PLoS ONE: Short-Term PTEN Hæmning Forbedrer in vitro Aktivering af primordiale follikler, Bevarer Follicular Levedygtighed, og gendanner AMH Niveauer i kryopræserveret ovarievæv fra kræftpatienter

Abstrakt

Introduktion

In vitro

aktivering og vækst af oprindelige hvilende hårsække til at producere fertilizable oocytter vil være et nyttigt redskab for frugtbarhed konservering. Beskæftigelsen af ​​fosfatase og Tensin homolog (PTEN) hæmmere i kombination med protein kinase B (Akt) stimulerende molekyler, er tidligere blevet anvendt til at øge follikulært aktivering gennem stimulering af PTEN-Akt pathway.

Metoder

Vi tilstræber at etablere forbedret

in vitro

aktivering også for kræftpatienter, hvis ovarievæv er allerede kryopræserveres. Frisk og tidligere kryokonserveret menneske æggestokkene cortex blev udsat for kortvarig, lav koncentration og æggestok-specifik behandling med kun en PTEN-hæmmer.

Resultater

Vores

in vitro

aktivering protokol forbedrer aktivering mekanismer primordiale follikler i både friske og kryopræserverede prøver, og forstørrer voksende befolkninger uden at inducere apoptose i enten follikler eller det omgivende stroma. Behandling øger estradiol sekretion og gendanner ekspressionsniveauerne af den tidligere formindsket anti-mullerian hormon ved hjælp af kryopræservering procedurer. Genomisk modulation af den relative ekspression af

PTEN

pathway-gener blev fundet i behandlede prøver.

Konklusion

in vitro

aktivering protokol giver nye alternativer til patienter med kryopræserveret væv, da det øger den pulje af levedygtige aktiverede follikler rådighed for

in vitro

procedurer vækst. Kombinationen af ​​ovarievæv nedfrysning og

in vitro

aktivering af primordiale follikler, den vigtigste æggestokkene reserve komponent, vil være en stor fremgang i fertilitet konservering

Henvisning:. Novella-Maestre E, Herraiz S , Rodríguez-Iglesias B, Díaz-García C, Pellicer A (2015) Short-Term PTEN Hæmning Forbedrer

In vitro

Aktivering af primordiale follikler, Bevarer Follicular levedygtighed, og gendanner AMH Niveauer i kryopræserveret æggestokkene væv fra kræftpatienter . PLoS ONE 10 (5): e0127786. doi: 10,1371 /journal.pone.0127786

Academic Redaktør: Wei Shen, Qingdao Landbohøjskole, KINA

Modtaget: Januar 12, 2015; Accepteret: 19. april, 2015; Udgivet: May 29, 2015

Copyright: © 2015 Novella-Maestre et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde er blevet støttet af Grants SAF 2011-30.031-CO2-01 og FIS PI13 /02353 fra det spanske økonomi- og konkurrenceevne ved Dexeus Kvinders Health Foundation Grant 2011 og ved PROMETEOII /2014/045 og GV /2014/115 af det regionale Valencia Undervisningsministeriet. SH deltagelse er blevet støttet af en bevilling CD11 /00292 fra det spanske økonomi- og konkurrenceevne og BRI af AP-2010-0675 bevilling fra det spanske Ministerium for Undervisning, Kultur og Sport. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Overlevelse efter kræft i ungdomsårene og barndom har forbedret [1]. Således en stor bestand af unge kvinder, som ikke har opfyldt deres reproduktive projekt, vil lide sekundære virkninger af kræftbehandling, såsom gonadetoksicitet. Denne omstændighed, sammen med det faktum, at vores samfund forsinker fødedygtige alder [2], betyder, at fertiliteten konservering (FP) bliver i stigende grad anmodes, især hos unge kræftpatienter.

Flere muligheder er i øjeblikket tilgængelig for kvindelig FP, såsom nedfrysning af oocytter [3], embryoner [4], eller ovarievæv [5-7].

æggestokkene cortex indeholder hvilende primordiale follikler karakteriseret ved deres modstandsdygtighed over for frost og tø processer. Givet disse egenskaber, kryopræservering af æggestokkene cortex til efterfølgende autolog orthotransplantation er den mest udbredte teknik til at bevare fertiliteten hos cancerpatienter [8]. Desuden er det den eneste mulighed i pædiatriske patienter med ingen modne oocytter at være kryopræserveret, og i tilfælde af hormonafhængige sygdomme [9, 10].

Det samlede antal af tilgængelige primordiale follikler er blandt andet vigtigt spørgsmål, at den vigtigste faktor sikre FP succes. Det kan blive kompromitteret af flere faktorer, såsom æggestokkene cortex størrelse, alder, tidligere kemoterapi, og andre potentielle effekter af kræft på kvindelige gonader. Det er allerede blevet offentliggjort, at maligne sygdomme, såsom brystkræft, kan også påvirke reproduktive udfald som æggestokkene reserve er svækket hos unge kvinder med kimcellelinje

BCRA1

mutationer [11]. Æggestokkene svar på kontrollerede stimulerende cyklusser mindskes i kræftpatienter, selv før de modtager nogen behandling [12]. Ikke desto mindre er risikoen for at genindføre maligne celler i transplanteret væv er den største bekymring for ovarie kryopræservering. Denne bivirkning er øget risiko [13-15] hos patienter med hæmatologiske kræftformer, såsom leukæmi, den almindeligste malignitet af barndommen [16]. Derfor bør udvikles nye sikre alternativer til at optimere æggestokkene reserve i disse patienter, hvor nedfrysning og transplantation af æggestokkene cortex er kontraindiceret [17], eller til pædiatriske patienter, der ikke har nogen modne oocytter skal kryopræserveres [18].

Som et tidligere trin til vækst, primordiale hvilende hårsække, den vigtigste æggestokkene reserve komponent [19, 20], der skal aktiveres for deres udviklingsmæssige program til at starte. Forskellige veje er involveret i follikel-aktivering vejledning gennem styring af oocyt vækst initiering og vedligeholdelse, såsom fosfatase og tensin homolog slettet på kromosom 10 (PTEN), phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), forkhead boks O3 (FOXO3), og den mammale mål for rapamycin kompleks en (mTORC1) [21-26]. Ikke desto mindre er de underliggende mekanismer for aktivering forbliver ukendt.

Det er blevet rapporteret, at væksten i alle primordiale follikler i neonatale og voksne dyr fremmes af oocyt-specifikke sletning af

PTEN

gen [21, 24-26]. Dette gen koder for et fosfatase enzym, der negativt regulerer PI3K-protein kinase B (AKT) signalvejen.

PTEN

sletning øger Akt phosphorylering og den nukleare eksport af downstream FOXO3 proteiner [24]. Faktisk

FOXO3

gendeletion aktiverer også alle hvilende hårsække i mus. For nylig, Li et al. 2010 [26] udviklet en kortsigtet, æggestok-specifik behandling af gnavere og menneskelige æggestokke med en PTEN-hæmmer og /eller et PI3K aktivator. Behandling øget FOXO3 nukleare ekstrudering i primordiale oocytter, der førte til deres aktivering.

Baseret på disse resultater blev et klinisk forsøg udført af Kawamura [27] for at undersøge effektiviteten af ​​PTEN hæmmere og Akt stimulator molekyler, der anvendes for

in vitro

aktivering (IVA) procedure hos kvinder med tidlig ovariesvigt. Denne undersøgelse beviste, at de resterende hvilende hårsække af æggestokkene reserve kan reddes ved at inducere aktivering mekanismer til at producere fertilizable oocytter.

Fremme af disse resultater, er formålet med denne undersøgelse var at opnå aktivering af humane dvælende primordiale follikler nedsænket i æggestokkene cortex fra kræftpatienter gennem inkubation med en PTEN-inhibitor for at undgå oocyt nedbrydning til, derfor øge “pool” af levedygtige primordiale follikler rådighed for

in vitro

procedurer vækst.

Materiale og Methods Salg

Kemikalier

Alle kemikalier, dyrkningsmedier og reagenser, der anvendes i denne undersøgelse blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), med mindre andet er anført.

studie design

Etik redegørelse og væv kollektion.

Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Board of Hospital Universitario y Politécnico La Fe, Valencia, Spanien (2011/0018) og udført i henhold til principperne i Helsinki-erklæringen. Efter opnåelse af skriftligt informeret samtykke, 18 menneskelige æggestokkene cortex biopsier fra kvinderne rekrutteret i vores fertilitet Preservation Program blev opnået. Æggestokkene cortex biopsier blev kun medtaget, hvis det resterende væv var til rådighed efter æggestokkene cortex kollektion for frugtbarhed præserveringsformål. Patienterne blev ramt af brystkræft (n = 8), rhabdomyoma (n = 1), akut lymfoblastisk leukæmi (n = 1), Hodgkin lymfom (n = 4), anti-syntetase syndrom (n = 1), Ewing’s sarkom (n = 1), medulloblastom (n = 1) og ikke-Hodgkin lymfom (n = 1). Den gennemsnitlige patientens alder var 27,8 (spændvidde 14-37) år. Ingen patienter havde gennemgået kemo /strålebehandling før ovarie cortex ekstraktion. Æggestokkene biopsier (en omtrentlig tykkelse på 10x10x1 mm) blev straks vasket med serumfrit M199-medium ved 37 ° C, dissekeret ved fjernelse medulla og skæres i to stykker: en til at teste IVA protokollen i frisk væv, og den anden til at teste det i kryopræserveret /optøet væv. På grund af den begrænsede stikprøvestørrelse, kun 14 af de 18 opnåede biopsier indgik i kryopræserverede gruppe

Eksperimentelle grupper

Frisk æggestokkene stykker (n = 18) blev inddelt i strimler..; man blev straks fast til at fungere som en indledende frisk kontrol tilstand væv og blev tildelt gruppe 1 (S1 Fig); den anden blev tildelt gruppe 2 og var

in vitro

aktiveret og dyrket i 25 timer med PTEN-hæmmer.

For at vurdere, om der var nogen skadelige virkninger som følge dyrkningsbetingelser, ekstra friske æggestokkene strimler (n = 9) blev tildelt gruppe 3 og blev inkuberet under de samme betingelser som de aktiverede dem, men uden PTEN-inhibitor til at fungere som en frisk kulturperler kontrol.

Kryopræserverede /optøede æggestokkene stykker ( n = 14) blev også delt i strimler; man blev rettet straks efter optøning til at fungere som en første betingelse kryopræserveret kontrol væv og blev udnævnt som Group 4; en anden blev tildelt til gruppe 5, der skal inkuberes og dyrkes med PTEN inhibitoren i 25 timer; en tredje blev dyrket i 25 timer uden PTEN inhibitor og blev betragtet som den kryopræserverede dyrkede kontrol, kaldet Gruppe 6.

Prøverne fra de friske og kryopræserverede dyrkede kontrolgrupper (gruppe 3 og 6) blev anvendt til TUNEL-assay og hormonproduktionen kvantificering ved hjælp af ELISA som beskrevet nedenfor.

ovarievæv Kryopræservering og optøning.

En langsom-frysning teknik blev anvendt til at kryopræservere æggestokkene strimler. M199 dyrkningsmedium indeholdende 5% humant serumalbumin (HSA) og 10% dimethylsulfoxid (DMSO), blev anvendt som en kryobeskyttende opløsning. DMSO blev sekventielt tilsat i en 2-trins procedure og fragmenter blev fordelt i ethylvinylacetat poser (Cryocyte, Baxter Healthcare, Deerfield, IL, USA). Forseglede poser blev anbragt i fryserummet af et kontrolleret-hastighed frysning indretning (Planer). En langsom-frysning protokol blev anvendt efter den samme procedure i øjeblikket ansat til kliniske formål i vores frugtbarhed konservering program. Poser blev opbevaret i flydende nitrogen (-196 ° C), som beskrevet tidligere [28, 29]. Optøning fandt sted efter 24 timer. Tasker blev optøet og kryobeskyttelsesmidlet elueres ved hjælp af en 3-trins-protokol, som beskrevet andetsteds [28, 29].

IVA protokol

Kortsigtede inkubationer med Dipotassium Bisperoxo (picolinato) oxovanadate V, PTP Inhibitor XV (BPV (pic)), blev udført som en IVA protokol. Kort beskrevet blev aktiverede prøver først inkuberet i 1 time med 100 uM af BPV (pic) (Calbiochem, Merck KGaA, Tyskland) i α-MEM-medium suppleret med 10% HSA og 1% Antibiotika-antimycotisk opløsning (ATB). Derefter blev prøverne inkuberet i 24 timer med de samme medier (100 uM BPV (pic) + 10% HSA, 1% ATB- α-MEM) suppleret med 0,3 I.U af FSH. Alle inkubationer blev udført under standard dyrkningsbetingelser ved 37 ° C, 5% CO

2.

I de dyrkede kontrolgrupper (G3 og G6), blev prøver inkuberet under de samme betingelser, men BPV ( pic) blev ikke tilsat til dyrkningsmediet. Efter IVA procedure og dyrkning blev prøver fikseret i neutral bufret formalin og dyrkningsmediet blev straks opbevaret ved -80 ° C i hormon kvantificering.

Histologisk evaluering og follikulære tællinger Salg

formalinfikserede prøver blev paraffinindlejrede (FFPE) og skåret i 4-um tykke snit. Hver 10

th afsnit blev farvet med hæmatoxylin-eosin (H Primære fase: oocytten var omgivet af et komplet lag af kubisk GC; Sekundære trin: oocytten var omgivet af to lag, eller flere, af kubisk GC [19]. Follikler blev talt kun, når oocyt kerne var til stede for at undgå dobbelttælling. Kun raske follikler [30] blev talt at fastsætte tætheder og procenter af hvilende (primordiale) og voksende follikler (primære, sekundære). Alle H for de positive kontroller en ekstra slide, indeholdende lunge, proliferative endometrium og testis, var inkluderet.

Follikler blev anset aktiveret, når FoxO3 nukleare ekstrudering på ægget blev opdaget. Ki-67 og AMH var positive, når påvist i GC og i oocyt kerner /GC henholdsvis.

AMH og estradiol (E2) produktions-

For AMH beslutsomhed, dyrkningsmedierne prøver blev analyseret af AMH-Gen-II ELISA (Beckman Coulter, Immunotech, Texas, USA) efter den producentgaranti protokol. Kort fortalt blev prøver og kontroller dispenseres i mikro-titreret brønde belagt med anti-AMH antistof. Efter inkubering og vask blev biotinmærket anti-AMH detektionsantistof tilsat. Efter vask blev streptavidin-peberrodsperoxidase tilsat til brøndene og udvikles. Derefter absorbansen blev målt i en automatisk ELISA-læser (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Detektionsgrænsen (LOD) af AMH-analysen var 0,08 ng /ml; dette assay detekterer ikke inhibin A, activin A, FSH og LH. De intra- og inter-assay variationer var 3,7% og 4,4%, henholdsvis.

E2 blev målt med Østradiol EIA kit (Cayman Chemical Company, Michigan, USA). Analysen blev udført ved at følge producentgaranti protokol i ufortyndede prøver. Absorbansen blev målt ved 405-420 nm. LOD af E2-analysen var 20 pg /ml, og interferens med andre steroidhormoner var 0,01%. For 102,4 pg /ml, de intra- og inter-assay variationer var 13,0% og 8,2%, henholdsvis.

I begge analyser, absorbans var omvendt proportional med koncentrationen af ​​AMH og E2 i prøverne, som var beregnet ud fra kalibreringskurven. Prøver blev kørt tredobbelt. Resultaterne blev udtrykt i ng /ml og pg /ml, og også i henhold til den etablerede standardkurve.

Apoptose kvantificering af TUNEL

DNA-fragmentering blev registreret af TdT (terminal deoxyribonukleotidyl transferase) -medieret dUTP nick-end mærkning (TUNEL) under anvendelse TMR røde

in situ

afsløring celledød kit (Roche Diagnostics, Tyskland). Tre paraffinindstøbte snit per prøve blev ryddet med xylen og rehydreret (ethanol, destilleret vand) forud for at blive analyseret. Efter vask med PBS, antigen-genvinding med 10 mM citratpuffer blev udført i en mikrobølgeovn i 5 min. Derefter Objektglassene blev inkuberet i 60 minutter ved 37 ° C inde i en mørk befugtet kammer med 50 pi af reaktionsblandingen TUNEL; denne blanding blev udeladt i den negative kontrol. Prøverne blev monteret med forlænge Guld antifade Reagens med DAPI (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA) og undersøges under et mikroskop ved konventionel fluorescens. Den apoptotiske signal blev registreret som positiv, når dUTP farves kernen rød.

Cell skader blev kvantificeret i primordiale follikler, den vigtigste æggestokkene reserve komponent, og i æggestokkene stroma. Follikler blev anset beskadiget, når oocyt kerne eller mere end 50% af GC, blev farvet røde af dUTP. I æggestokkene stroma blev celledød undersøgt af TUNEL udtrykt som procent af celledød [(TUNEL + celler /totale celler) * 100]. Den apoptotiske sats af IVA grupper (G2 og G5) blev sammenlignet med deres respektive dyrkede kontroller (G3 og G6). Udvælgelsen af ​​de dyrkede kontroller tilladt os at belyse hvis skaden celle, når de observeres, kan skyldes PTEN inhibering eller blot at dyrkningsbetingelserne. Desuden apoptotiske klasse påvist i frisk æggestokkene cortex eller fremkaldt af kryokonservering teknikker, er tidligere blevet etableret [28, 31-34].

For at kvantificere TUNEL-analysen, billeder i høj opløsning blev opnået ved lysmikroskopi ( LEICA DM4000B, Leica Microsystems GmbH, Tyskland) med et digitalt kamera vedlagt (LEICADFC450C, Leica Microsystems GmbH, Tyskland). Kvantificering blev vurderet ved Image ProPlus 6.3 software (Media kybernetik Inc. Rockville, MD, USA).

Relativ genekspression af PTEN vej

mRNA blev opnået fra 7-9 FFPE æggestokkene prøver af hver gruppe med Recover All Total Nucleic Acid Isolation Kit (Ambion, Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA) ved at følge producentgaranti protokol. For hver prøve blev fire 15-um slides brugt. Så cDNA blev syntetiseret med MultiScribe revers transkriptase fra High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Byosistems, Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA). Specifikke Taqman sonder blev analyseret af Real-Time PCR at kvantificere den relative ekspression af følgende gener:

PTEN

,

PI3KCB

,

Akt1

FOXO3

. PCR reaktionsblandinger blev fremstillet med 100 ng cDNA som en template i 1xTaqman Gene Expression Master Mix efter producentgaranti protokol. Derefter blev prøverne amplificeret i 7900HT Fast PCR-system (Applied Byosistems, Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, USA). PCR-betingelser bestod i en indledende aktivering af uracyl-

N

-glycosylase ved 50 ° C i 2 min., Efterfulgt af AmpliTaq Gold-aktivering ved 95 ° C i 10 min. Derefter blev prøverne cyklet 40 gange ved denaturering ved 95 ° C i 15 sekunder, og en annealing forlængelse ved 60 ° C i 1 minut per cyklus. Hver prøve blev analyseret tre gange.

Efter justering amplificeringseffektiviteten af ​​målene gener, den relative ekspression blev opnået ved den sammenlignende Ct-metoden (DDCt) [35]. Udtrykket af target-gen mRNA blev normaliseret med ekspression af 18S reporter genet.

Statistisk analyse

Alle data præsenteres som gennemsnit ± SEM. Den Friedman test, efterfulgt af en Wilconox parret

post hoc

test blev udført for at evaluere resultaterne mellem grupper. p 0,05 værdier blev betragtet som statistisk signifikant. Alle analyser blev udført med SPSS 19,0 (IBM, Somers, NY, USA)

Resultater

Follikulære tætheder og befolkninger

Blandt de H . E-farvede æggestokkene sektioner blev 597 follikler talt og undersøgt. Når primordiale, primære og sekundære tætheder blev sammenlignet blandt de aktiverede prøver og deres respektive indledende tilstand kontroller (G1 og G4), blev påvist væsentlige forskelle i de friske eller kryopræserverede prøver (p = ns), eller når de blev sammenlignet med den kultiverede kontrolgrupper (G3 og G6) (tabel 1).

de eksperimentelle interventioner udført på æggestokkene væv prøver indgår i hver forsøgsgruppe af vores undersøgelse er anført i tabel 1. Follikulære tætheder og de procentdele af hver population blev beregnet. Værdierne er udtrykt som middelværdi ± SEM. Det kryopræserverede aktiveret (G5) gruppe viste statistisk signifikante forskelle for andelen af ​​hvilende og voksende follikler forhold til den oprindelige tilstand.

Men efter aktivering, de procentsatser af primordiale follikler sænket i både de friske og kryopræserverede IVA grupper, når sammenlignet med de oprindelige tilstand kontrol af væv (Gruppe 1: 62,3 ± 8,3%; G2: 47,9 ± 8,2%; G4: 55,0 ± 6,1%; G5: 38,2 ± 7,1%), men de procentdele af de voksende dem øget (G1: 37,7 ± 8,3%; G2: 52,03 ± 8,2%; G4: 46,9 ± 6,1%; G5: 61,9 ± 7,1%) sammenlignet med deres kontroller, eller når der sammenlignes med de dyrkede kontroller (G3 og G6). Dette fænomen var statistisk signifikant kun i G5-gruppen (p = 0,02 og p = 0,03, henholdsvis).

For at belyse, om der var nogen forskel mellem vores straks fast kontrol og de dyrkede kontroller, en sonderende undersøgelse blev udført (S1 tabel). Der blev ikke påvist mellem de friske og cryopræserverede indledende tilstand kontrol væv når primordiale, primære og sekundære follikulært tætheder blev sammenlignet med deres respektive dyrkede kontrol væv, eller når de hvilende og voksende befolkninger blev sammenlignet.

follikulært aktivering

FOXO3 nuklear eksport, en indikator for follikel-aktivering, blev overvåget (fig 1A og 1B) og kvantificeret (fig 1C og 1D) i de aktiverede prøver, og også i deres respektive kontroller. En 3-fold stigning i andelen af ​​aktiverede primordiale follikler blev set i de friske aktiverede prøver (G2: 59,55 ± 9,88%) i forhold til deres oprindelige kontrol (G1: 23,69 ± 5,71%, p = 0,03). Når primær follikel-aktivering blev analyseret, var det ikke statistisk signifikant på trods af stigningen på 15% observeret i den aktiverede gruppe (G2: 80,44 ± 4,8%, G1: 66,4 ± 8,9%, p = NS). I de kryopræserverede aktiverede prøver (G5), IVA-protokollen produceret en betydelig stigning 2 gange i primordiale og primær follikel aktivering (Fig 1D) sammenlignet med deres kontrolgruppe (Primordial: G5: 63,7 ± 8,9%; G4: 36,8 ± 7,2 %, p = 0,04 og den primære: G5: 93,80 ± 2,4%; G4: 47,5 ± 8,9%; p = 0,03)

(A) og (B);. FOXO3 påvisning og lokalisering til overvågning follikulært aktivering. Follikler fra G2 og G5 prøver er vist henholdsvis. Bemærk, at de aktiverede hårsække fra G2 og G5 grupper udgør en FOXO3 nuklear ekstrudering (pil) og et positivt signal i GC; (C) procentdelen af ​​primordiale follikler aktivering blev vurderet i friske ovariale væv, og der blev observeret en signifikant stigning i G2 sammenlignet med G1 (* p = 0,03); (D), når den aktiverede ur follikulært procentdel blev sammenlignet i den tidligere kryopræserveret-optøet gruppe blev follicle aktivering forbedret i G5 vs. G4 (** p = 0,03); (E) frisk aktiveret prøve (G2), primordial follikel viser Ki-67 farvning i GC og oocyt kerner; F) Ki-67-positivt signal i oocytter fra de primordiale follikler fra kryopræserverede-aktiverede prøve (G5); (G) kvantificering af AMH ekspression i GC. En stigning i AMH ekspression blev observeret i GC fra hårsække i både G2 (§ p = 0,006) og G5 (§§ p = 0,008) som følge af den

in vitro

aktivering procedure med 100 uM af BPV (pic); (H) estradiol sekretion til kulturmedier. Som grafen viser,

in vitro

aktivering procedurer steg E2-sekretion i

in vitro

aktiveret frisk (G2

vs

. G3 * p = 0,036) og kryopræserveret (G5

vs

. G6 ** p = 0,001) prøver sammenlignet med deres egne kontroller.

spredning og vækst til sekundære stadier

Ki-67-positive celler blev påvist i oocytter og GC fra alle de aktiverede prøver (fig 1E og 1F). Dette fund viste, at BPV (pic) eksponering, selv efter kryopræservering procedurer, påvirker ikke den proliferative evne primordiale og primære follikler.

AMH immunfarvning afslørede en signifikant stigning, på omkring 23-30%, i AMH positive hårsække efter IVA behandling i de aktiverede prøver fra grupper G2 og G5 i forhold til de oprindelige tilstand kontrol af væv (G1: 53,3 ± 8,7%

vs

.G2: 76,3 ± 9,4%; p = 0,006 og G4: 25,7 ± 8,2%

vs

G5: 54,5 ± 10,2%; p = 0,008) (fig 1G)

AMH og Estradiol produktion

Kvantificering af AMH.. i kultur viste medium at IVA protokollen signifikant øget koncentrationen AMH i de friske aktiverede prøver sammenlignet med den dyrkede kontrolgruppe (G2: 0,34 ± 0,1 ng /ml

vs

G3:. 0,47 ± 0,1 ng /ml ; p = 0,017). Imidlertid blev denne stigning ikke detekteres i de tidligere kryopræserverede prøver, hvor AMH niveauer forblev under det lave LOD i alle de analyserede prøver.

En signifikant stigning i E2-koncentration secerneres til dyrkningsmediet blev påvist i både den friske (G3: 84,9 ± 17,7 pg /ml

vs

G2: 98,6 ± 22,9 pg /ml; p = 0,036). og kryopræserverede IVA grupper (G6: 33,6 ± 6,3 pg /ml

vs

G5:. 40,8 ± 6,8 pg /ml; p = 0,001) sammenlignet med deres respektive dyrkede kontroller (fig 1 H)

Apoptose af TUNEL

for at belyse, om IVA protokol inducerede nogen skadelig virkning på æggestokkene stroma eller hårsække, blev celleskader undersøgt og kvantificeret ved TUNEL i de aktiverede og kontrol-dyrkede prøver. TUNEL-positive celler blev påvist i alle de eksperimentelle grupper, selv i begge de dyrkede kontrolgrupper, på grund af de dyrkningsbetingelser (Fig 2A til 2D). Med hensyn follikulært celleskader (Fig 2E), undersøgelsen viste, at der ikke var nogen statistisk forskel i graden af ​​beskadigede hårsække mellem de aktiverede grupper og deres respektive kontrolprøver kultur i den friske (G2: 7,7 ± 4,0%

vs

G3: 13,0 ± 7,6%; p = NS) og kryopræserverede væv (G5: 6,25 ± 6,0%

vs

G6:. 28 ± 18,4%; p = NS), selv om en bred variation mellem prøver var påvist (S2 fig). Når celle skader blev kvantificeret i stroma, blev ingen signifikante forskelle på grund af aktiveringsindsatsen procedurer fundet (Fig 2F).

(A) cellekerner farvet med DAPI (blå) til at udføre TUNEL analysen. Prøven fra G3 gruppen. TUNEL + signal blev fundet i stomien celler (rød) fra G3; (B) Vær den oprindelige follikel i G2 prøven. TUNEL + signal blev fundet i stroma, men bemærk, at det ikke var til stede i oocytten og GC fra folliklerne i G2-gruppe; (C) G6 prøven. Primordiale follikler omgivet af flade formede GC og stroma kerner farvet med DAPI (blå). TUNEL-positive celler farvet i rødt i stroma. Follikler var negative for DNA-skader i G6 prøven; (D) G5 prøve, som indeholdt to primordiale follikler, cellekerner farvet med DAPI. Nr TUNEL + signal blev påvist i oocyt og GC, men var positiv i æggestokkene stroma; (E) celledød indeks. Kvantificering af folliklerne med en positiv TUNEL signal i oocytter eller GC. Ingen forskelle blev påvist mellem aktiverede og ikke-aktiverede prøver; (F) TUNEL-positive stromale område kvantificering. Der blev ikke påvist forskelle for hårsække når TUNEL + området blev sammenlignet mellem de aktiverede og ikke-aktiverede grupper. Dette fund tyder på, at celleskader findes i stromaet fra alle grupper skyldtes dyrkningsprocessen.

Relativ genekspression af

PTEN

pathway

for at validere effekten af ​​BPV (pic) inkubationer på genekspression af

PTEN

vej, den relative ekspression af de vigtigste gener blev kvantificeret.

i friske væv, IVA protokol inducerede flere væsentlige ændringer, såsom en reduceret fold ændring (fc) i

PTEN

(fc = -1,21, p = 0,03) og

PI3K

(fc = -2.43) gener, og en overekspression af

AKT

(fc = 7,65, p = 0,015) og

FOXO3

(fc = 6.78, p = 0,01) sammenlignet med kontrollerne (fig 3A og 3B). Når Delta Cycle Threshold (ACt) blev statistisk sammenlignet mellem den aktiverede og kontrolprøver (tabel 2), signifikante forskelle blev også bemærket blandt de

PTEN

,

PI3K

FOXO3

genekspressionsprofiler. (p = 0,01; p = 0,03 og p = 0,015, henholdsvis)

(A) fold ændring af

PTEN

gen. Signifikante forskelle blev opnået, når ACt blev analyseret og viste PTEN hæmning produceret af BPV (pic) ved 100 uM i frisk (G1

vs

. G2 p = 0,01) og i tidligere kryopræserverede æggestokkene væv (G4

vs

G5 p = 0,04); (B) fold ændring af

FOXO3

gen. Et signifikant fald blev opdaget kun i de friske væv, der gennemgik IVA behandling, når ACt blev analyseret (G1

vs

. G2 p = 0,015).

For kryopræserverede prøver, den relative ekspression eller fold ændring af

PTEN

pathway-gener blev også modificeret ved IVA

(PTEN

fc = -1,29,

PI3K

fc = 0,59,

Akt

fc = 2,27, p = 0,007, og

FOXO3

fc = 1,94, p = 0,008) sammenlignet med kontrollerne (fig 3A og 3B). Selv blev observeret det samme udtryk mønster, statistisk påvist signifikante forskelle kun for

PTEN

gen, når man sammenligner ACt (p = 0,04).

Derudover en sonderende undersøgelse for genekspression blev udført mellem indledende tilstand prøver og deres respektive dyrkede kontrol. Som S2 Table vist, ingen statistisk blev påvist signifikante forskelle mellem kontrolgrupper sammenlignet med en parret test.

Diskussion

Anvendelse af en IVA protokol med en PTEN inhibitor i human kryokonserveret æggestokkene cortex fra kræftpatienter øget puljen af ​​levedygtige aktiverede primordiale follikler uden at inducere skadelige virkninger, som de opnåede resultater indikerer. Denne tilgang er en væsentlig forbedring i de første trin i

in vitro

vækst teknikker. Det lægger særlig vægt på: de cancerpatienter, hvis æggestokkene cortex er kryopræserveret som den eneste mulighed for FP, men for hvem direkte væv genindførelse er kontraindiceret [9, 10, 18];