PLoS ONE: Distinctive Lydhørhed til Stromal Signaling Ledsager Histologisk Grade Programmering af kræftceller

Abstrakt

Om stromale komponenter letter vækst, invasion, og formidling af kræftceller eller undertrykke neoplastiske læsioner fra yderligere ondartet progression er en fortsat gåde i tumor biologi. Konceptualiserer et dynamisk billede af tumorigenese kompliceres af inter-individuel heterogenitet. I stillingen genomiske æra, optrevling sådan kompleksitet er fortsat en udfordring for kræft biolog. Mod etablere en funktionel sammenhæng mellem cellulær krydstale og differentieret kræft aggressivitet, vi identificeret en underskrift ondartet bryst epitelial reaktion på stromale signalering. Nærhed til fibroblaster resulterede i gentranskriptet ændringer af 2 gange for 107 sonder, kollektivt betegnet som fibroblast Udløst genekspression i Tumor (FTExT). Den hazard ratio forudsagt af FTExT klassificeringen for fjernt tilbagefald hos patienter med mellemliggende og høj kvalitet brysttumorer var signifikant sammenlignet med rutinemæssige kliniske variabler (datasæt 1, n = 258, HR – 2,11, 95% CI 1,17-3,80, p-værdi 0,01 ; datasæt 2, n = 171, HR – 3,07, 95% CI 1,21-7,83, p-værdi 0,01). Biofunctions repræsenteret ved FTExT inkluderet inflammatorisk signalering, fri radikaler, celledød og celledeling. I modsætning til gener af den “spredning klynge”, som er overudtrykt i aggressive primære tumorer blev FTExT gener entydigt undertrykt i sådanne tilfælde. Som proof of concept for vores korrelative fund, som forbinder stroma-epitelial krydstale og tumor adfærd, viser vi en markant forskel i stromale indvirkning på prognose-definerende funktionelle endepunkter cellecyklusprogression, og modstand mod terapi-induceret vækst anholdelse og apoptose i lav vs. høj kvalitet cancerceller. Vores eksperimentelle data dermed afsløre aspekter af ‘parakrin cooperativitet «, der udelukkende betinget af histopatologisk defineret kvalitet af interagerende tumor epitel, og vise, at epitelial lydhørhed over for tumor mikromiljø er en deterministisk faktor bag kliniske resultat. På denne baggrund kunne tidlig svækkelse af epitelial-stroma krydstale forbedre forvaltningen af ​​sager tilbøjelige til at være klinisk udfordrende

Henvisning:. Luciani MG, Seok J, Sayeed A, Champion S, Goodson WH, Jeffrey SS, et al. (2011) Distinctive Lydhørhed til Stromal Signaling Ledsager Histologisk Grade Programmering af kræftceller. PLoS ONE 6 (5): e20016. doi: 10,1371 /journal.pone.0020016

Redaktør: Eliana Saul Furquim Werneck Abdelhay, Instituto Nacional de kræft, Brasilien

Modtaget: 9. februar 2011; Accepteret: April 8, 2011; Udgivet: May 19, 2011

Copyright: © 2011 Luciani et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health under tilskud R01CA109325. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

det er en udbredt opfattelse, at den lokale mikromiljø værtsvæv deltager aktivt i hele cancerudvikling og progression [1]. I denne milieu, kan interaktive udvekslinger mellem stroma og tumorceller påvirke overlevelse, vækst og spredning [2]. Autokrine stromale chemokiner og parakrine TGFp signaler er velkendte pro-tumorigene mediatorer [3] – [8]. I brysttumorer, fibroblaster generelt repræsenterer den mest udbredte celletype i stroma, der ofte omtales som “reaktive stroma”, stærkt beriget i, type I og VI collagen, laminin, entactin, heparan-sulfat proteoglycaner og fibrin [9]. Tumor-afledte fibroblaster fra forskellige organer vise betydelig variation i transkriptionelle profiler [10], og betydelige forekomme variationer i stromale genekspression i tumorer i samme organsystem, ofte i forbindelse med clinicopathologic parametre. For eksempel overekspression af CD10, og PDGFß receptoren i brystcancer stroma er karakteristisk for høj histologiske [11], [12]. Fibroblast-associerede signaturer og deres kliniske korrelation med resultat i kræftpatienter [13], [14], tyder på, at en ændret tumor stroma er et resultat af ‘kooperativ crosstalk’ med carcinomceller.

En omfattende indsats for at afsløre fundamentet for stromale-epitel krydstale inden solide tumorer kunne hjælpe med identifikationen af ​​et bredere spektrum af målsøgende molekylære determinanter for patientens udfald. Det er tænkeligt, at aggressive fænotyper af tumorceller ofte repræsenterer en lokaliseret reaktion på microenvironmental signaler [15]. Trods forbigående

in vitro

induktion, stromal-epitel krydstale har langvarig funktionelle virkninger på tumorigenicitet og metastatiske potentiale af celler inokuleret i forsøgsdyr [16]. I søgningen efter specifikke fænotypiske effekter,

in vitro

interaktioner mellem fibroblaster og bryst epitelceller tidligere forsøgt var begrænset til spontant immortaliserede brystcancercellelinier ensartet afledt fra aggressive høj kvalitet tumorer og metastatiske effusioner [17] – [19 ], eller fra ikke-malign human brystvæv [20]. Fortolkning af sådanne data er behæftet af manglen på en bred, sygdom-baserede spektrum af surrogat modeller af human cancer. Således entydige konklusioner om en sammenhæng mellem klinisk heterogenitet og den funktionelle biologi underliggende stroma-epitelial signalering forblive undvigende. En afgørende forudsætning for analyse af samspillet mellem forskellige cellulære delmængder inden tumorvæv er tilgængeligheden af ​​levende interaktive komponenter fraktioneret fra frisk kirurgisk kassere væv i tilstrækkelige mængder for robust dataindsamling og hypotese generation. Ligeledes at opnå translationelle indsigter gennem eksperimentel simulation, er det kritisk vigtigt at indarbejde en cellulær repertoire, der afspejler bredden i klinisk variabilitet bidraget med epitel og stromale elementer inden tumorvæv. Ved at lette direkte krydstale mellem nye primær tumor cellelinier af vidtrækkende clinicopathology [21] og flere uafhængige prøver af ikke-maligne eller tumor væv-afledte fibroblaster, har vores undersøgelse rettet mod en bedre forståelse af kræft biologi og dens anvendelse på følgende måder. Først er et sæt af gener identificeret, hvis udtryk er konsekvent ændres gennem parakrine interaktioner. Dernæst rollen af ​​en sådan stromally induceret tumor celle respons i at fremme sygdommens sværhedsgrad illustreret gennem sin korrelation med kliniske resultat. Endelig er en direkte funktionel grundlag for varierende kliniske resultat er forbundet med tumor respons på stromale signalering demonstreret af forskydninger i cellecykluskinetikken, apoptotisk svig, ROS reduktion, og neutralisering af de væksthæmmende effekter af hormonal kræftbehandling. Vores demonstration af klasse-associeret variabilitet i den dynamiske omprogrammering af kræft epitel af det stromale mikromiljø øger omfanget af klassisk kræft Patobiologi, og foreslår nye mål for tumorer refraktære over for nuværende behandlinger. Endvidere kan påvisning af mønstre af parakrin svartid, med tidlige stadier afsløre tilbøjelighed til progression fra præmaligne og preinvasive sygdom til avancerede læsioner

Resultater

Identifikation af FTExT – a. Genekspression profil skildrer ondartet celle respons på stromale signalering

en differentiel ekspression profil mellem primær brysttumor-cellelinier alene (T none), og dem opformeret i nærvær af brysttumor fibroblaster (T + TF) blev defineret ved en signifikant gen liste bestående af 482 probe sæt med en justeret p-værdi 0,05, hvor 7 uafhængige primære tumorcellelinier blev betegnet T, og primære tumor-afledte fibroblaster som TF. Expression profiler til 3/7 cellelinjer er erhvervet med 2 uafhængige fibroblaster prøver. En Heatmap, hovedsagelig afspejler transkriptionel repression af tumor-fibroblast cokultur (figur 1A) omfatter 107 probe sæt, med 2 gange ændring i genekspression (tabel S1). Denne gruppe af gener, som viste betydelig negativ fold-ændring i tumorceller, og betegnet som fibroblast Udløst genekspression i Tumor (FTExT), blev undersøgt yderligere. Opreguleres probe sæt inden den betydelige gen listen ikke opfyldte vores kriterier for fold forandring udvælgelse, og ikke blev anset for yderligere undersøgelse. Berigede kategorier af biologiske funktioner, der er forbundet med FTExT gener blev bestemt ved Ingenuity Pathway Analysis, og primært involveret inflammatorisk respons, celleproliferation, celledød og gratis radikaler (figur 1B, og figur S1).

A. Hierarkisk klyngedannelse af primær brystcancercellelinier som kontrol monokultur, og i co-kultur med tumorafledte fibroblaster. Bemærk uafhængige klynger portrættere særprægede stromally inducerede ekspressionsmønstre i tumorceller reflekteres af 482 signifikante probe sæt. B. berigede kategorier af bio-funktioner repræsenteret med 107 probe sæt, med 2 gange ændring i genekspression, der er udpeget som FTExT. Barer er grupperet og farvet i henhold til bio-funktion kategorier. Hver søjle repræsenterer en berigelse test p-værdi på en bio-funktion. C. Analyse af 482 signifikante probesæt gennemsnit over flere epitel cellekulturer afledt af maligne (rød) og nonmalignant brystvæv (grøn) i nærvær (y-aksen) eller fravær (x-aksen) stromal cokultur. Den sorte stiplede linje repræsenterer x = y. Tumor celler vise større afvigelse fra denne linje, dvs. mellem kontrol og cokultur hvorimod udtrykket mønstre af dyrket sammen maligne epitelceller viser minimal afvigelse fra kontrol. D. Scatter plot af relative transkriptniveauer af 11 FTExT gener målt ved QPCR i et uafhængigt sæt af 6 primære bryst tumorcellelinjer samdyrket med en af ​​4 tumorafledte fibroblast (TF) prøver. Dataene repræsenterer

ACTB

normaliseret udtryk for test genet i dyrket sammen tumorceller i forhold til kontrol. . Bemærk vifte af udtryk for hver test gen

Ekstra tilgange til at evaluere mangfoldigheden af ​​stromale indflydelse, inkluderet: (1) sammenlignende analyse af tumor-afledte betydelige gen liste (482 probe sæt) med array-data fra stromale-epithelial cokulturer isoleret fra 8 uafhængige ikke-maligne bryst vævsprøver. Genekspressionsmønstre var karakteristisk mellem samdyrket maligne vs. ikke-maligne bryst epiteliale celler (figur 1C). Betragtninger ikke-maligne epitelceller samdyrket med tilsvarende ikke-maligne fibroblaster viste relative ensartethed i lydhørhed, blev bredt heterogenitet observeret i tumor-afledte stromale-epitel cokulturer (2) QPCR analyse af 11 FTExT gener i et selvstændigt sæt af 6 primære tumor-afledte epitelial cellelinjer dyrket sammen med 4 tidligere uprøvede tumorafledte fibroblaster. Svarende til de ovenfor nævnte array-data, et gen-for-gen kvantitativ analyse bekræftede induktion af ændringer i test-genekspression i forhold til husholdning genet,

ACTB

, inden dyrket sammen tumorceller (fra 4 matchet, og 2 umatchede cokulturer) (Figur 1D).

FTExT variation og forbindelse med kliniske resultater af primær brystcancer

for at bestemme den kliniske relevans af fænotypiske ændringer direkte fremkaldt af stromal krydstale, klassificering magt FTExT (107 probe sæt) blev testet i forbindelse med array-data fra 2 uafhængige brystkræft datasæt. Distant metastase overlevelse (DMFS) blev anvendt som et slutpunkt for patient resultat. I GSE6532 datasæt [22], tumorer med dårlig prognose vises signifikant større FTExT genrepression i forhold til dem med god prognose (n = 401; p = 0,031, figur 2A – venstre panel). Den lagdeling magt FTExT omfattede tumorer i alle grader. Desuden foretager klassificeringen forbedrede yderligere underopdeles af delmængden kun består af mellemprodukter og høje kvalitet tumorer (n = 258; p = 0,011, figur 2A – højre panel). Med andre ord, FTExT pålideligt identificeret patienter, der gjorde dårligt i situationer, hvor traditionel histopatologi baseret prognosticering var begrænset med hensyn til at give en præcis forudsigelse. Reproducerbarhed af FTExT klassificeringen præstation blev yderligere demonstreret i en uafhængig datasæt [23] – GSE11121 tværs af alle kvaliteter (n = 200; p = 0,013, figur 2B – venstre panel) samt i en særskilt analyse af mellemliggende og høj kvalitet brystkræft (n = 171; p = 0,013, figur 2B – højre panel). Især i alle analyser, FTExT var en bedre uafhængig prædiktor for udfaldet af mellem- og høje kvalitet tilfælde i forhold til konventionelle prognostiske parametre, såsom tumor kvalitet, ER status, lymfeknude positivitet, og tumorstørrelse (tabel 1).

A.

Datasæt 1 (GSE6532) –

FTExT klassificeringen forudsiger god vs. dårligt resultat for slutpunktet for fjernmetastaser overlevelse (DMFS) (n = 401,

venstre panel

). FTExT baseret lagdeling af patienter diagnosticeret med grad 2 (mellemliggende) og 3 (høj) tumorer (n = 258,

højre panel

). B.

Datasæt 2 (GSE11121)

– FTExT forudsigelse af DMFS i en uafhængig datasæt (n = 200,

venstre panel

). Bekræftelse af FTExT baseret lagdeling af patienter diagnosticeret med grad 2 og 3 tumorer (n = 171,

højre panel

).

Vores kombinerede cokultur genekspression data og FTExT analyse af primær tumor datasæt viste, at dette stromally induceret profil blev manifesteret som et kontinuum. På den ene ekstrem var relativt uændrede mønstre af genekspression er karakteristisk for ikke-maligne cokulturer, skiftende til minimal undertrykkelse af FTExT gener i primære tumorer, der er forbundet med god klinisk resultat, og på den anden ekstrem var stærkt undertrykt udtryk profiler inden tumorer, der giver dårlig patient resultat.

Induktion af et bredt spektrum af funktionelle ændringer i maligne celler ved stromale fibroblast krydstale

i et forsøg på at afsløre den biologiske betydning af stromally inducerede fænotyper som en afgørende faktor for klinisk resultat, vi ansat roman primær brystkræft tumor cellelinier med varierende histologiske [21] i en række forskellige funktionelle tests. Som følge af den berigede biofunction analyse af FTExT gener blev robuste analyser prioriteret, hvor kvantificerbare endepunkter kunne anvendes, og som let kunne gennemføres på grund af begrænsninger i tilgængeligheden af ​​finite-life stromale kulturer. Konkret ændringer i de funktionelle endepunkter af større cellulære programmer som hyperaktiveret spredning kinetik; oxidativt stress neutralisering; og apoptotisk celledød unddragelse blev undersøgt i tumorceller samdyrket med fibroblaster afledt af maligne eller ikke-malign human brystvæv:.

(1) omprogrammeres cellecyklusfordeling af kræftceller

ti uafhængige primær brystcancer cellelinier under kontrol og TF-cokultur betingelser blev mærket med BrdU, og analyseret ved FACS. Cellecyklus forandringer som følge af cokultur er opsummeret i tabel 2. Dot plots af repræsentative cellelinier er vist i figur 3A. Dataene viste karakteristiske kvalitet-afhængige cellecyklus profiler. Som reaktion på stromal celle-signalering, grad 1 (CCdl22, CCdl68) og grad 2 (CCdl1570) tumorafledte cellelinjer vises enten (a) ingen signifikant ændring i cellecyklusfordeling sammenlignet med ikke dyrket sammen styrer eller (b) induktion af cellecyklus anholdelse i G2 /M-fase, hvilket indikerer aktivering af en post-replikativt /DNA-reparation checkpoint. I modsætning hertil grad 3 tumorceller (CCdl54, CCdl257, CCdl675), herunder en høj kvalitet duktalt karcinom

in situ

(DCIS) -afledt cellelinje (CCdl1797) og yderligere klasse 2 tumor linier (CCdl66, CCdl329, CCdl1599) udviste en signifikant stigning i S-fasen befolkning, der indikerer (a) DNA-syntese /replikering fejl, der skyldes blokering af replikationsforgreninger, eller (b) en hurtigere celleproliferation sats. Især specificiteten af ​​tumor celle respons var almindeligt mellem uafhængige fibroblast prøver.

A. Celle cyklus analyse af primære bryst tumorcellelinier i cokultur med 2 uafhængige fibroblast prøver, TF1, og TF2. Lagkagediagrammer opsummere FACS-data. Numre angiver procent celler i S-fasen af ​​cellens cyklus. Hver værdi er gennemsnittet af tredobbelte datapunkter. Repræsentative FACS dot plots er vist for kontrol (til venstre for tilsvarende cirkeldiagram) og TF2-dyrket sammen celler (højre af tilsvarende lagkagediagram). Bemærk varierende effekter af stromale cokultur på tumorceller cykling. B. Måling af S-fase kinetik over tid i repræsentative klasse 1 og klasse 3 cellelinjer i tilstedeværelse af TF1 og TF2 celler. Bemærk kontrasterende virkninger af stromaceller på replikationen på cellelinier vist. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelse af gennemsnittet af tredobbelte værdier. Fibroblast-induceret fald i BrdU mærkede celler i klasse 1 tumorceller, og en tilsvarende stigning i lønklasse 3 tumorceller var signifikant på alle tidspunkter (p 0,005 og p 0,001 henholdsvis)

(2) Dramatiske ændringer i hastigheden af ​​tumorcelleproliferation.

for at bekræfte, at en øget S-fasen fraktionen som reaktion på stromale signalering i lønklasse 3 tumorceller faktisk repræsenterede en hurtigere spredning sats sammenlignet med klasse 1 cellelinjer, blev repræsentanter for hver gruppe i cokultur med 2 uafhængige TF prøver pulset med BrdU på forskellige tidspunkter over en 1 timers periode. FACS målinger af BrdU-inkorporere cellefraktion tiden forudsat et pålideligt estimat af hastigheden af ​​DNA-syntese i tumorceller med og uden eksponering for fibroblast signalering. Spredning kinetik klasse 1 (CCdl22) cokultureme bekræftede endvidere en tidligere observerede fibroblast-induceret G2 /M anholdelse. Cellecyklusstop blev opretholdt under hele eksperimentelle tidsforløb, hvilket fører til en markant nedgang (op til 70%) i andelen af ​​BrdU-inkorporering celler (figur 3B). I slående kontrast, i lønklasse 3 (CCdl675) cokulturer, en dramatisk stigning på mindst 47% og op til 60% fandt sted i antallet af replikation baseret på skråningerne af vækstkurver forhold til at styre celler. Induktion af en langsommere eller hurtigere spredning sats i lønklasse 1 og klasse 3 tumorceller, henholdsvis var konsistent mellem uafhængige fibroblast prøver.

(3) Stroma-assisteret beskyttelse mod apoptotisk celledød.

at evaluere, om stromal signalering forbedrer overlevelse og formering af dyrket sammen tumorceller, ESR1 antagonist, 4-hydroxytamoxifen (OHT), kendt for at udøve sine anti tumor effekter ved oxidativ stress induktion og efterfølgende apoptose, blev anvendt til at initiere celledød i cellelinier , som udviste en stigning i procent S-fasen som respons på cokultur. Cellelinier afledt af både klasse 2 (CCdl329 og CCdl1599) og grad 3 (CCdl675) tumorer blev evalueret. En eksperimentelt afledt apoptotisk indeks sammenligner en enkelt koncentration på 10 uM OHT uden OHT kontrol muliggjort en standardiseret assay, hvor de relative beskyttende virkninger af stromal cokultur kunne måles ved Annexin-V-farvning. Først en sammenligning mellem baseline apoptose i tumorcellelinjer (CCdl675, CCdl329 og CCdl1599) dyrket alene eller som cokulturer med 3 uafhængige fibroblast kilder (1 reduktion mammoplasty-afledt, betegnet EF, og 2 tumorafledte eller TF) viste en stromally induceret beskyttende virkning (figur 4A). Den apoptotiske fraktion blev reduceret med 30-60% i grad 2 cellelinjer (CCdl1599 – p 0,002; CCdl329 – p 0,001), og med 85% i lønklasse 3 celler (CCdl675 – p 0,005). Mere signifikant blev den dramatiske stigning i OHT-induceret celledød undertrykkes også ved forudgående eksponering af alle 3 tumorcellelinier til fibroblast cokultur. Stromale fibroblaster af både maligne og ikke-malign afledning var lige effektive til at fremkalde apoptose suppression i tumorceller (p 0,001) (figur 4B). Mens det er muligt, at variabiliteten i det cellulære respons på OHT tydeligt i cokultur er stort set en afspejling af differentiel ESR1 aktivitet, vore data tyder på, at væksten inducerende parakrin signalering i tumorceller kunne potentielt ændre følsomhed over for hormonbehandling og spille en rolle i erhvervelse af en resistent fænotype.

a. Reduktion i baseline apoptotisk fraktion målt som Annexin-V-positive celler ved FACS-analyse. Tre uafhængige tumorcellelinjer blev dyrket sammen med ikke-malign (EF), og tumorafledte (TF1) og (TF2) fibroblaster, og sammenlignet med tumor alene kontrolkulturer til ændringer i den apoptotiske indeks. Repræsentative FACS profiler ligger til grund for grafiske oversigter og procent Annexin-V positive celler vises. Bemærk signifikant fald i den apoptotiske brøkdel af alle 3 tumorlinjer (* p 0,005). B. Modstand mod OHT-induceret apoptotisk død i tumorceller samdyrket med EFs og TF prøver sammenlignet med lægemiddel-behandlede tumor alene kontrol. Bemærk bemærkelsesværdig undertrykkelse af OHT-induceret celledød ved cokultur. C. Neutralisering af cellulære ROS-niveauer målt som C400 gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) ved FACS-analyse. Resultater er udtrykt som procent reduktion i forhold til baseline fluorescens af kontrol tumor kulturer vs. cokulturer. Repræsentative FACS profiler, der repræsenterer de grafiske oversigter og MFI værdier vises. Bemærk fald i OHT-induceret C400 MFI på alle tumorlinjer (* p 0,005). D. cokultur induceret overstyring af OHT-medieret G1 anholdelse i tumorceller. reduktion Note i procent OHT-induceret forøgelse af G1 befolkning dyrket sammen tumorcellelinjer (* p 0,005). Hvert datapunkt er et gennemsnit af tredobbelte værdier i alle paneler af figuren. Barer er farvekodet i paneler B og D til at repræsentere følgende: grå -untreated kontrol, sort – OHT-behandlede kontrol, hvid – OHT behandling af EF cokultur, blå – OHT behandling af TF1 cokultur, rød – OHT behandling af TF2 cokultur.

(4) Reduktion af oxidativt stress i tumorceller.

Den gennemsnitlige fluorescensintensitet af C400 farvning tjent godt som en indikator for endogene ROS-niveauer, omend de er generelt lav i tumor cellelinjer sammenlignet med inflammatoriske celletyper. Et markant fald i OHT-induceret ROS akkumulering blev observeret i tumor cellelinier (CCdl1599, CCdl329, og CCdl675) dyrket sammen før lægemiddelbehandling (figur 4C). Den gennemsnitlige reduktion i ROS med cokultur var 34% (p 0,0001). Alle tre cellelinjer var konsekvente i deres grad af respons på maligne og ikke-maligne væv-afledte fibroblaster.

Cell cyklus analyse viste en OHT-induceret G1 fasen anholdelse i alle tumorcellelinier testet, som varierede fra 35% til 73% stigning i denne fraktion (p 0,001). Derudover en mild ophobning i G2 /M fraktion var også tydeligt i 2/3 tumorcellelinier (p 0,02) i nærvær af det terapeutiske hormonantagonist. I cokulturer af 2/3 tumorcellelinier (CCdl1599, CCdl675), G1-anholdt fraktion faldet markant på trods af OHT eksponering (p 0,001) (figur 4D). Den beskyttende virkning af fibroblast cokultur var ikke så tydelig i CCdl329 linje, da det viste relativ resistens mod OHT behandling som indikeret ved den laveste stigning i G1 fraktion – antyder, at G1 /S checkpoint kan være defekt i disse celler. Interessant, trods induktionen af ​​kun en mild G1 arrest, CCdl329 celler reagerer på OHT-induceret apoptose (figur 4B). Sådanne differentierede reaktioner på OHT foreslå andre kilder til variation i brysttumorer, hvilket yderligere modificere resultatet af tumor-stroma interaktioner, og afspejler yderligere kilder til heterogenitet.

Samlet set viser vores data, at fibroblast cokultur lettet en parallel reduktion i 3 uafhængige, men tæt forbundne parametre af OHT-induceret skade: ROS ophobning, G1 anholdelse, og apoptotisk celledød i en aggressiv delmængde af primær brystkræft tumor afledte cellelinier. trods tumorfremmende reaktionsevne vises af disse cellelinier, mærket variation var imidlertid tydelig. CCdl329 celler effektivt unddraget OHT-induceret apoptose, selv om G1 arrest i nærvær af lægemidlet blev kun delvis overvundet ved cokultur. I modsætning hertil CCdl675 celler var relativt mangelfuld i overvindelsen af ​​den apoptotiske byrde på trods af den observerede ROS reduktion og en slående fald i G1 og G2 /M anholdt fraktionen, i overensstemmelse med vores observationer af mangelfuld reparation kulminerede i øget genomisk instabilitet (data, der skal offentliggøres andetsteds ).

Stromal fibroblast inducerede funktionelle effekt er reversibel

Endelig, for at vurdere reversibilitet af særprægede og deterministiske endepunkter stromally induceret vækst aggressivitet, tumorceller blev analyseret over en kortsigtet tilbagebetalingsperioden for tilbageførsel af cellecyklus ændringer, og induktion af celledød, efter cokultur betingelser blev indstillet (figur 5A). Fjernelse af stromale indflydelse fra grad 3 (CCdl675) cokultureme vendt slående stigning S-fase over kontrol under 48 timers testperioden. Men forøgelse i apoptotisk celledød blev ikke påvist i denne periode (data ikke vist), hvilket bekræfter, at cokultur inducerede stigning i BrdU-mærkede fraktion af tumorceller repræsenterede et større cykling population, i stedet for akkumulering i S-fase på grund af replication- arrestere og gaffel stalling. I tilfælde af sidstnævnte mulighed, ville ophør af cokultur har ført til celle cyklus progression i tumorceller huser en replikeret sæt kromosomer, der kulminerede i mitotisk katastrofe og celledød. I klasse 1 tumorceller (CCdl22), der reagerede på co-dyrkning ved at vise en gennemsnitlig stigning på 64% i G2 /M anholdt befolkning i forhold til kontrol (p 0,001), cellecyklus genindrejse blev observeret ved fibroblast fjernelse. Men som kulturen nåede sammenløb inden for den eksperimentelle tidsramme, en efterfølgende G0 /G1 arrest var tydelig i både kontrol og dyrket sammen karakteren 1-celler, hvilket kraftigt antyder, at (a) disse tumorceller var sandsynligvis DNA-reparation dygtige, som fjernelsen af ​​stromale effektorer overvundet G2 checkpoint, og dette potentiale (b) væksten var intakt, men reagerer på negativ regulering af parakrin signalering. Havde G2 /M checkpoint ikke været reversible, men på grund i stedet for udbrud af mitosestandsning i cokulturer, ville det have resulteret i apoptotisk celledød, påviselig som en væsentlig stigning i subG1 befolkning i testperioden.

EN. Sammenlignende cellecyklus profiler af klasse 1 og klasse 3 tumorceller efter 7-dages fibroblast cokultur, efterfulgt af en 48 timers periode uden cokultur. Bemærk markant reduktion i G2 befolkningen i grad 1 cellelinje ved ophør af cokultur betingelser. Både kontrol- og test populationer vise tegn på G0 /G1 anholdelse på grund af kultur sammenløb. I grad 3 tumor linje, post cokultur celledeling returnerer at styre profiler. Nummererede pie chart segmenter indikerer procentdelen af ​​celler i G1 og S-fase. SubG1: gul; G1: grøn; S: rød; G2 /M: blå. B.

Den FTExT model

:

ved anvendelse af levende interaktive cokulturer af stromale fibroblaster og primær tumor-afledte epitel af varierende histologiske kvalitet, FTExT tilbyder nye indsigt i det biologiske grundlag for grade- associeret lagdeling af primær brystcancer. Den foreslår, at cellelinjer afledt fra godt differentierede tumorer er forbundet med god klinisk prognose rekapitulere deres funktionelle egenskaber i tilstedeværelse af stromale fibroblaster

in vitro

. Ligeledes tumorceller afledt af dårligt differentierede maligne læsioner bevarer kontekstuelle evne til at reagere på den samme parakrin indflydelse på en måde, der svarer til kræft aggressivitet og ugunstige patient resultat. Sådanne autentiske modelsystemer er et vigtigt redskab til at fremme målene for forskning i kræft biologi.

Samlet set de eksperimentelle resultater i denne undersøgelse er konsekvent og understøtter differentierede kliniske outcome data afledt gennem korrelativ FTExT profilering analyse af primær brystcancer. Tilsammen giver de en ny begrebsramme for signifikant sammenhæng mellem den FTExT udtryk mønster i moderat og dårligt differentieret eller grad 2 og 3 tumor henholdsvis og den rolle, stroma i induktion af hurtig vækst og dårlig klinisk resultat. I modsætning hertil checkpoint induktion i godt differentierede eller grad 1 tumorceller medieret af stromal signalering svarer til den observerede genekspression mønster af primære tumorer, som giver en god klinisk resultat (figur 5B).

Diskussion

på vej mod et fuldstændigt billede af udviklingen af ​​kræft og progression, en omfattende afgrænsning af underliggende kilder bidrager til manifestation af maligne fænotyper og deres heterogenitet, er kritisk. I tidligere undersøgelser har vi entydigt identificeret iboende fænotyper afspejler histologisk tumor variabilitet, men uafhængig af kontekstuelle påvirkninger, såsom stromale induktion [21]. Ved at anvende eksperimentel cokultur sammen med hidtil ukendte primære tumorcellelinier, her vores tilgang har identificeret FTExT, et programmeret reaktion på stromally udskilte faktorer. I stedet for en stromale indvirkning, ensartet fremmer eller hæmmer alle tumorer, vores data viser betydningen af ​​variable epitelial lydhørhed i udfald sygdom. Sammen med korrelative analyser af klinisk væv, at sådanne fokuserede endnu bredt anvendelsesområde efterforskningsmæssige strategier definerer funktionelle rammer for kræft fænotyper kunne væsentligt forbedre rækkevidde og nøjagtighed druggable identifikation mål.

FTExT profil genereres gennem eksperimentel cokultur portrætterer stromal regulering af større biologiske programmer, hvilket antyder en nøglerolle for stroma-støttede fremme af tidlige kendetegnende for cancer omfatter unddragelse af regulerende kredsløb, såsom immun-overvågning, oxidativ stress, og metabolisk deficiens [24], ud over de kendetegnende for fremskreden kræft [25]. Derfor blev FTExT ekspressionsprofil fundet at være associeret med en dårlig klinisk resultat i to uafhængige datasæt, der repræsenterer over 600 tilfælde. I overensstemmelse med denne korrelative kliniske data, har vi yderligere demonstreret, at de nedstrøms funktionelle effekter af stromally inducerede transkriptionelle ændringer var dramatisk variabel mellem primære bryst tumorceller af divergerende histopatologisk afledning. I aggressive brystkræftceller, tumorfremmende effekter var tydelige som en øget evne til oxidativt stress neutralisering, apoptose svig, og hurtig celledeling.