PLoS ONE: Tensin3 er en negativ regulator af Cell Migration og alle fire Tensin familiemedlemmer nedreguleres i Human nyrekræft

Abstrakt

Baggrund

Tensin familie af intracellulære proteiner (Tensin1, -2, -3 og -4) menes at fungere som forbindelse mellem den ekstracellulære matrix og cytoskelettet, og derved formidle signalering for celleform og motilitet. Dysregulering af Tensin ekspression er tidligere blevet impliceret i human cancer. Her har vi for første gang evalueret betydningen af ​​alle fire Tensins i en undersøgelse af menneskets renalcellecarcinom (RCC), samt undersøgt den biologiske funktion af Tensin3.

vigtigste resultater

Angivelse af Tensin2 og Tensin3 på mRNA og protein niveauer var stort set fraværende i et panel af forskellige humane kræftceller. Kvantitativ RT-PCR-analyse afslørede mRNA ekspressionen af ​​alle fire Tensin gener at være signifikant nedreguleret i humane nyre tumorer (50-100% reduktion i forhold til normal nyre cortex;

P

0,001). Endvidere mRNA udtryk for Tensins meste korreleret positivt med hinanden og negativt med tumorklassificering, men ikke tumorstørrelse. Immunohistokemisk analyse afslørede Tensin3 at være til stede i cytoplasmaet af tubulære epitel i normale humane nyre sektioner, mens ekspression var svagere eller fraværende hos 41% af nyre tumorer. En undergruppe af tumor sektioner viste en privilegeret plasmamembran udtryk for Tensin3, som i klare celle RCC patienter blev korreleret med længere overlevelse. Stabil udtryk for Tensin3 i HEK 293 celler markant hæmmet både celle migration og matrix invasion, en funktion uafhængig af formodet fosfataseaktivitet i Tensin3. Omvendt siRNA knockdown af endogen Tensin3 i humane cancerceller øget deres migration markant.

Konklusioner

Vores resultater tyder på, at Tensins kan repræsentere en ny gruppe af metastase undertrykkere i nyren, tab af hvilket fører til større tumorcellemotilitet og deraf følgende metastase. Endvidere kan tumorigenese i den humane nyre lettes ved en generel nedregulering af Tensins. Derfor kan anti-metastatiske terapier gavn af at genoprette eller bevare Tensin udtryk i primære tumorer

Henvisning:. Martuszewska D, Ljungberg B, Johansson M, Landberg G, Oslakovic C, Dahlback B, et al. (2009) Tensin3 er en negativ regulator af Cell Migration og alle fire Tensin familiemedlemmer nedreguleres i Human nyrekræft. PLoS ONE 4 (2): e4350. doi: 10,1371 /journal.pone.0004350

Redaktør: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland

Modtaget: August 20, 2008; Accepteret: 15. december 2008; Publiceret: 4 februar 2009

Copyright: © 2009 Martuszewska et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Svensk forskning Rådet (Vetenskapsrådet), den Cancer Foundation, Alfred Österlund Trust, Malmö Universitetshospital Trust, Malmö Universitetshospital Cancer Trust, Greta og Johan Kock Trust, Crafoord Trust, og Royal fysiografiske Society i Lund. D.M. blev støttet af et stipendium fra Anna-Greta Crafoord Trust. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

The Tensins udgør en familie af intracellulære proteiner, der kommer i forgrunden som nye regulatorer af celle motilitet og vækst. Den Tensin familien består af fire medlemmer: Tensin1, Tensin2, Tensin3 og Tensin4 (TNS1, TNS2, tNS3, TNS4) hver med diskrete ekspressionsmønstre i den menneskelige krop [1], [2]. Baseret på deres fælles domæner, de Tensins har potentiale til at interagere med plasmamembranen (C1-domæne) såvel som binder til tyrosiner (SH2 og PTB domæne) i integriner [3] og receptor (RTK’er) [1].

Desuden Tensins 1-3, men ikke -4, indeholde en phosphatase (PTPase) C2 domæne par, der er homolog til den i PTEN tumorsuppressorproteinet [4], [5]. Men den potentielle lipid PTPase aktivitet Tensins 1-3, såvel som deres formodede interaktioner med actincytoskelettet stadig, der skal fastlægges. Tensin1 var det første medlem identificeret, og er lokaliseret til fokale sammenvoksninger i celler [6]. Vi identificerede Tensin2 (også kendt som C1-TEN, TENC1) som en bindende partner for Axl RTK gennem sin SH2-PTB region [1]. Tensin3 har næsten det samme domæne organisationen som C1-TEN, og interagerer med EGF-receptoren på [7]. Tensin4 er en kortere protein, der ikke forventes at interagere med cytoskelettet, mens den indeholder SH2-PTB-domæner i lighed med de andre Tensins [8].

Den funktionelle konsekvens af Tensin interaktioner antyder regulering af membran receptorsignalering der er knyttet til styring af cytoskeletale dynamik. Dette har derfor implikationer for cellemotilitet i den metastatiske proces. For eksempel i brystcancerceller blev Tensin3 vist at forankre integriner til cytoskelettet, hvilket gør cellen mindre motile og derved mindre i stand til metastaserende [9]. Omvendt stimulering med epidermal vækstfaktor (EGF) opregulerer Tensin4, som er et kortere protein, der kunne mangle actinbindende regioner, men som stadig interagerer med integriner. Denne mobilisering af Tensin4 resulterer i fortrængning af Tensin3 fra integrin, således destabilisere cytoskelettet og øge celle motilitet. Vi har rapporteret, at Tensin2 udtryk i nyreceller hæmmer celledeling, overlevelse og migration, samtidig med en selektiv undertrykkelse af Akt signalvejen [5]. Endelig en interaktion tilsyneladende fælles for alle fire Tensins er, at med DLC-1 tumor suppressor protein, hvilket kan være en mediator for de potentielle antitumorvirkninger af Tensins [10] – [12]

. USA, er 54390 nye tilfælde af nyrekræft forudsiges at opstå i 2008, der forårsager en anslået 13010 dødsfald [13]. Renalcellekarcinom (RCC) er en kræft, der stammer fra nyre epitel og tegner sig for 85% af nyre kræft og tilhørende dødelighed. RCC kan yderligere opdeles i forskellige undertyper: konventionel eller klar celle RCC (ccRCC), som repræsenterer det store flertal af RCC tilfælde, efterfulgt af papillær (pRCC) og kromofobt (chRCC). Også inkluderet i denne undersøgelse er oncocytoma, som er et ikke-RCC, godartet tumor type. Hver af disse tumortyper har en særskilt patogenese. For eksempel er to tredjedele af ccRCC tilfælde forbundet med en defekt i von Hippel-Lindau (VHL) tumorsuppressorgen [14].

Men epitelcelle transformation, der forekommer i fælles for disse tumortyper indebærer, flere processer, herunder mutationer, der giver gunstige betingelser for kræftcellen overlevelse, formering og migration. Desuden forstærket cancer cellemotilitet er en vigtig funktion i den tidlige metastatiske proces. Som en fjerdedel af RCC patienter til stede med lokalt invasiv eller metastatisk sygdom, er det bydende nødvendigt at identificere de faktorer og mekanismer, der ligger til grund for den metastatiske proces.

Nyrerne er det organ, hvor de fleste Tensins er fortrinsvis udtrykt [1], [6], [7]. Sletning af

Tensin2

gen viste sig at være bag en musemodel af nefrotisk syndrom [15], og knockout-mus for Tensins -1 og -3 udviser nyre rørformet cyste dannelse og nyresvigt [16], [17 ]. Der er derfor et udtalt behov for at undersøge Tensins for deres ekspression og funktioner i den menneskelige nyre i både normale og sygdomstilstande. Formålet med den foreliggende undersøgelse var at undersøge den rolle, som hele Tensin familien i human RCC.

Metoder Salg

Cellekultur

Følgende humane cancercellelinier dyrkedes og forberedt til QRT-PCR og Western blot-analyse: bryst (MCF-7, MDA-MB231), prostata (DU145, PC3, PNT-1A), colorektal adenocarcinom (SW480), cervical carcinoma (HeLa S3), osteosarkom (U20S), melanom (WM9, WM266-4, WM793), ikke-lille lungekræft (H358, H2087, H226, H727) og B-celle lymfom (U629, U2932). blev også analyseret forskellige humane ikke-cancercellelinier: endotelcelle linje (EAhy926), dermale fibroblaster (AG52), nyre proximale tubulære celler (HK-2), bryst epiteliale celler (MCF-10A). Celler blev dyrket i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum, 20 mM glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2

i luft.

patienter

undersøgelsen omfattede 260 patienter med histopatologisk verificerede renalcellecarcinom (RCC) efter nephrectomistatus udført ved Institut for urologi, Umeå Universitetshospital, mellem 1982-2003. Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité af Umeå Universitet og af Institutional Review Board, og hver patient deltog efter at give informeret samtykke. De klinisk-patologiske egenskaber ved patienter er opsummeret i tabel 1.

Mellemstationerne procedurer omfattede en fysisk undersøgelse, bryst radiografi, ultrasonografi og computerstyret tomografi af abdomen. Tumorer blev iscenesat efter systemet TNM klassifikationen 2002 [18] og histopatologisk sortering blev gjort i overensstemmelse med Skinner

et al.

[19]. RCC typen blev defineret i henhold til Heidelberg konsensus konference [20]. Tumorstørrelse blev målt på de kirurgiske prøver og /eller på computeriseret tomografi. Tumor størrelse varierede fra 0,6 cm til 25 cm (median: 7.0 cm). Venøs invasion blev defineret som tumor invasion i større renale vener, verificeret mikroskopisk i vævssnit fra den renale hilum. Patient opfølgende status blev vurderet mindst årligt ved rutinemæssig klinisk opfølgning på Umeå Universitetshospital eller ved at kontakte patienter direkte. Under opfølgningsperioden, blandt de 260 patienter havde 139 døde af sygdommen, 61 var døde af andre årsager, 7 var i live med sygdom, og 53 var i live og fri for sygdom. Tumor og nyre cortex væv blev udtaget umiddelbart efter nefrektomi. Prøver fra histopatologisk nonmalignant nyre cortex væv fjernt fra tumoren zone blev også opnået fra 48 patienter og anvendes til sammenlignende vurdering.

elektroforese og western blot

Celler blev lyseret i lysisbuffer (1% NP -40, 1% deoxycholat, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA i PBS, pH 7,4) og separeret på 5% og 8% polyacrylamid SDS-geler under reducerende betingelser og derefter overført til en PVDF-membran. Membraner blev blokeret i 3% fiskegelatine i 0,1 M Tris-HCI, pH 8,0, 1,5 M NaCl og 0,5% Tween 20 (vaskebuffer), probet med et primært antistof mod Tensin2 (1:1000 fortynding) og Tensin3 (1:1000 ) henholdsvis i 1 time, vasket med vaskebuffer efterfulgt af inkubation i 1 time med det sekundære antistof bundet til enten peberrodsperoxidase (HRP) eller alkalisk phosphatase (AP). Bagefter blev membranerne visualiseret ved en kemiluminescens-metoden (HRP) eller ved reduktion af 4-nitroblåt tetrazoliumsalt (NBT) i nærvær af 5-brom-4 chlor-3 indol-phosphat (BCIP) i 0,1 M Tris- HCI, 0,05 M MgCl

2, 0,1 M NaCl, pH 9,5 (AP).

antistoffer anvendt til detektion af Tensin2 og Tensin3 var både internt kanin polyklonale antistoffer genereret mod peptider svarende til C-terminalen af hvert protein. Det rå antisera blev oprenset sekventielt, først ved affinitetskromatografi på protein A og G sepharose kolonner og efterfølgende yderligere affinitetsoprensning under anvendelse af de immobiliserede peptidantigener, som tidligere beskrevet for anti-Tensin2 [5]. Anti-Tensin3 antistoffer blev testet for specificitet under anvendelse af cellelysater der udtrykker fuld længde rekombinant Tensin3, samt ved at blokere med Tensin3 C-terminalt peptid-antigen (fig S1). En kommerciel kanin polyklonalt anti-Tensin3 antistof (Sigma) blev anvendt til western blots af stabilt transfekterede Tensin3 cellelysater. Optimale fortyndinger blev bestemt til western blotting.

Real-time kvantitativ revers transkription-PCR (QRT-PCR)

For QRT-PCR-analyse af nyre kræft patientprøver, den levedygtige del af hver tumor væv blev anvendt til opnåelse af høj kvalitet RNA ekstraheret under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, Stockholm, Sverige). Fra dyrkede celler, blev totalt RNA ekstraheret under anvendelse CellDirect ™ One-Step QRT-PCR-kittet (Invitrogen, Lidingö, Sverige). RNA-koncentrationer blev kvantificeret ved spektrofotometrisk måling ved 260 nm bølgelængde (DU640 spektrofotometer, Beckman Coulter, Bromma, Sverige) og RNA integritet blev verificeret ved ethidiumbromid-farvning af 28S og 18S rRNA efter agarosegelelektroforese.

One-step multiplex real-time kvantitativ RT-PCR blev anvendt, hvor amplifikation af både genet af interesse og endogene kontrol-gen blev udført sammen i samme reaktionsrør. Genspecifikke primere og Taqman prober blev indkøbt fra Applied Biosystems (Applera Sverige, Stockholm, Sverige). For hver prøve blev 40 ng af total RNA blandet med en revers transkriptase og polymeraseenzym mastermix, og TaqMan® MGB prober og primere blev tilsat til denne blanding til et endeligt volumen på 25 pi. Den QRT-PCR-reaktionen blev udført i en ABI PRISM 7900HT systemet (Applera Sverige, Stockholm, Sverige) under anvendelse af følgende cykliseringsbetingelser: revers transkription i 15 minutter ved 50 ° C; 2 minutter ved 95 ° C, og 40 cykler af: 95 ° C i 15 sek og 60 ° C i 60 sek. Hver måling blev udført in duplo, og tærsklen cyklus (C

t) blev bestemt for hver amplifikationskurven.

For at generere standardkurver til kvantitativ analyse af hvert gen, en cellelinie blev valgt, der var en pålidelig og verificeret kilde til mRNA for det pågældende gen. RNA-template blev udeladt i negative kontroller, og en standardkurve fra seriefortyndinger af totalt RNA fra den relevante cellelinje blev opnået for alle kørsler og hvert gen af ​​interesse. For hver prøve blev gennemsnittet af dobbeltbestemmelser Ct-værdier konverteret til ng RNA fra lineær regressionsanalyse under anvendelse af en relativ standardkurve metode under anvendelse af Excel-pakke (Microsoft, Redmond, Washington). Hver bestemt RNA-værdi blev derefter normaliseret til det endogene henvisning gen indhold af den samme prøve. Fra en skærm på 11 kandidat husholdning gener, den menneskelige β2-mikroglobulin (

B2M

) og glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (

GAPDH

) gener blev empirisk bestemt af os til at være den mest robuste endogene kontrol gener for humant nyrevæv og humane cellelinier, henholdsvis (data ikke vist). Resultater opnået blev vilkårligt udtrykt som ng Tensin RNA /ng endogene kontrol-RNA.

Northern blot analyse

Menneskelig multiple væv Northern (MTN) blots (BD Biosciences, Stockholm, Sverige), der indeholder 2 mg poly A + RNA fra hver af otte cancercellelinier, blev probet for ekspression af Tensin2 mRNA. En 1,6 kb 3-terminale cDNA-sekvens fælles for alle splejsningsvarianter af Tensin2 blev anvendt som

32P-mærket probe. CDNA-sekvensen for human β-actin blev anvendt som en kontrol probe. Radiomærkning med [

32P] dCTP blev opnået gennem Rediprime II DNA mærkningssystem (GE Healthcare, Uppsala, Sverige). Hybridisering blev udført natten over ved 42 ° C i ULTRAhyb hybridiseringsbuffer (Ambion, Stockholm, Sverige), efterfulgt af høj stringens vaske. Membraner blev udsat for en Phosphor-Imager skærmen mindst natten før vizualization.

immunhistokemisk analyse af Tensin3 i humane nyre tumorer

Til konstruktion af væv microarrays (TMAS), RCC sektioner blev opsamlet som beskrevet ovenfor, og screenes ved primær vurdering af hematoxylin /eosin-farvede objektglas før TMA forberedelse som tidligere [21] beskrevne. Kort fortalt blev to 0,6 mm væv diameter kerner fra hver tumor blok og anbragt i en modtagerblok bruge en manuel væv arrayer (Beecher Inc., Sun Prairie, WI). TMA sektioner på 4 um tykkelse blev afparaffiniseret og mikrobølgeovn behandlet for antigen-genvinding ifølge standardprocedurer. Kvaliteten og robusthed RCC TMA er blevet testet for andre faktorer, og rapporteret af os tidligere [22]. Kanin polyklonalt anti-Tensin3 antistof, der anvendes til TMA immunfarvning er beskrevet ovenfor og blev verificeret for specificitet ved analyse af mock- og Tensin3-transficerede celler såvel som af antigen blokering (fig S1). For immunfarvning, blev antistoffet anvendt ved et optimalt bestemt fortynding af 1:300. Detektion blev udført med peberrodsperoxidase ved anvendelse af Dako EnVision og TechMate 500 systemer, og kontrastfarvning med hematoxylin og eosin. TMA snit fra 148 patienter blev analyseret og farvning blev grupperet i ingen, lav, middel eller høj ekspression af Tensin3, samt desuden for tilstedeværelse eller fravær af farvning på plasmamembranen (PM). Alle TMA’er blev evalueret uafhængigt af to observatører

Generation af rekombinant Tensin3-udtrykkende celler

Den komplette cDNA sekvens for Tensin3. (1409 aminosyrer;. Tiltrædelse NCBI ingen NM_022748) blev klonet i pcDNA3 pattedyr ekspressionsvektor (Gibco Invitrogen, Lidingö, Sverige) til stabil ekspression i humane embryoniske nyre (HEK) 293-celler, som tidligere beskrevet [5]. Plasmid-bærende celler blev selekteret for vækst i nærvær af neomycinanalogen G418 (400 ug /ml). Parallelt hermed blev også udviklet mocktransfekterede cellekloner bærer tom vektor alene, såvel som mutante kloner indeholdende et formodet PTPase-dead mutant Tensin3 (tNS3 Mut) cDNA. Denne mutant blev frembragt i det formodede PTPase aktive sted i Tensin3 med cystein i position 107 erstattet af en serin. Mutation af vildtype Tensin3 cDNA i pcDNA3-vektoren blev udført ved QuikChange steddirigeret mutagenese (Stratagene, Amsterdam, Holland) ifølge producentens instruktioner, under anvendelse af de følgende primere (switched nukleotid understreget): 5′-CATGTGGTCGTCATTCACAGCAGGGGCGGGAAAGGAC-3 ‘(sense ) og 5’-GTCCTTTCCCGCCCCTGCTGTGAATGACGACCACATG-3 ‘(antisense).

celleproliferation assays Salg

celleproliferation blev vurderet på to måder. Den første var måling af mitokondriel aktivitet som en afspejling af levedygtige celler, som tidligere beskrevet [23]. Kort fortalt blev separate kloner af stabilt transficerede mock 293-celler, vildtype Tensin3 celler (tNS3 wt) og Tensin3 PTPase mutantceller (tNS3 Mut) podet tyndt 0.5 × 10

4 celler per brønd i en 96-brønds mikrotiterplade, i medium indeholdende 0,5% serum (dag -1). Den næste dag (dag 0), blev mediet erstattet med det, der indeholder 5% serum, og cellerne blev yderligere inkuberet i op til 7 dage. På hver efterfølgende dag blev antallet af levedygtige celler målt ved deres omdannelse i løbet af 3 timer af tetrazoliumforbindelse [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4- sulfophenyl) -2H-tetrazolium (MTS, Sigma) til et opløseligt formazan produkt, der blev målt spektrofotometrisk ved 490 nm. Firedobbelte brønde blev anvendt til hver måling.

Den anden metode til celleproliferation var kvantificering af absolutte celleantal at generere en vækstkurve over 5 dage. Separate kloner af stabilt transficerede mock 293-celler, vildtype Tensin3 celler (tNS3 wt) og Tensin3 PTPase mutantceller (tNS3 Mut) blev podet med 1 × 10

4 celler per brønd i en 48-brønds plade, i medium indeholdende 0,5% serum (dag -1). Den næste dag (dag 0), blev mediet erstattet med det, der indeholder 5% serum, og cellerne blev inkuberet i yderligere 5 dage. På hver efterfølgende dag blev celleantallet pr brønd bestemt ved trypsinisering af celler fra brøndene og tælling i et hæmocytometer kammer. For hver klon, blev celleantallet bestemt ud fra den gennemsnitlige tælle fra ni felter. I begge forsøg blev statistiske forskelle mellem celletyper på hver dag bestemt af ANOVA med Bonferroni post-hoc korrektion.

Cell migration og celle-matrix invasion assays

En modificerede Boyden kammer assay system blev anvendt at bestemme migration /haptotaxis af Tensin3-transficerede celler som beskrevet tidligere [5]. Kort beskrevet cellekultur indsætter med 8 um porestørrelse membraner (Nunclon, Roskilde, Danmark) blev belagt med fibronectin (10 pg /ml; Sigma, Stockholm, Sverige) på undersiden. Inserts blev anbragt i brønde på plader med 24 brønde indeholdende komplet vækstmedium, og 10

5-celler blev podet i hver indsætte interiør i komplet medium. Identiske inserter blev anvendt til hver særskilt cellelinie analyseret. Cellerne fik lov til at migrere ved 37 ° C i en cellekultur inkubator i 18 timer. Bagefter blev inserter fjernet og mediet inden aspireret. Alle celler efterladt på den øvre overflade af membranen blev udslettet væk og indsætte membraner blev kortvarigt skyllet, fikseret i 10% formalin og farvet med Grams krystalviolet-opløsning (Fluka, Stockholm, Sverige). Celler fra mindst tre høj effekt felter pr insert blev talt under lysmikroskopi (Olympus, Solna, Sverige). Statistiske sammenligninger mellem migration af individuelle cellekloner blev udført ved ANOVA med Bonferroni post hoc korrektion.

I matrix invasion assays haptotaxis assayet ovenfor blev modificeret således, at i stedet for fibronectin, basalmembranen matrix blanding Matrigel ( BD Biosciences, Bedford, MA) blev anvendt til at dække den øvre side af cellekultur skær med 8 um porer. Separate kloner af Mock og Tensin3-transficerede 293-celler blev podet ind i kammeret interiør i medium indeholdende 0,5% serum, mens brøndene af plader med 24 brønde indeholdt komplet dyrkningsmedium, hvorved der skabes en serum-gradient. Identiske inserter blev anvendt til hver særskilt cellelinie analyseret. Cellerne fik lov til at invadere matrixen og migrere igennem til den anden side af membranen over 30 timer ved 37 ° C. Bagefter blev cellerne fikseret, farves og tælles som beskrevet ovenfor.

Knockdown af Tensin3 af siRNA tavshed

melanom cellelinje WM793 blev udvalgt til Tensin3 gendæmpning som det udtrykte de højeste mængder af Tensin3 ud af alle de cancercellelinjer afprøvet (figur 1B). Celler blev podet i plader med 6 brønde 24 timer før siRNA transfektion. Celler blev separat transfekteret med 5 nM hver af tre forskellige Tensin3 siRNA-konstruktioner, siRNA I, II (ON-TARGET plus siRNA reagenser Dharmacon, Täby, Sverige) og III (HP valideret siRNA, Qiagen, Solna, Sverige). Negative kontroller omfattede transfektion blanding kun og en ikke-lyddæmpning siRNA, der blev vist sig at have ringe effekt på den globale genekspression (AllStars, Qiagen, Solna, Sverige). SiRNA blev blandet med lipofectamin 2000 og OptiMEM I serumfrit medium (Invitrogen, Lidingö, Sverige), og transfektion blandingen blev inkuberet med celler i 24 timer. Efter denne periode blev cellerne trypsineret, talt og underkastes en migrering /haptotaxis assay nøjagtigt som beskrevet ovenfor, bortset fra at 0,5 × 10

5 WM793 celler pr insert blev anvendt, og migration lodes ske over 16 timer.

(A) Northern blot analyse af Tensin2 (TNS2) mRNA i humane cancercellelinier. En menneskelige kræftceller MTN blot blev undersøgt ved høj stringens med radioaktivt mærkede cDNA specifikke for Tensin2. Banerne er som følger: 1, promyelocytisk leukæmi HL-60; 2, HeLa S3; 3, kronisk myeloid leukæmi K-562; 4, lymfoblastisk leukæmi MOLT-4; 5, Burkitts lymfom Raji; 6, colorectal adenocarcinom SW480; 7, lungecarcinom A549 og 8, melanom G-361. Den samme membran blev også undersøgt for human β-actin (laveste panel) for at vise lige RNA belastning. En repræsentativ blot er vist af to uafhængige hybridiseringer. (B) mRNA udtryk for Tensin2 og Tensin3 analyseret af QRT-PCR. Et panel af menneskelige kræftceller samt humane normale epitelceller og endotel cellelinjer blev screenet for Tensin2 (TNS2) udtryk (venstre akse, tomme søjler) og Tensin3 (tNS3) udtryk (højre akse, sorte søjler). Resultaterne præsenteres som relative ekspression gives efter normalisering af genet af interesse at referere gen

GAPDH

(ng gen af ​​interesse /ng henvisning genet). (C, D) Angivelse af Tensin2 og Tensin3 proteiner i menneskelige kræftceller. Hele cellelysater blev underkastet 8% SDS-PAGE og western blot-påvisning af Tensin2 og Tensin3 proteiner. Banerne er som følger: 1, HEK 293-celler stabilt transficeret med Tensin2 (C); 1, HEK 293-celler stabilt transficeret med Tensin3 (D) 2, renal carcinoma SKRC-52; 3, HeLa S3; 4, colorectal adenocarcinom SW480; 5, brystadenocarcinom MCF-7; 6, prostata carcinoma DU145; 7, melanom WM793; . 8, lungekræft H727

Statistisk analyse

Alle kliniske data blev analyseret ved hjælp af SPSS softwarepakken (version 16.0.2 til Macintosh, SPSS Institute, Chicago, IL). Gennemsnitlig forskel på ikke-normalfordelte data blev analyseret ved anvendelse af Mann-Whitney-test. Kruskal-Wallis test blev anvendt til sammenligning mellem flere end to grupper. Korrelationer blev vurderet af Spearman rank korrelation test. Overlevelse kurver blev evalueret med Kaplan-Meier-metoden og overlevelsestid de blev sammenlignet ved hjælp af log-rank test.

I celleproliferation, migration og invasion analyser, statistiske sammenligninger mellem forskellige celle kloner eller behandlinger blev udført af ANOVA med Bonferroni post hoc korrektion. Alle statistiske tests var to-sidet og en

P

værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Tensin udtryk er stort set fraværende i human cancer celle linjer

Vi først screenet et panel af humane kræftceller til Tensin udtryk. Et udvalg af forskellige humane cancercellelinier blev screenet ved Northern blot-analyse for ekspression af Tensin2 mRNA. Den forventede bånd ved 5 kb til Tensin2, som tidligere rapporteret i menneskelige organer [1], var næppe detekterbar i kun 2 ud af 8 cellelinier: HeLa og SW480 (figur 1A). Vi gik at udføre kvantitativ RT-PCR for yderligere at undersøge mRNA-ekspressionsniveauer af Tensin2 og Tensin3 i et større udvalg af humane cancercellelinjer og sammenlignede dem direkte til RNA ekstraheret fra hele menneskelige nyre vævsekstrakter. Som vist i figur 1B, Tensin2 mRNA var til stede i de fleste cellelinjer. Kun den colorektal adenocarcinom-cellelinje SW480 udtrykte Tensin2 mRNA ved detekterbare niveauer, som også blev set i Northern blot (figur 1A). Betydeligt, både Tensin2 og Tensin3 udtryk var lavere i en enkelt RCC patients nyre tumor ekstrakt som sammenlignes med dens tilstødende normale modstykke (matches). Resultaterne viser, at Tensin3 ekspression er højere og bredere end for Tensin2 blandt de undersøgte cellelinier, men at begge gener synes at være nedreguleret i RCC. Vi undersøgte også Tensin1 og Tensin4 mRNA i det samme panel af prøver og fundet ekspression af disse Tensins at være stort set upåviselig eller helt fraværende (data ikke vist).

Vi udførte immunblot at analysere proteinekspression af Tensin2 og Tensin3 (Figur 1C, D). I overensstemmelse med mRNA resultater blev ekspression af Tensin2 på proteinniveauet (molekylvægt 160 kDa) næppe påvist i humane cancercellelinier, hvorimod Tensin3 (180 kDa) ekspression var påviselig i det mindste i to cellelinier: melanom cellelinie WM793 og lungecarcinom line H727. Tilsammen viser disse resultater, at ekspressionen af ​​alle Tensins er stort set fraværende i menneskelige kræftceller samt være nedreguleret i humane nyre tumorer.

Tensins 1-4 mRNA-niveauer er væsentligt lavere i renalcellecarcinom versus normal nyre væv

Vi anvendte multiplex ettrins QRT-PCR for at vurdere mRNA ekspressionsniveauer af alle fire Tensins i denne kliniske undersøgelse af totalt RNA ekstraheret fra 223 RCC og 48 normale nyre cortex vævsprøver. De kliniske og patologiske karakteristika for RCC patienter i denne undersøgelse er vist i tabel 1. De normale prøver blev opnået fra matchede tumor kilder og fordelingen af ​​tumortyper blandt disse var den samme som i den samlede population, dvs.. 75% var en klar celletype (tabel 1). Fra en skærm på 11 kandidat housekeeping-gener (Applera Sverige, Stockholm, Sverige), vi empirisk

B2M

genet for at være den mest konsekvente og robust intern standard til brug for humant nyrevæv (data ikke vist).

Som vist i figur 2A, mRNA ekspressionen af ​​Tensin2 fra 223 RCC ekstrakter var signifikant lavere end i ekstrakter fra normal nyre cortex (48 tilfælde;

s

0,001). Resultaterne er stort set reflekteres fra ccRCC, som udgjorde størstedelen af ​​tilfældene; dog de lavere niveauer i pRCC var også af stor betydning (

s

0,001). Desuden analyse af kun undergruppen af ​​tumor materiale, der havde matchet normale modparter gav også en signifikant lavere Tensin2 og -3 udtryk i tumorvæv (n = 48;

s

0,001). Desuden var der også en statistisk signifikant fald i Tensin1 ekspression i tumorprøver (n = 134) sammenlignet med normale (n = 21) (Figur 2B). En lignende og meget signifikant reduktion i Tensin3 mRNA-ekspression blev også observeret (figur 2C). Især Tensins -1, -2 og -3 ekspression blev påvist i alle prøver måles. I modsætning hertil Tensin4 ekspression var stort set fraværende i størstedelen af ​​RCC prøver målt (n = 134), mens det var til stede i alle normale nyre cortex prøver (n = 21) (figur 2D). Disse resultater, sammenholdt med de ovenfor beskrevne, viser, at en generel nedgang i ekspressionen af ​​Tensins forekommer i RCC og kunne derfor være gunstige for udviklingen af ​​RCC tumorer.

(A, C) mRNA-niveauer af Tensin2 (TNS2) og Tensin3 (tNS3), henholdsvis 223 RCC patienter grupperet efter tumortype, vs normale nyre cortex prøver fra 48 patienter. Resultaterne præsenteres som relative ekspression (ng Tensin2 /ng B2M og ng Tensin3 /ng B2M henholdsvis). Tensin2 og Tensin3 ekspression i forhold til tumortype såvel i kontrolgruppen er vist sammen med medianværdien.

***

P

0,001 normal vs. papillær og til normal vs. ccRCC. (B, D) mRNA niveauerne af Tensin1 (TNS1) og Tensin4 (TNS4), henholdsvis 134 RCC tilfælde (tumor) og 21 nyre cortex prøver (normale) efter normalisering at referere gen (relativ udtryk). Medianer er vist for både Tensin1 og Tensin4 ekspression i normale og tumorprøver. I felt D, værdien n = 123 angives som antal tumorprøver uden Tensin4 ekspression.

***

P

. 0,001 normal vs. tumor

Sammenhæng mellem Tensin udtryk og kliniske variabler i RCC patienter

Vi udførte korrelation analyser at evaluere en potentiel relation mellem Tensin mRNA-ekspression i RCCS og kliniske karakteristika for patienterne. De mest relevante korrelationer er opsummeret i tabel 2. For det første mRNA-ekspression af Tensins 1-3 i tumorer korrelerede positivt med hinanden, men ikke med Tensin4 som det var stort set ikke påvises i RCC-prøver. Ingen signifikant korrelation var tydelig mellem Tensins mRNA ekspressionsniveauerne og kliniske variabler som tumorstørrelse, tumor venøs infiltration, regional lymfeknude infiltration, alder eller køn.