Abstrakt
Baggrund
Trykstyrke mekanisk belastning produceret under væksten i et omsluttende matrix begrænser størrelsen af tumor sfæroider, men lidt er kendt om dynamikken i stress ophobning, hvordan stress påvirker kræft-fænotype, eller de molekylære involverede veje.
Metode /vigtigste resultater
Vi samarbejder -embedded enkelt kræftceller med fluorescerende mikro-perler i agarose geler og, ved hjælp konfokalmikroskopi, indspillet 3D fordeling af mikro-perler omkring voksende sphæroider. Ændringen i mikro-perle densitet blev derefter omdannet til stammen i gelen, hvorfra vi anslået den rumlige fordeling af trykspænding omkring sfæroiderne. Vi fandt en stærk korrelation mellem den peri-sfærisk solid stress distribution og kugleformet facon, et resultat af undertrykkelse af celledeling og induktion af apoptotisk celledød i regioner med høj mekanisk belastning. Ved at komprimere sfæroider bestående af cancerceller, der overudtrykker anti-apoptotiske gener, viser vi, at mekanisk belastning apoptose forekommer via den mitokondrielle pathway.
Konklusioner /Signifikans
Vores resultater giver detaljerede, kvantitativ indsigt i rolle mikro-miljø mekanisk belastning i tumor sfæroid vækstdynamik, og foreslå, hvordan tumorer vokser på trange steder, hvor niveauet af fast stress bliver høj. En vigtig implikation er, at apoptose via mitokondrielle pathway, induceret af trykspænding, kan være involveret i tumor hviletilstand, i hvilken tumorvækst holdes i skak af en balance af apoptose og proliferation
Henvisning:. Cheng G, Tse J, Jain RK, Munn LL (2009) Micro-Environmental Mekanisk Stress Controls Tumor Sfæroide størrelse og morfologi ved at undertrykke spredning og inducere apoptose i kræftceller. PLoS ONE 4 (2): e4632. doi: 10,1371 /journal.pone.0004632
Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Ordway Research Institute, USA
Modtaget: December 21, 2008; Accepteret: 2 januar 2009; Publiceret: 27 februar 2009
Copyright: © 2009 Cheng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud P01CA80124, R01CA085140 og R01CA126642. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
væksten af solide tumorer er stærkt påvirket af sin mikromiljø. Desuden velundersøgte microenvironmental parametre, såsom hypoxi [1], [2] og angiogenese [3] – [5], mekaniske påvirkninger spiller også en vigtig rolle. For en fast tumor at vokse i et lukket rum afgrænset af det omgivende væv, skal den overvinde de resulterende trykkræfter. Det er blevet vist, at tumorer og deres tilhørende stroma er mekanisk stivere end den tilsvarende normale værtsvæv [6], og at mekanisk kompression i et sådant miljø kan kollapse blod og lymfekar [7]. Men vores forståelse af, hvordan denne kompression direkte indflydelse tumorvækst er begrænset. blevet foreslået forskellige hypoteser om inddragelse af mekaniske spændinger i tumorudvikling [8] – [11], og Helmlinger et al. [12] foretaget den første kvantificering af sfæroide vækstinhibering i agarosegeler. De fandt, at humane coloncarcinom sfæroider kan vokse til en maksimal størrelse på 400 um (diameter) i 0,5% (w /v) agarose, men kun 50 um i 1,0% agarose (som er mindre kompatibel). Dette blev forbundet med en stigning i celle pakning og et fald i celleproliferation. De viste også, at en sådan inhibering af tumorvækst kan vendes ved at frigøre sfæroiderne fra gelen. Endnu flere centrale spørgsmål forbliver ubesvarede, herunder: (1) Hvad er karakteren af stress felt omkring voksende tumor sfæroider? (2) Kan lokal solid spændingsfordeling påvirke formen af tumor sfæroider? (3) Er solid spændingsfordeling påvirker også celle fænotype i forskellige regioner i de enkelte sfæroider? (4) Hvad er den intracellulære vej, der regulerer den faste stress-induceret fænotypiske ændring (er)? Disse spørgsmål er afgørende for en grundlæggende forståelse af faste dynamik tumorvækst.
I denne undersøgelse viser vi, at den akkumulere solid stress i agarosegeler omkring voksende tumor sfæroider (ikke-metastatiske murine brystcarcinom 67NR celler, medmindre andet er angivet ) kan måles under anvendelse co-embedded fluorescerende mikroperler (diameter = 1 um) som markører for stammen i gelen: agarosegeler er modstandsdygtige over for nedbrydning af cancercellelinjer proteinaser [13], og således tillade studier af massivt stress ophobning uafhængig af celleinvasion. Vi viser, at formen af den faste spændingsfelt dikterer formen af tumor sfæroider og at denne virkning skyldes undertrykkelse af celleproliferation og induktion af celleapoptose i regioner med høj solid stress. Endelig har vi belyse molekylære mekanisme for den faste stress-induceret apoptose.
Resultater
voksende tumor sfæroider progressivt komprimere den omgivende matrix
Fig. 1
A
viser væksten af en typisk tumor klumpformet (grøn) co-indlejret med mikro-perler (rød) i 0,5% agarose-gel i 30 dage (se forsøgsopstilling i supplerende Fig. S1
A
). Analyse via 3D konfokal mikroskopi afslørede, at agarosegelen blev gradvis komprimeret af voksende klumpformet (fig. 1
B
). Ved tidlige tidspunkter, var der meget udsving i mikro-perle densitet (
ρ
perler), hovedsagelig fordi klumpformet stadig var forholdsvis lille, og som et resultat, mængden til måling prøveudtagning
ρ
perler var begrænset. Betydelige stigninger i
ρ
perler begyndt at dukke på dag 17, når den klumpformet diameter (
D
sphd) kun -150 um var. Ved dag 30,
D
sphd havde nået -250 um og
ρ
perler i de første 10 um tyk skal af agarosegel (
ρ
perler, 1) var ~1.6 gange større end tryksvage geler, svarende til en belastning 37,5% (
ε
gel, 1). Signifikant stamme blev begrænset til den umiddelbare nærhed af klumpformet:
ρ
perler faldt dens kontrol niveau inden ~ 50 um fra klumpformet overflade (figur 1
B
, dag 30. kurve). Forholdet mellem klumpformet vækst og den resulterende stamme i agrose gel er lineær i området fra
D
sphd målt i vores undersøgelse (fig. 1
C
). Fra publicerede mekaniske egenskaber af 0,5% agarosegel [14], vi anslået, at klumpformet i fig. 1
A
pålagt -28 mmHg fast stress på den umiddelbart hosliggende matrix på dag 30, svarende til værdien estimeres teoretisk ved Helmlinger et al. [12]. For sphæroider dyrket i 1,0% gel, prøveudtagningsmængden til kvantificering af mikro-perle tæthed var for lille, fordi de fleste sfæroider ikke kunne vokse sig større end 50 um i diameter.
(
A
) En voksende klumpformet (grøn) og de omkringliggende mikro-perler (rød). Scale bar = 100 um. (
B
) Kvantificering af relativ mikro-perle densitet (
ρ
perle) i 10-um tykke skaller af agarosegel omkring den voksende klumpformet vist i
A
som funktion af afstanden af skallen fra klumpformet center (
dist
). (
C
) Sammenhæng mellem klumpformet diameter (
D
sphd
) og stammen i den første 10-um tyk skal af agarosegel (
ε
gel, 1) omkring sfæroider.
R
er den lineære regression koefficient; hældningen på regressionslinjen er signifikant større end nul (
s
0,0001).
Tumor klumpformet korrelerer stærkt med formen af lokale fast spændingsfelt
i nærheden af nogle sfæroider, gelen mislykkedes under spænding produceret af klumpformet vækst. Dette resulterede i mikro-skala plane revner i gelen (fig. 2
En
, pilespidser). Selvom de er udvalgt til analyse i fig sfæroider. 1 ikke opholde sig sådanne revner og var alle næsten sfærisk form, spheroids der fandtes inden revner vedtaget fladtrykte former (dvs. fladtrykt sfærer, Figur 2
A
;. Også se Movie S1 for 3D-gengivelse). Kvantificering af mikro-perle tæthed omkring typiske sfæriske og fladtrykte sfæroider afslørede en stærk korrelation mellem klumpformet form og formen af den lokale mekaniske spændingsfelt (fig. 2
B, 2C
). Dette blev yderligere bekræftet af resultaterne fra lignende analyse på -25 sfæroider i forskellige former (fig. 2
D
). Helmlinger et al. observeret et lignende fænomen ved at dyrke sfæroider i 1 mm kapillar glasrør:. sfæroiderne langstrakt langs røraksen, formentlig som svar på den lokale spændingsområde [12]
(
A
) agarosegel kan mislykkes under spænding fra voksende tumor sfæroider (grøn). Røde pilespidser angiver kanten af plane revner i agarosegel (BF: lysfeltsbillede taget i Nomarski mode). Scale bar = 50 um. (
B
) Spheroids (grøn) i forskellige former og deres omgivende stress felter visualiseret ved mikro-perler (rød). Scale bar = 150 um. (
C
) Forholdet mellem lokal belastning i agarosegel (
ε
gel, 1, lokale) og lokal klumpformet deformation (
λ
sphd, lokale) til sfæroiderne (grøn, indsat) vist i
A
.
dist
seg er afstanden af sfæroide segmenter fra klumpformet center normaliseret over længden af storaksen. (
D
) Korrelation mellem asymmetrien i sfæroid form og i den tilsvarende stamme i det omgivende agarose gel, der viser, at sfæroider mere deformeres langs retningen af højere stress. Hvert datapunkt er for en klumpformet.
R
er den lineære regression koefficient; hældningen på regressionslinjen er signifikant større end nul (
s
0,0001). Metoder til billedanalyse i
C
D
er beskrevet i supplerende metoder S1, supplerende Fig. S2, Movie S2 og Movie S3.
Høj solid stress undertrykker celledeling og inducerer apoptotisk celledød i tumor sfæroider
For at undersøge potentielle fænotypiske ændringer, at solid stress inducerer i kræftceller, vi evaluerede celleproliferation og apoptose i sfæroiderne. Celledeling nær regioner i højere stress (dvs. i retning af den mindre akse af fladtrykte sfæroider) var reduceret sammenlignet med områder af lavere stress (fig. 3). For at kontrollere, hvordan trykspænding påvirker cellernes levedygtighed, vi undersøgte apoptose og nekrose i levende sphæroider dyrket i 0,5% (fig. 4) eller 1,0% agarose geler (Supplerende fig. S3). I 0,5% gel, apoptose og nekrose syntes da sfæroiderne kun var ca. 50 um i diameter (fig. 4
En
, dag 12) og fortsatte med at stige, bliver omfattende ved dag 28. Efterfølgende apoptotiske områder blev gradvist erstattet af nekrose indtil, ved dag 45, nekrose havde næsten nået overfladen af sfæroide. I 1,0% agarosegel, kunne sfæroid ikke vokse sig større end -30 um i diameter, og apoptose og nekrose blev detekteret selv i disse små sfæroider (Supplerende Fig. S3). Disse observationer i levende sfæroider blev bekræftet ved immunhistokemisk farvning af faste prøver (fig. 4
B
). Desuden var der en stærk korrelation mellem den lokale del af celledød i sfæroider og den lokale stammen i agarosegel (fig. 5).
Pilehoveder angiver regioner med en mere celleproliferation. Scale bar = 50 um.
(
A
) Udviklingen af apoptose (grøn) og sekundær nekrose (rød) i en voksende sfæroid indlejret i 0,5% agarose gel. Scale bar = 100 um. (
B
) immunhistokemisk farvning (TUNEL og hæmatoxylin) bekræfter resultaterne i
A
. Billede i det nederste panel viser detalje af området inden for den stiplede linie i billedet i det øverste panel. Scale bar = 50 um.
(
A
) Levende sfæroider (grøn) i forskellige former, deres interne celledød (rød), og deres omgivende stress felter visualiseret ved mikro- perler (grå). Den grønne linje i højre kolonne viser kanten af sfæroider. Scale bar = 100 um. (
B
) Forholdet mellem lokal belastning i agarosegel (
ε
gel, 1, lokale) og lokal nekrotisk fraktion i sfæroider (
δ
sphd, lokalt) for de to spheroids vist i
A
. (
C
) Korrelation mellem asymmetrien i sfæroid nekrotiske fraktion og i den tilsvarende stamme i det omgivende agarosegel, der viser, at der er mere celledød langs retningen af højere trykspænding. Hvert datapunkt er for en klumpformet.
R
er den lineære regression koefficient; hældningen på regressionslinjen er signifikant større end nul (
s
0,0001). Metoder til billedanalyse i
B
og
C
er beskrevet i supplerende metoder, supplerende Fig. S2, Movie S3 og Movie S4.
For at verificere, at begrænsninger af næringsstoffer, vækstfaktorer eller ilt ikke var ansvarlige for apoptotisk celledød i fig. 4, vurderede vi apoptose i sphæroider vokset til lignende størrelser i fri suspension (hængende dråber). De frie suspensionskulturer havde ingen ekstern begrænsende matrix og lidt apoptose (fig. 6
En
, Tilstand 1). For at kontrollere om celle-agarose interaktioner bidraget til celledød, vi overførte gratis suspension sfæroider i 0,5% agarose geler, hvor de fik lov til at akklimatisere sig i 3 dage. I modsætning til sfæroider dyrket fra enkelte celler i agarosegel (fig. 6
En
, Tilstand 3), har de overførte sphæroider ikke tid til at akkumulere betydelige niveauer af fast stress, og de havde meget mindre celledød ( fig. 6
En
, tilstand 2). Således er det usandsynligt, at gel toksicitet eller begrænsninger af næringsstoffer, vækstfaktorer eller ilt var ansvarlige for apoptose observeret i de stressede sfæroiderne.
(
A
) Caspase-3 aktivitet (grøn) i tumor sfæroider (rød) dyrket i fri suspension (betingelse 1), overføres til 0,5% agarosegel i 3 dage efter at have nået plateauet-fase i fri suspension (betingelse 2), eller dyrket fra enkelte celler i 0,5% agarosegel (tilstand 3 ). Scale bar = 100 um. (
B
) Kvantificering af den del af apoptotiske celler i tumor sfæroider dyrket under de 3 forhold i
En
.
Eksternt anvendt komprimering efterligner vækst-induceret stress
Hvis trykspænding forårsager apoptotisk celledød i tumor sfæroiderne, bør det ikke ligegyldigt, om det er vækst-induceret eller eksternt påført. Derfor, for at kvantificere effekten af fast stress på celle apoptose under kontrollerede forhold, vi først komprimerede monolag af kræftceller i 17 timer med tryk fra 0 mmHg til 60 mmHg (se forsøgsopstilling i supplerende Fig. S1
B
) og observeret øget apoptose med øget stress-niveau (fig. 7
A
). Vi overført derefter sfæroider ca. 300 um i diameter fra fri suspension i 1% agarosegel og dyrket dem på tre betingelser: normalt medium uden ekstern kompression, sult medium (ingen glucose, intet serum og 1% oxygen) uden komprimering eller normalt medium med ekstern kompression (se forsøgsopstilling i supplerende fig. S1
C
). Caspase-3 aktivitet blev evalueret på 1 time, 3 timer, 5 timer og 7 timer (Fig 7
B, 7C
;. De relativt korte kompression gange blev valgt for at minimere potentiel komplikation af næringsstoffer /vækstfaktor /ilt begrænsninger i 3D kultur). Compression dramatisk forøget caspase-3-aktivitet, som fladede ud efter 5 timer. Sfæroider, der blev sultet men un-understregede havde meget mindre apoptose end dem i de komprimerede prøver, hvilket igen indikerer, at begrænsninger af glucose, serum og oxygen alene ikke hensyn til niveauerne af celledød demonstreret i fig. 4.
(
A
) Caspase-3 aktiviteten stiger i monolag af kræftceller i respons på højere ekstern stress. Celler blev komprimeret i 17 timer. (
B
) Caspase-3 aktivitet i sfæroider fremstillet af to forskellige cancer cellelinjer som reaktion på forskellige eksterne stress (0 mmHg eller 15 mmHg) og næringsforhold (Normal: normal medium; Sult: nej glukose, nej serum og 1% oxygen). (
C
) Typisk caspase-3 aktivitet (grøn) i sfæroider (rød) dyrket i tre af betingelserne i
B
. Scale bar = 100 um. (
D
) Bd-2 overekspression hæmmer stress-induceret apoptose, men crmA transduktion ikke. Sfæroider blev komprimeret med 15 mmHg i 7 timer, mens der leveres med normal medium.
Den mitokondrie vej regulerer mekanisk belastning-induceret celle apoptose i tumor sfæroider
Endelig undersøgte, hvilke af vi de to store apoptotiske veje [15] regulerer faste stress-induceret celle apoptose. Vi transducerede cancerceller til at overudtrykke crmA der inhiberer initiator-caspaser herunder caspase-1 og caspase-8 i død-receptor pathway [16], eller Bcl-2, en velkendt inhibitor af flere caspaser i mitokondrie pathway [17]. Fri suspension sfæroider af vild-type eller transducerede celler dyrket til ~300 um i diameter blev overført til 1% agrose gel og komprimeret som beskrevet før. Fig. 7
D
viser, at Bcl-2 overekspression reducerer kompression-induceret celledød i sfæroiderne mens crmA overekspression har ringe effekt. Tilsvarende overekspression af crmA i et stærkt metastatisk murin brystcarcinom cellelinie EMT6, som har et højt niveau af endogent Bcl-2-ekspression [18], ikke yderligere beskytte mod kompression-induceret caspase-3-aktivitet (data ikke vist), hvilket tyder at den mitokondrielle pathway regulerer solid stress-induceret apoptose.
diskussion
den foreliggende undersøgelse rettet adskillige resterende spørgsmål vedrørende effekten af trykspænding på væksten dynamikken i solide tumorer. Selvom empiriske matematiske modeller som den velkendte Gompertzian vækstkurve [19], og den nyere “universal vækst lov” [20] – [22] kan forudsige udvidelsen af mange solide tumorer med god nøjagtighed, de ikke udtrykkeligt overveje celle dynamik inde i tumorer. Især har den uforanderlige fremkomsten af et plateau fase efter tumorer nået en vis størrelse er aldrig blevet tilfredsstillende forklaret. Da de fleste faste tumorer større end 1 mm i diameter inducerer angiogenese [3], bør næringsstof eller iltsvind ikke begrænse tumorvækst. Vores undersøgelse viser, at vækst-induceret solid stress kan påvirke cellernes fænotype, og antyder, at der kan være en “dynamisk ligevægt” af proliferation og apoptose, der opretholder tumorstørrelse i plateaufase, som foreslået af Holmgren et al [23].
apoptotisk celledød forårsaget af en sådan stress er af særlig interesse. Apoptose under udviklingen er generelt menes at være udløst af vækstfaktorer og andre miljømæssige stikord [24], [25], og har først for nylig været betragtet rolle mekanisk belastning i denne proces [26], [27]. Vores resultater antyder, at inhomogeniteter i de mekaniske egenskaber af den omsluttende væv kan vejlede morfologiske ændringer i tumorvækst, uafhængigt af cellemigrering, ved at inducere apoptose i regioner med høj trykspænding og tillade spredning i regioner med lav spænding. Desuden kompression-induceret apoptose sker via mitokondrier vej, en myndighedskontrol mekanisme, kræftceller med forhøjet Bcl-2 aktivitet kan slippe for at producere mere maligne tumorer.
Materialer og metoder
Cell kultur
Ikke-metastatiske murine brystcarcinomceller 67NR blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) og blev anvendt til de fleste af forsøgene i denne undersøgelse. Metastatiske murine brystcarcinomceller EMT6 blev generøst giver af Dr. James Freyer (Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM). 67NR celler blev opretholdt i høj-glucose (4,5 mg /ml) Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM, Sigma, St. Louis, MO) suppleret med 1% ikke-essentielle aminosyrer (Invitrogen, Carlsbad, CA) og 10% føtalt bovint serum (FBS). EMT6 celler blev holdt i alpha-minimalt essentielt medium (Mediatech, Manassas, VA) suppleret med 10% FBS. Til forsøg, der kræver glucose-fri, serum-frit og hypoxisk miljø (betegnet den “sult medium”), sfæroider blev dyrket i glucose-DMEM (Invitrogen) ikke tilsat FBS, og i 5% CO
2-1% O
2-N
2 biomedicinsk luft (Airgas East, Salem, NH).
Anti-apoptotiske transduktion med Bcl-2 og crmA
En million cancerceller blev udsået i en 10 cm diameter petriskål og transficeret via tilsætning af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) og plasmid DNA indeholdende fuldlængde murint Bcl-2 (ATCC) eller cytokin respons modifikator a (crmA, generøse gave fra Dr. Brian Seed på Massachusetts General Hospital, Boston, MA) cDNA og puromycin selekterbare markør. Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne passeret og selektionsmedium indeholdende 20,0 ug /ml puromycin tilsat. Efter 7-10 dages dyrkning i dette medium, forblev kun få kolonier; disse blev samlet sammen og opformeret i nærvær af selektion-niveau puromycin. Ekspression af Bcl-2 og crmA i de transficerede celler blev bestemt ved kvantitativ realtids-PCR (Bcl-2) eller PCR (crmA) med passende primere. Når først en stabil transficeret cellelinie blev etableret, blev cellerne opretholdt i nærvær af selektion-niveau puromycin.
PCR-assays
Kvantitativ realtids-PCR (ABI Prism 7300, Applied Biosystems, Foster city, CA) blev anvendt til at bestemme mRNA-niveauet af Bcl-2-genet transficeret ind cancerceller. De termiske cykelforhold bestod af 35 cykler af PCR-amplifikation (denaturering: 95 ° C 30 sek, annealing /forlængelse: 68 ° C, 1 min). MRNA-niveauet af crmA genet blev vurderet ved anvendelse konventionel PCR-assay. De følgende sense- og antisense-primere blev udformet under anvendelse Primer2 software (Applied Biosystems): Bcl-2: 5′-GGGATGCCTTTGTGGAACTATATG og CTGAGCAGGGTCTTCAGAGACA-3 ‘; crmA: 5’-AAGCTTATGGATATCTTCAG og GCCTGCCGCTTAATTAGTTGT-3 ‘; og GAPDH:. 5’-ACAGCCGCATCTTCTTGTGCAGTG og GGCCTTGACTGTGCCGTTGAATTT-3 ‘
Kultur af tumor sfæroiderne co-indlejret med mikro-perler i agarosegeler
For at overvåge klumpformet vækst og stress ophobning, passende mængder af GFP- eller RFP-mærkede enkelt- cancerceller, 1 um (diameter) carboxylat–modificerede fluorescerende kugler (Molecular Probes, Eugene, OR), 2,0% (w /v) agarose (type VII, lav geleringstemperatur, Sigma, St. Louis , MO) stamopløsning (1X PBS) og cellekulturmedium blev blandet så at de endelige koncentrationer af celler, mikro-perler og agarose var 3,5 × 10
3 celler /ml, 4,5 × 10
5 perler /ml og 0,5% eller 1,0% hhv. Bunden af en 10 mm x 2 mm (diameter x dybde) cylindrisk brønd i en 5 mm tyk glasplade (custom made) blev først belagt med 50 pi 1,0% cellefri agarosegel for at forhindre cellevedhæftning. 300 pi af celle /micro-beads /agarose blanding blev derefter tilsat til brønden og får lov at polymerisere i 10 minutter ved stuetemperatur. Objektglasset blev derefter anbragt i en 100 mm x 25 mm petriskål fyldes med 40 ml celledyrkningsmedium (se forsøgsopstilling i supplerende Fig. S1
A
). Mediet blev genopfyldes hver 5 dage.
Imaging og kvantificering af matrix kompression omkring voksende sphæroider
Vi målte mængden af voksende sfæroider og 3D distributionen af deres omgivende mikro-perler hver 5-7 dage ved hjælp af et Olympus FlouView 500 konfokalmikroskop systemet (Olympus, center Valley, PA). På hvert tidspunkt blev et volumen på 638 um × 638 um x 250 um afbildes så ækvator af sfæroid blev centreret ved volumenet bund overflade; trinstørrelsen i Z var 1 um. Tre kontrol billedstakke af mikroperler blev derefter erhvervet under anvendelse af samme procedure, men i nærliggende sfæroide-frie områder på mindst 500 um væk fra enhver sfæroide (så at vulsten densitet blev ikke påvirket af vækst-induceret kompression). For at bestemme den lokale mikro-perle densitet som funktion af afstanden fra sfæroide en Matlab (Mathworks, Natick, MA) rutine beregnes den mindste afstand fra hver mikro-perle til sfæroid overflade og efterfølgende den relative tæthed af mikro- perler i 10-um tyk “skaller” omkring klumpformet (
ρ
perler, normaliseret til mikro-perle tæthed i kontrol billedstakke). Den stamme af agarosegel i disse skaller beregnes herefter som
ε
gel = 1-1 /
ρ
perler. Denne procedure bevaret effekten af mikroskopiske variation i klumpformet overflade form på matrix deformation.
Kultur af tumor spheroids i hængende dråber
For at oprette tumor sfæroider for eksternt anvendte komprimering eksperimenter, vi brugte hængende dråbe-metode. Kort fortalt, 20 pi dråber af cancer cellesuspension (3,0 x 10
5 celler /ml for 67NR og 2,0 × 10
5 celler /ml for EMT6) tilsat til indersiden af en 10 cm diameter petriskål cover . Efter placering af dækslet tilbage på fad fyldt med 10 ml dyrkningsmedium, blev fadet placeret i inkubatoren (5% CO
2, 37 ° C) for at tillade klumpformet vækst inden for hver dråbe. Sphæroider normalt nået omkring 300 um i diameter efter 3 dages kultur.
Komprimering af monolag af kræftceller og tumor sfæroider
Til komprimering af monolag af kræftceller, cellerne blev podet på membranen af en 6-brønds Transwell indsætte med 0,4 um porer (Corning, Lowell, MA). 1,5 ml og 2,5 ml celledyrkningsmedium blev tilsat til de øvre og nedre kamre i brønden hhv. Efter inkubation natten over (for celleadhæsion til membranen), et lag af 2 mm tykt 1% agarose gel blev anbragt på toppen af cellerne og stempler med ønsket vægt blev derefter påført på agarosegelen til kompression (se forsøgsopstilling i tillægs- fig. S1
B
). Under kompressionen, transwell porerne i indsatsen membranen tillades konvektion af fluid ud af gelen og også diffusion af næringsstoffer, vækstfaktorer og ilt til sfæroiderne. Til komprimering af tumor sfæroider blev sfæroiderne dyrket i hængende dråber opsamlet og resuspenderet i 1,0% agarose-opløsning. 1 ml af opløsningen blev derefter tilsat i en 6-brønds Transwell indsætte med 0,4 um porer i sin membran, hvilket gør geltykkelsen ~ 2 mm. Den sfæroid-agarose blanding fik lov at gelere i 20 minutter ved stuetemperatur, hvorefter 1,5 ml og 2,5 ml celledyrkningsmedium blev tilsat til de øvre og nedre kamre i brønden hhv. Den sfæroid-gel konstruktion blev derefter komprimeret med et stempel af den ønskede vægt (se forsøgsopstilling i supplerende Fig. S1
C
).
Farvning og billeddannelse af spredning, caspase-3 aktivitet og nekrose i tumor sfæroider
prolifererende celler i sfæroider blev detekteret med en celleproliferation Fluorescence Kit (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) pr fremstillingen protokol. Kort fortalt blev sfæroider mærket med et BrdU mærkningsreagens, fast (1% formalin, 0,1% Triton i PBS), inkuberet med et anti-BrdU /Nuclease reagens og endelig inkuberet med Cy5 mærket gede-anti mus IgG. Caspase-3-aktivitet og nekrose i cancerceller eller sfæroider blev påvist med Nucview 488 caspase-3 Assay Kit for levende celler (Biotium, Hayward, CA) og propidiumiodid (PI, Molecular Probes, Eugene, OR), hhv. Monolag af celler blev farvet i 15 minutter og sfæroide-gel konstruktioner farvet i 45 minutter ved 4 ° C og skyllet to gange med frisk medium. De mærkede celler blev afbildet ved anvendelse af et Olympus FlouView 500 konfokalt mikroskopsystem (Olympus, Center Valley, PA). Resultaterne blev kvantificeret som procentdelen af caspase-3 /PI-positive celler i populationen.
Immunohistokemiske assays for apoptotisk i tumor sfæroider
Sfæroider blev fikseret i 4% paraformaldehyd i 4 timer og derefter indlejret i paraffin. 5 um snit blev skåret fra paraffinblokke og cancercellerne blev farvet for apoptose med ApopTag® (CHEMICON International, Temecula, CA). Cellerne blev counter-farvet med hæmatoxylin.
Statistik
Værdier var præget af det aritmetiske gennemsnit og standardafvigelse af middelværdien (SEM). Væsentlige forskelle mellem forskellige populationer af data blev testet med Student
t
-test for uparrede observationer.
Støtte oplysninger
supplerende metoder S1.
doi: 10,1371 /journal.pone.0004632.s001
(0,05 MB DOC)
Figur S1.
Eksperimentelle opsætninger. (A) dyrkning tumor sfæroider co-indlejret med mikroperler i agarosegel. (B) Anvendelse exogent, veldefineret trykspænding til et monolag af kræftceller. (C) Anvendelse eksogene, veldefinerede trykspænding til tumor sfæroider vokset til en ønsket størrelse i hængende dråber
doi:. 10,1371 /journal.pone.0004632.s002
(14,63 MB TIF)
Figur S2 .
Analyse af 2D-billeder. (A-G) Kvantificering lokal deformation i en tumor sfæroide (grøn, GFP-transduktion) og den tilsvarende lokale stammen i agarosegel under anvendelse mikroperler (rød). (H-K) Kvantificering lokal del af nekrotisk område (rød, propidiumiodid-farvning) i en sfæroid (grøn, GFP-transduktion). (L) Korrelere de asymmetrier i klumpformet form og i gel stamme. (M) Korrelere de asymmetrier i klumpformet nekrose og i gel stammen
doi:. 10,1371 /journal.pone.0004632.s003
(5,25 MB TIF)
Figur S3.
Udviklingen af caspase-3 aktivitet (grøn, venstre kolonne) og nekrose (rød, central søjle) i voksende tumor sfæroider (transmitteret billede overlejret med caspase-3 og nekrose billeder, højre kolonne) i 1% agarose. Scale bar = 20 um
doi:. 10,1371 /journal.pone.0004632.s004
(7,48 MB TIF)
Movie S1.
3D-gengivelse af en fladtrykt tumor klumpformet dyrket i 0,5% agarose gel
doi:. 10,1371 /journal.pone.0004632.s005
(3,13 MB MOV)
Movie S2.
Billedanalyse at kvantificere lokal tumor klumpformet deformation
doi: 10,1371 /journal.pone.0004632.s006
(0,45 MB MOV)
Movie S3.
Billedanalyse at kvantificere lokal belastning i agarosegel forårsaget af tumor klumpformet vækst
doi:. 10,1371 /journal.pone.0004632.s007
(0,56 MB MOV)
Movie S4.
Billedanalyse at kvantificere lokal celledød i tumor klumpformet
doi:. 10,1371 /journal.pone.0004632.s008
(0,31 MB MOV)
Tak
Vi tak Drs. Patrick Au, Yves Boucher, Emmanuelle di Tomaso, Igor Garkavtsev, Shan Liao, Tim Padera, og Lei Xu (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) for at bidrage ekspertise til denne undersøgelse, Dr. Brian Seed (Massachusetts General Hospital, Boston, MA ) for CrmA plasmider og Dr. James Freyer (Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM) for EMT6 celler.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.