har en antitumorvirkning hos mus xenograftmodeller af human coloncancer og hepatocellulært carcinom [13], [20], og ingen kendte bivirkninger af PAB på dyr er blevet indberettet. Vores tidligere undersøgelse viste at PAB har en kraftig inhiberende virkning på SGC7901 cellelinie in vitro og inducerer apoptose af gastriske cancerceller via caspase pathway [16]. Vores nuværende in vivo undersøgelse giver yderligere bevis på, at PAB er beskyttende mod gastriske tumorer i murine xenograftmodeller hjælp SGC7901 celler og SGC7901 /ADR celler. Vores indledende eksperimenter har vist, at PAB ved 25 mg /kg ikke kun hæmmer væksten af ​​gastrisk cancer, men er også godt tolereret af mus. Desuden har vi inkluderet TWEEN kontrolgruppen for at udelukke indflydelsen af ​​den vandige opløsning, der anvendtes til opløsning PAB på tumorer [13]. For sensitive celler, anticancer effekter af PAB produceret ingen signifikante forskelle i forhold til ADR, en traditionel kemoterapi stof. Desuden PAB er en biologisk aktiv forbindelse, der udøvede sin vende virkning mod SGC7901 /ADR cellelinje tumorer ved at målrette signalvejen aktiveres af P-gp overekspression in vivo.

P-gp har 170 kDa-membran protein, der fungerer som et lægemiddel efflux pumpe, hvilket resulterer i en kontinuerlig defekt i den intracellulære akkumulering af lægemidler [22]. Multidrug resistens fænotype er den største årsag til tumor kemoterapi svigt og er hovedsagelig produktet af overekspressionen af ​​P-gp i størstedelen af ​​cancere, herunder gastriske neoplasmer [23]. Endvidere kan inhibering af denne vej være en måde at vende MDR af gastriske cancerceller [3], [24].

Cox-2, et inducerbart enzym, der katalyserer omdannelsen af ​​arachidonsyre til prostanoider ( PG) og deltager i flere fysiologiske og patologiske begivenheder, induceres af forskellige inflammatoriske og mitogene stimuli [25]. En stærk forbindelse mellem MDR og overekspressionen af ​​COX-2 er blevet rapporteret i mange forskellige typer af tumorer. Disse tidligere resultater tyder på, at Cox-2 modulerer ekspressionen og aktiviteten af ​​P-gp og er involveret i udviklingen af ​​MDR-fænotypen [26] – [28]. Desuden har akkumuleret beviser vist, at Cox-2-inhibitorer er i stand til at sensibilisere cancerceller over for anti-proliferative virkninger af kemoterapeutiske lægemidler ved at ændre aktiviteten af ​​ATP-bindende kassette-protein. Cox-2 hæmmere kan endda vende MDR ved at blokere cox-2-medieret stigning i MDR1-ekspression og aktivitet i cancer, både in vitro og in vivo [6], [7], [29]. Derfor er vi hypotesen, at Cox-2 kan regulere ekspressionen af ​​P-gp i tumorvæv og at hæmme denne vej er af stor betydning for at vende modstanden af ​​kræft til kemoterapeutiske stoffer.

Vi fandt, at for SGC7901 /ADR-celle tumorer, ekspressionsniveauerne af Cox-2 og P-gp i NS kontrolgruppen var åbenbart højere end for de xenotransplantater af SGC7901 celler. Efter injektionen af ​​PAB iagttoges en tydelig nedgang i disse ekspressionsniveauer. Dog ADR var mindre effektiv til undertrykkelse af COX-2 og P-gp ekspressionsniveauer af SGC7901 /ADR celle xenotransplantater, og når de kombineres med PAB blev der observeret et lavere niveau af proteiner. Foreslog vi, at modulering af Cox-2-ekspression ved PAB kunne formindske ekspressionen og aktiviteten af ​​P-gp, hæmme væksten og inducere apoptose, foruden handler samvirkende med ADR i undertrykkelsen af ​​lægemiddelresistente tumorer og selv tilbageførsel af MDR-fænotypen af ​​gastrisk cancer.

PKC er en serin /threonin-kinase involveret i signaltransduktion kræves til cellulær proliferation og differentiering [30]. Af de PKC isoformer, er det overekspression og øget aktivitet af PKC-α mest tæt forbundet med reguleringen af ​​MDR fænotype i human gastrisk cancer [31]. Resultaterne præsenteret her støtter den antagelse, at PKC-α phosphorylerer P-gp, modulerer P-gp efflux funktion, og i sidste ende fører til medikamentresistens [32]. Inhiberingen af ​​PKC-α med en specifik inhibitor eller vælte PKC-α med siRNA medfører reduceret MDR1 ekspression, øget toksicitet af anticancerlægemidler, og omvendt MDR [8] – [10]. Derfor spekulerer vi, at en PKC-α signaltransduktion system kan spille en rolle i modulering MDR1 ekspression i gastrisk cancer.

Under normale omstændigheder, PKC er inaktive i celler, og dets aktivering er relateret til opstrøms PGE aktivering. COX-2 er koblet til membranassocieret prostaglandin E2 syntase (MPGES-1), og syntesen af ​​PGE medieret af disse proteiner stiger og aktiverer den nedstrøms PKC-α pathway [33]. Det er blevet påvist, at selektiv Cox-2-inhibering med specifikke inhibitorer eller siRNA har en terapeutisk virkning på inhibering af ekspressionen af ​​PKC-α og P-gp, samtidig med, samtidig, vende MDR [26], [34]. En undersøgelse har vist, at PGE2 medierer induktion af MDR1-ekspression via PKC pathway [35]. Resultaterne af vores eksperimenter viste, at PAB kan hæmme PKC-α udtryk for xenografter af SGC7901 /ADR-cellelinie, som bevirker var stærkere end ADR. Hertil kommer, når PAB blev kombineret med ADR, PKC-α ekspression inhiberingseffektivitet var endnu stærkere. Variationen tendens PKC-α-ekspression er konsistent med Cox-2 og P-gp i forskellige reagens-behandlede grupper af lægemiddelresistente SGC7901 /ADR tumorer. Det er blevet vist, at PAB inducerer vækststandsning og apoptose gennem inhibere Cox-2 pathway i cancerceller [20], [21]. Vi hypotesen, at PAB inhiberer ekspressionen af ​​cox-2 i SGC7901 /ADR celle xenotransplantater og at koblingen mellem Cox-2 og MPGES-1 reducerer syntesen af ​​PGE, hvilket reducerer aktivering af nedstrøms PKC-α. Som phosphoryleringen af ​​P-gp inhiberes, flere lægemidler ophobes i kræftceller, toksiciteten af ​​ADR forstærkes og MDR er vendt. Disse resultater giver indsigt i en ny strategi indebærer anvendelse af PAB at inhibere MDR af humane gastriske cancere.

Et fokus for vores eksperiment er den inhiberende virkning af pseudolaric syre B på subkutane xenotransplantater af humant gastrisk adenocarcinom og sammenligningen af antitumorvirkninger af stoffer blandt forskellige behandlingsgrupper. Desuden karakteristisk for SGC7901 celler og SGC7901 /ADR-celler er forskellige. Gennem vores to pre-eksperiment og en formel eksperiment, fandt vi alle tumorens volumen SGC7901 /ADR-celler var ikke større end SGC7901 celler. Vi hypotesen tumorvolumen kan være forbundet med den celletal, vækst tid, karakteristisk for celler og andre former for faktorer. Derfor har vi ikke sammenlignet tumor volumen mellem SGC7901 celle implanteret og SGC7901 /ADR celle implanteret. Derudover har vi spekulere, at kroppen vægtændring af mus kan være hovedsageligt relateret til toksicitet af lægemidler, og har ikke signifikant sammenhæng til svulsten volumen i vores eksperiment.

Den anden fokus for vores eksperiment er den underliggende molekylære mekanismer involveret i multilægemiddelresistens. Vi har således kun beregnet NS kontrolgruppe af SGC7901 celle implanteret til kontrast og bekræfte udtryk for de tre typer af protein fra SGC7901 /ADR celle implanteret er faktisk væsentligt højere end fra SGC7901 celle implanteret. Desuden, eftersom reaktion SGC7901 celler til anticancerlægemidler er noget mere følsom end SGC7901 /ADR-celler i både grundlæggende og kliniske forsøg, hvordan man kan forbedre følsomheden af ​​multilægemiddelresistens celler til anticancerlægemidler er vores forskning fokus. Derfor har vi ikke sammenlignet udtrykkene for Cox-2, PKC-α og P-gp for tumorerne fra SGC7901 og de forskellige behandlinger af denne gruppe undtagen NS kontrolgruppen ved western blot og immunhistokemisk farvning.

Vores undersøgelse opdagede, at naturlægemidler diterpenoid PAB ikke kun væsentligt undertrykt mavekræft SGC7901 celler in vivo, men også viste tydelige hæmmende virkninger mod tumorer af resistente SGC7901 /ADR celler. Desuden kunne kombinationen af ​​PAB med ADR hæmme væksten af ​​mavekræft og udvikling af xenografter i nøgne mus. Det er værd at nævne, at som en form for traditionel kinesisk medicin, virkningen af ​​PAB på legemsvægten af ​​nøgne mus var helt lavere end for ADR i vores eksperiment, som er en tilsyneladende fordel, der gør PAB en mere sikker og tolerabel lægemiddel til cancerterapi. PAB måske ikke kun være et nyt effektivt lægemiddel til inhibering af væksten af ​​mavekræft og vende dens MDR, men det kan også bruges som en fremragende adjuvans med traditionelle kemoterapeutika og kirurgisk behandling efter yderligere udvikling og forskning.

i den foreliggende undersøgelse undersøgte vi, for første gang, den inhiberende virkning af PAB mod humant mavekræft og dens tilbageførsel virkning på MDR in vivo via en xenotransplantat nøgen musemodel. Vi bestemt, at dets hæmning af MDR blev formidlet gennem Cox-2 /PKC-α /P-gp vej, som giver en afgørende teoretisk grundlag om de molekylære mekanismer i mavekræft terapi. Vi har dog ikke undersøgt MDR mekanisme i forhold til genekspression og regulering. Som de molekylære mekanismer i at vende MDR er overordentligt komplicerede og flere typer af proteiner, gener og faktorer kan være involveret, kan løkken som vi har foreslået være kun en del af mekanismen til at vende MDR. Mere dybdegående og mekanismer konkrete regulering skal belyses i fremtidige studier.

Som konklusion, PAB har en betydelig hæmmende effekt på mavekræft in vivo og kan vende MDR af gastrisk kræft til kemoterapi narkotika. Mekanismen mod MDR medieres i det mindste delvist gennem Cox-2 /PKC-α /P-gp-vejen. Vores undersøgelse giver brede perspektiver for fremtidige undersøgelser af PAB i mavekræft terapi.

Støtte oplysninger

Tjekliste S1.

ARRIVE Retningslinjer Tjekliste

doi:. 10,1371 /journal.pone.0107830.s001

(DOC)