PLoS ONE: apolipoprotein A-II Plus Lipid Emulsion Forbedre cellevækst via SR-B1 og Target kræft i bugspytkirtlen In vitro og in vivo

abstrakt

Baggrund

Apolipoprotein A-II (ApoA-II) nedreguleres i sera fra pancreas ductus adenocarcinom (PDAC) patienter, hvilket kan skyldes at forøge udnyttelsen af ​​høj density lipoprotein (HDL) lipid ved pancreascancer væv. Denne undersøgelse undersøgte indflydelsen af ​​eksogene ApoA-II på lipidoptagelse og cellevækst i bugspytkirtelkræft (PC) både in vitro

og

in vivo

.

Metoder

br >

Cryo transmission (TEM) undersøgte ApoA-II indflydelse på morfologi SMOFLipid emulsion. Indflydelsen af ​​ApoA-II på proliferation af cancer cellelinjer blev bestemt ved at inkubere dem med lipid +/- ApoA-II og anti-SR-B1-antistof. Lipid blev mærket med fluoroforen, gjorde, at spore lipidoptagelse af kræftceller

in vitro

ved konfokal mikroskopi og

in vivo

i PDAC patient afledte xenotransplantattumorer (PDXT) ved fluorescens billeddannelse. Scavenger receptor klasse B type-1 (SR-B1) udtryk i PDAC cellelinjer og i PDAC PDXT blev målt ved western blotting og immunhistokemi, henholdsvis.

Resultater

ApoA-II spontant omdannes lipid emulsions- i meget små unilamellare rHDL lignende vesikler (rHDL /A-II) og et forstærket lipidoptagelse i PANC-1, CFPAC-1 og primære tumorceller som vist ved konfokal mikroskopi. SR-B1-ekspression var 13,2, 10,6, 3,1 og 2,3 gange højere i PANC-1, MiaPaCa-2, CFPAC-1 og BxPC3 cellelinier end den normale pancreas- cellelinie (HPDE6) og 3,7 gange større i PDAC væv end i normalt pancreas . ApoA-II plus lipid steg markant optagelsen af ​​mærket lipid og fremmes cellevækst i PANC-1, MiaPaCa-2, CFPAC-1 og BxPC3 celler, der blev inhiberet af anti SR-B1-antistof. Endvidere ApoA-II øgede optagelsen af ​​lipid i xenotransplantater med 3,4 gange.

Konklusion

Vores data tyder på, at ApoA-II forbedre målrette potentiale lipid i bugspytkirtelkræft, som kan have billedbehandling og narkotika levering muligheder

Henvisning:. Julovi SM, Xue A, Thanh LE TN, Gill AJ, Bulanadi JC, Patel M, et al. (2016) apolipoprotein A-II Plus Lipid Emulsion Forbedre cellevækst via SR-B1 og Target kræft i bugspytkirtlen

In Vitro

In Vivo

. PLoS ONE 11 (3): e0151475. doi: 10,1371 /journal.pone.0151475

Redaktør: Yingmei Feng, Beijing Key Laboratory of Forebyggelse og forskning Diabetes, KINA

Modtaget: 3. september 2015; Accepteret: 29 februar 2016; Udgivet: 22 Mar 2016

Copyright: © 2016 Julovi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information fil

Finansiering: En del af denne undersøgelse blev præsenteret, og kåret som bedste poster på New Horizons 2014 og den Videnskabelige Research Meeting, 17-19 november, 2014. denne undersøgelse har ikke blevet offentliggjort andre steder eller ikke er under overvejelse for en publikation. Undersøgelsen blev støttet af CanSur fundament og dels af Ramsay Research Teaching Fund men havde ikke nogen rolle i studie design, indsamling data og analyse, beslutning om at offentliggøre eller tilberedning af manuskriptet. Kommerciel tilhørsforhold af forfatterne på CSIRO ikke spillede nogen rolle i undersøgelsen, og havde ikke nogen konkurrerende interesser vedrørende beskæftigelse, rådgivning, patenter, produkter i udvikling og markedsførte produkter

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har ingen interessekonflikt. Kommerciel tilhørsforhold af forfatterne på CSIRO ikke spillede nogen rolle i undersøgelsen, og havde ikke nogen konkurrerende interesser vedrørende beskæftigelse, rådgivning, patenter, produkter i udvikling og markedsførte produkter.

Introduktion

serum apolipoprotein a-II (ApoA-II) viste sig at være deprimeret i pancreas kræftpatienter og var en potentiel diagnostisk biomarkør [1]. Dette arbejde er blevet bekræftet af Honda og kolleger [2] og andre [3]. ApoA-II er en komponent i high density lipoprotein (HDL), hvor det spiller en vigtig rolle i at lede skæbne metabolismen af ​​lipid i HDL. Den vigtigste rolle for HDL er levering af cholesterol fra perifere væv til leveren, hvor det metaboliseres til galdesalte eller udskilles til galden. Den scavenger receptor klasse B type-1 (SR-B1) er udbredt i hepatocytter og tiltrækker HDL hvor lipid er endocytose [4, 5] eller diffust [6, 7] i hepatocytter.

SR-B1 er en multi-ligandreceptor og stærkt udtrykt i en række tumorceller, herunder prostata, bryst, kolorektal og ovariecancerceller [8]. Lipoproteinet på overfladen af ​​HDL binder til SR-B1and afgiver lipid i cellen gennem en pore dannet ved SR-B1 øge optagelsen af ​​HDL-cholesterylester (CE) [9], et essentielt næringsstof for malign celleproliferation og metastase [10, 11]. Tredive procent af HDL er associeret med ApoA-II, som menes at gøre HDL mindre end med ApoA-I alene og gør HDL /ApoA-II mindre tiltrukket af hepatisk SR-B1 [12]. Desuden ApoA-II opretholder HDL niveauer delvist af inhibering af hepatisk lipase [13]. Disse resulterer i en relativt længere cirkulationstid for HDL /ApoA-II. ApoA-II ændrer binding af HDL til SR-B1 i forskellige væv og er især tiltrukket steroidogene væv [14], hvor kolesterol udnyttes til hormon syntese, men hurtigt voksende cancerceller kræver også kolesterol for cellemembraner [15]. Cancerceller har en øget ekspression af SR-B1in forhold til udtryk på deres ikke-maligne celler af oprindelse [16, 17], og det er muligt, at dette resulterer i forøget optagelse af HDL med cancervævet, som er en forklaring på reduktionen i serum ApoA-II i PDAC sager [1-3]. Interessant pancreascancer akkumuleres ikke fludeoxyglukose (FDG) stærkt nok til at være pålidelige som kontrastmiddel for Positron Emission Tomography (PET) [18], som sandsynligvis indikerer, at pancreascancer har en præference for lipid som sit vigtigste kalorie kilde [19]. Hvis lipid er den vigtigste energikilde for kræft i bugspytkirtlen væv er det muligt, at HDL er en vigtig kilde til dette lipid. Energistofskiftet af cellerne er involveret i komplekse carcinogenese [20, 21]. Rolle cholesterolmetabolisme i processen med carcinogenese er også rapporteret [22-24] .Cancer og andre hurtigt proliferende celler kræver cholesterol og andre membrankomponenter at optimere vækst [25]. HDL’er har været impliceret i cholesterol levering i nogle maligniteter, herunder brystcancer [26], ovariecancer [8], adrenocortikale tumorer [27] og prostatacancer [28]. Det er sandsynligt, pancreascancer også begærligt utilsing HDL.

testet i dette papir hypotese er, at ApoA-II vil fremskynde optagelsen af ​​lipid i bugspytkirtelkræft væv og vil derfor forøge cellevæksten. Yderligere, vi hypotesen, at niveauet af ekspression af SR-B1 vil korrelere med optagelse af lipid ved bugspytkirtelkræftceller og vil være større end for normalt væv.

Materialer og metoder Salg

Cell kultur

PANC-1, MiaPaCa-2, BxPC3 og CFPAC-1 bugspytkirtelkræft cellelinjer var gaver fra Prof. Barry Allen (St George Hospital, NSW, Australien), og normal menneskelig pancreas ductal epitelial (HPDE6) celler [29] var fra Dr. Chris Scarlett (School of Environmental Life Sciences, University of Newcastle, NSW, Australien). A549 lungekræft cellelinje blev T47D og MCF7 brystcancercellelinier venligst stillet til rådighed af Prof. Ross Davey (Kolling Institute of Medical Research, Royal North Shore Hospital, NSW, Australien). PC3 prostatakræft cellelinje blev venligst stillet til rådighed af Prof. Qihan Dong (Central Klinisk School, Bosch Institute, University of Sydney, NSW, Australien). Undtagen HPDE6 cellelinie blev alle cellelinier købt hos ATCC. Cellelinjer blev indtastet ved kort tandem repeat profilering og de var i overensstemmelse med de ATCC referencestandarder (CellBank, Westmead, NSW, Australien). BxPC3, CFPAC-1, A549, T47D og MCF7-cellelinier blev dyrket i RPMI 1640, PANC-1 og MiaPaCa-2 blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) og PC3 prostata celler blev dyrket i F-12K (Gibco, BRL) med 10% FBS, indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS; ICN, Aurora, OH) i 75 cm

2 kolber ved 37 ° C i en befugtet 5% CO

2 atmosfære. HPDE6 celler blev dyrket i keratinocyt serumfrit (KSF) medium suppleret med epidermal vækstfaktor og ekstrakt fra bovin hypofyse (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY).

Primær kultur

Humant pancreas tumor prøver blev opnået på Royal North Shore Hospital (Sydney, Australien), med deres skriftlige godkendelse, følgende protokoller er godkendt af den nordlige Sydney Local Health District menneskelige Research Ethics Committee (NSLHD HREC) (protokol nummer: 0909-227M, Sydney , Australien). Primær tumor cellekulturer blev oprettet ved eksplantat vækst i små fragmenter (≈1 mm) dissekeret fra PDAC tumorvæv, placeret i DMEM (pH 7,4) suppleret med 10% varmeinaktiveret FBS med 50 enheder /ml penicillin /streptomycin. Kulturer blev anvendt efter passage 3 for at undgå restforurening af makrofager [30]. Alle kulturer blev opsamlet under identiske vækst og serum betingelser. Vi brugte 24 h serum udsultede celler til forsøg på at undgå den tidlige genekspression induceret af serum.

Mærkning af SMOF lipid med fluoroforen DiD

SMOF lipid emulsion, der indeholder sojaolie, medium kæde triglycerid, olivenolie og fiskeolie {www.tga.gov.au/pdf/auspar/auspar-smoflipid.pdf}, og anvendes til intravenøs ernæring, blev anvendt i vore forsøg efter mærkning med en 0,05% lipofil tracer fluorofor, har , (DiD307, Invitrogen, Carlsbad, CA). Den SMOF lipidemulsion blev tørret under en rotationsfordamper, frysetørret før blanding godt med DiD lipid i en ethanolisk opløsning. Ethanolen blev endelig inddampet, og den tilbageværende lipidfilm blev rehydreret ved tilsætning af sterilt Baxter vand at foretage den endelige koncentration til 20% SMOFlipid, efterfulgt af barske hvirvelblanding og 30 minutter ultralydsbad homogenisering.

Indsamling og oprensning af ApoA -II

ApoA-II blev oprenset som beskrevet i tidligere undersøgelser [31-33]. HDLs blev ultracentrifugally isoleret fra poolede prøver af normalt humant plasma (1,063 d 1,21 g /ml) og affedtet. Den resulterende apoHDL blev underkastet chromatografi på en Q-Speharose Fast Flow-søjle bundet til en Akta FPLC-system (GE Healthcare, Chalfont St Giles, Buck, UK). Fraktioner indeholdende apo-II blev samlet, og renhed blev kontrolleret ved SDS-PAGE og Coommassie farvning, hvilket afslørede et enkelt bånd. Puljeprøverne var lyofiliseret, rekonstitueret med 3 M guanidinhydrochlorid /10 mM Tris /0,01% (vægt /volumen) EDTA-Na

2, og dialyseret i endotoksin-frit PBS før anvendelse.

Cell proliferationsassay

Celleproliferation blev udført i forskellige cellelinier og kvantificeres ved krystalviolet assay som beskrevet i tidligere [34], hvor MTT-assay er ikke egnet i lipid-behandlede celler [35]. 4 × 10

4 celler /ml celler blev podet i Ninety Six brønds mikroplader, for alle cellelinjer med undtagelse af PANC-1 og MiaPaCa-2, hvor 2×10

4 celler /ml blev podet til et endeligt volumen på 200 pi. Serumfri celler blev behandlet med eller uden SMOFlipid (lipid) alene, ApoA-II alene og eller i kombination i forskellige koncentrationer og inkuberet i 24 timer, 48 timer og 72 timer. For at teste virkningen af ​​SR-B1 blev celler forbehandlet med anti SR-B1 (2,5 ug /ml) i 2 timer og vasket ved medier 3 gange i 5 minutter hver. Derefter blev cellerne behandlet med eller uden lipid plus ApoA-II i 48 timer. Dyrkningsmedium blev fjernet og farvet med 1 pg /ml krystalviolet (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) opløst i 25% methanol (vol /vol) og 75% destilleret vand (vol /vol). Bundet krystalviolet blev solubiliseret med 0,1% natrium-dodecyl-sulfat (SDS) i phosphatbufret saltvand (PBS). Den optiske densitet af hver brønd blev bestemt ved 550 nm bølgelængde. Resultaterne blev udtrykt som relativ til kontrol. Vi fandt, at 1:30 fortynding af lipid og 50 ug /ml ApoA-II var de optimale koncentrationer på 48 timer, og denne betingelse blev anvendt i den efterfølgende undersøgelse.

immunblotting

Immunblotanalyse blev udført som tidligere beskrevet [1]. Kort beskrevet 4 x10

5 celler af hver cellelinier podet i plader med 6 brønde og celler blev dyrket indtil konfluens. Lige store mængder proteiner blev separeret ved 10% SDS-PAGE under reducerende betingelser og overført til en polyvinylidendifluoridmembran. Det primære antistof blev anvendt, var kanin-anti-SR-B1 (Novus Biologicals, Littleton, USA). Immunreaktivitet blev påvist med elektrokemiluminescensen detektionssystem (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK). Anti-humant β-actin antistof blev medtaget for at normalisere mod ulige belastning.

Konfokal mikroskopi

Optagelsen af ​​SMOFlipid mærket med gjorde blev undersøgt ved konfokal mikroskopi. Kort fortalt, 1×10

5 celler /brønd blev podet på 8 brønd kultur slides (BD Falcon, BD Bioscience) natten over og behandlet med lipid mærket med DiD farvestof 1:30 fortynding med eller uden ApoA-II i 48 timer. I nogle forsøg blev cellerne præinkuberet med the1: 40, 1:30 og 1:10 fortyndinger af umærket SMOFlipid og anti SR-B1 på (2,5 ug /ml) i 2 timer, vasket med serum-frie medier og inkuberet med lipidet plus ApoA-II i 48 timer. Celler blev fikseret med 4% paraformaldehyd (Univar, Redmond, WA, USA), permeabiliseres med 0,3% Tween 20 (Sigma Aldrich, Castle Hill, NSW, Australien) og inkuberet med eller uden primært antistof, gede-anti-humant ApoA-II ( Abcam, Abcam Inc., MA, USA) i 2 timer og derefter inkuberet med grøn Fluorofor konjugeret isotype matchet sekundært antistof (AlexaFlour

æsel a488 anti gede-IgG (H + L) (Invitrogen, Carlsbad, CA) i yderligere 1 time ved stuetemperatur. Cellerne blev monteret med glycerol medier med DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA) og cellulære optagelse blev undersøgt under Leica konfokalmikroskopi (Leica, Tokyo, Japan).

for levende celler, 1×10

5 celler /brønd blev podet på μ- Slide 4 godt ibi Treat Microscopy Afdeling (ibidi GmbH, Martinsried, Tyskland) natten over og behandlet med lipid mærket med DiD farvestof på 1:20 og 1:10 fortynding med eller uden ApoA- II i 24 timer. Cellulær optagelse blev undersøgt under Leica konfokalmikroskopi (Leica, Tokyo, Japan). Lipid optagelse intensitet blev kvantificeret af Leica Microsystem LAS aF (GmbH, Mannheim, Tyskland) og resultaterne blev udtrykt som relativ intensitet.

Cryo transmissions elektron mikroskopi (TEM)

Et laboratorium bygget fugt-kontrollerede vitrifikation system blev anvendt til at forberede prøverne for Cryo-TEM. Fugtighed blev holdt tæt på 80% for alle eksperimenter og omgivelsestemperatur var -22 ° C. En 4 pi alikvot af prøven blev pipetteret på et 300 mesh kobber gitter belagt med Lacy Formvar-carbon film (Pro-SciTech, Thuringowa, Queensland). Efter 30 s adsorption tidsrum blev gitter blottet manuelt med Whatman 541 filterpapir, for mellem 2 og 10 s. Risten blev dernæst kastet ud i flydende ethan afkøles af flydende nitrogen. Frosne gitre blev opbevaret i flydende nitrogen indtil de er undersøgt. Prøverne blev undersøgt ved hjælp af en Gatan 626 cryoholder (Gatan, Pleasanton, CA, USA) og en Tecnai 12 Transmission Electron Microscope (FEI, Eindhoven, Holland) ved en spænding på 120 kV, der er udstyret med en FEI Eagle 4k × 4k CCD (FEI, Eindhoven, Holland). Prøverne blev set ved 100 000-150 000 gange forstørrelse.

Gel elektroforese

En vandig 0,5% m m agarosegel var forberedt /og nedsænket i 1 × TBE (Tris-borat-EDTA-buffer , fremstilles ved fortynding 10x stamopløsninger, pH 9) buffer [36, 37], køre i et vandret elektroforesesystem (Mini-Sub Cell GT, Biorad, elektrode afstand 15 cm) i 45 minutter ved 90 V. Gel billeder blev taget med en Carestream MI ved en bølgelængde på 650 nm excitation og 700 nm emission. Salg

ApoA-II plus lipid blev rekonstitueret ved inkubering af 2 pi ApoA-II (2 mg /ml) og 2 pi af mærket SMOFlipid (10 mg /ml) ved 37 ° C i 24 timer. Før du lægger gelen med prøven, blev hver prøve fortyndet ved 1: 5 i PBS (pH 7,4) og tilføjet 2 pi 6X loading farveopløsning (# R0611, Fermentas, Life Science) indeholder 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 0,03% bromphenolblåt, 0,03% xylencyanol FF, 60% glycerol 60 mM EDTA-buffer. 12 pi prøve blev påsat i hver brønd i gelen. Alle forsøg blev udført ved stuetemperatur. Salg

Generation of PDAC patient afledt tumor xenograft (PDTX) i ikke-obese diabetiske /svær kombineret immundefekt (NOD /SCID) mus Salg

Alle dyreforsøg var i overensstemmelse med retningslinjerne i den nordlige Sydney Local Health District (NSLHD) Animal Ethics Committee i denne undersøgelse og huse på Kearns facilitet, Kolling Institute of Medical Research, University of Sydney. Protokollen blev godkendt af NSLHD Animal etiske komité (Protokol nummer 1011-015A). Alle operation blev udført under anæstesi ved hjælp af isofluran med NO

2 og Oxygen (2: 1) og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse. Vi har etableret PDTX model som beskrevet af Wong MH og Xue A et al. [38, 39] i henhold til protokollen NSLHD HREC- 0909-227M. Kort fortalt, mandlig NOD /SCID-mus i alderen 6 til 8 uger, blev bedøvet ved anvendelse isoflourane med NO

2 og oxygen (2: 1). Små stykker af patientens friske tumorvæv blev xenotransplanteret under subrenal kapsel (SRC) i en mus. På otte uger efter xenograft blev mus anvendt til at undersøge

in vivo

lipidoptagelse.

De dyr, der bærer den første generation xenografter (F1) blev randomiseret og fordeles i tre grupper (a) køretøj (saltvand); (B) lipid (c) lipid plus ApoA-II og injiceret via halevenen. At homogenisere tumorvolumener nogle af F1 tumorerne var passage ind anden gruppe mus (F2) og efterfølgende passage ind F3. Dyret bærende F3 generation af xenotransplantattumorer blev anvendt til validering undersøgelse. Lipid optagelse blev målt på forskellige tidspunkter af Carestream Molecular Imaging (MI) (Carestream Molecular Imaging, USA). Ved slutningen af ​​hvert forsøg organer og tumorer blev høstet og analyseret yderligere.

In vivo billedanalyse

Til in vivo optisk billeddannelse blev tumor-bærende mus injiceret med DiD307 mærket lipid med eller uden Apo-AII ved injektion i halevenen. Billeddannelse blev udført umiddelbart efter injektion, ved 4 timer, 24 timer, 48 timer og 96 timer ved in vivo Carestream MI Imaging System. Mus blev aflivet 48 timer efter injektion, nyre og har tumor, lever, milt, bugspytkirtel, lunger, hjerne og muskler blev høstet og analyseret ved Carestream MI ved en bølgelængde på 650 nm excitation og 700 nm emission.

Histologi og immunhistokemi

Vævsprøver blev fikseret i 10% phosphatpufret formalin og indlejret i paraffin. Formalinfikserede, paraffinindlejrede snit blev skåret 4-um tykke snit og farvet med Mayers hematoxylin og eosin (H 0,05 niveau.

Resultater

ApoA-II effekt på SMOF lipid emulsion

Når ApoA-II blev sat til den uigennemsigtige lipid emulsion, en faseovergang fundet sted, og det emulgerede uigennemsigtige opløsning omdannet til et transparent klar væske på mindre end en time (S1 fig). Cryo TEM billeder af SMOF lipid plus ApoA-II demonstrerede, at de emulgerede partikler omdannes til unilaminar vesikler (Fig 1B). Mere interessant er den lille størrelse af disse strukturer, hvoraf mange var 10-50 nm i diameter, langt mindre end de oprindelige partikler i emulsionen. Denne morfologisk ændring i struktur og størrelse er mest sandsynligt på grund af samspillet og integration af ApoA-AII inden lipid selvstændige enheder og omdannelsen til en transparent opløsning indeholdende hovedsagelig små unilamellare vesikler, som demonstreret ved Cryo-TEM (fig 1A og 1B).

Cryo-TEM mikrograf billede af SMOFlipid emulsion uden ApoA-II (A) og efter tilsætning af ApoA-II (B). Bemærk den bi-lags struktur af lipidet overflade af nanopartikel lignende strukturer i nærvær af ApoA-II (sorte pile). (C) Spectral fluorescens farve fotografi af en 0,5% agarosegel køre i 45 minutter ved 90 V i 1 × TBE-buffer. SMOFlipid mærket med DiD ikke migrere gennem godt, men rekonstituerede mærket SMOFlipid med ApoA-II migrerede som et band.

Gel elektroforese vist, at rekonstitueret ApoA-II plus lipidkomplekser migreret gennem gelen som et band mens lipid alene stadig forblev i brønden (fig 1C), hvilket antyder, at ApoA-II ændret fedtemulsionen og reducerede partikelstørrelsen tillader migration i gelen. Dette er i overensstemmelse med de cryo TEM resultater (Fig 1A og 1B).

Konfokal mikroskopi af kræftceller dyrket i lipid-løsninger med og uden ApoA-II

Optagelsen af ​​lipid ved CFPAC-1 celler (fig 2A3), PANC-1 (S2A fig) og primære tumorcellelinier (S2B fig) blev forbedret, når det rekonstitueres lipid plus ApoA-II blev sat til dyrkningsmediet. Lignende effekter blev også set i A549 lungekræft celler (S2C Fig). I disse forsøg blev ApoA-II visualiseret ved ApoA-II-antistoffer, som viste, at det var lokaliseret til kræft-cellemembraner (fig 2A og S2 Fig). Mens reduceret fluorescensintensitet blev observeret i CFPAC-1-celler, når celler blev præ inkuberet med anti SR-B1 blokerende antistof (Fig 2A4). Når CFPAC-1-celler blev præ inkuberet med umærkede stort overskud SMOFlipid alene (Fig 2B1) og derefter inkuberet med det rekonstituerede SMOFlipid /ApoA-II /gjorde (fig 2B2) yderligere optagelse DID indtruffet, og ApoA-II-antistof farvede perifere komponenter af celler. Således selvom præinkubering reduceret optagelse af SMOFlipid /ApoA-II optagelse stadig forekom gennem den mekanisme af overfladen tiltrækning til ApoA-II [4, 5]. I nærvær af ApoA-II lipidoptagelse er betydeligt større i forskellige koncentrationer sammenlignet med alene lipidet (Fig 2C og 2D). Disse resultater antyder, at ApoA-II er tiltrukket til cellemembranen mens lipid var transport til PC celler. Dette fund er i en aftale med Fan Y

et al

. [4] og Silver

et al

. [5]. Tilsammen disse resultater støtte for, at lipid nanopartikel kan endocytose.

SMOFlipid blev mærket med gjorde (rød), blev ApoA-II mærket grøn med et sekundært antistof og DAPI farvede kernerne blå. (A1) celler behandlet med ApoA-II alene, (A2) celler behandlet med lipid alene, (A3) celler behandlet med rekonstituerede lipoproteiner efter tilsætning ApoA-II til VIDStE mærket SMOFlipid (SMOF /A-II) demonstrerer forøget optagelse og (A4 ) -celler behandlet med (SMOF /A-II) efter forbehandling med anti-SR-B1antibodies hvilket reducerede lipidoptagelse (skala bar, 20 pm). (B) Celler blev forbehandlet med umærket lipid ved 1:10 fortynding og (B2) efter 2 timer SMOF /A-II blev tilsat, viste det sig at være endocytose i cytoplasmiske vesikler som vist i (B3) og (B4). ApoA-II (grøn) er fastgjort med cellemembranen (gul pil hoved) og ligeledes i cytoplasmaet i del er forbundet med lipidet (rød pil hoved) i Differential Interference Contrast (DIC) overlaybillede (skala bar 25 um). (C) Levende cell imaging forsøg viste en større optagelse af lipid i celler, når rekonstitueret lipoproteiner efter tilsætning ApoA-II VIDStE mærket SMOFlipid blev sat til medierne for lipid koncentrationer på 1:20 og 1:10 (skala bar 100 um). (D) Intensiteten af ​​DID farvning var større, når 4 prøver blev undersøgt med otte til tolv områder af interesse for hver undersøgelse, hvor ApoA2 øgede optagelsen af ​​lipid 25,6 ± 2,2,

P

= 0,02 og 54,8 ± 2,2 ,

P

= 0,004 for fortyndinger af 1:20 og 01:10 hhv.

SMOFlipid ApoA-II henvender PDAC PDTX in vivo

for at vurdere tumor målretning kapacitet af lipid plus ApoA-II anvendte vi en PDAC PDTX model i mus. Lipid /har eller lipid /Nej /ApoA-II blev injiceret i halevenen af ​​første generation tumorbærende mus. Hele dyret billeddannelse efter 48 timer afslørede lipidoptagelse i PDAC xenotransplantater tumorer er begrænset i lipid-plus ApoA-II injicerede mus sammenlignet med lipid alene (Fig 3A og S3A Fig), men også i leveren, mave og milt. Dette blev bekræftet af de eksplanterede organer ved

ex vivo

imaging men lidt lipid blev set i lunger og hjerne, men ikke set i normal bugspytkirtlen (Fig 3B og S3B Fig). Den relative fluorescensintensitet blev øget med 3,4 gange i målrettede kræft væv, hvornår har-lipid /ApoA-II blev injiceret (Fig 3C) sammenlignet med DID- lipid, i overensstemmelse med figur 2. Tilsammen vores resultater tyder på, at ApoA-II henvender menneske PDAC.

(A) Spectral reflektans fluorescens billeder af 8 uger gamle xenografter taget 48h efter haleveneinjektion PBS, har mærket SMOFlipid uden eller med ApoA-II ved hjælp af Carestream molekylær billeddannelse. Bemærk den store udbredelse af gjorde, er bedre lokaliseret til tumorer, når ApoA-II er inkluderet med lipid. Pile viser stedet for tumorer. (B) Spektrale fluorescensbilleder af eksplanterede tumorer og organer taget 48h efter injektion fra mus efter en halevene injektion af enten PBS, lipid /gjorde (n = 2) eller lipid /DiD plus ApoA-II (n = 2) (højre panel ) sammen med H

n

= 3.

Scavenger receptor B klasse type 1 (SR-B1) udtryk er højere human PDAC

Ved western blotting, for første gang, vi demonstreret, at SR-B1-ekspression var 13,2, 10,6, 3,1 og 2,3 gange højere i PANC-1, MiaPaCa-2, CFPAC-1 og BxPC3 cellelinjer sammenlignet med normal pancreas cellelinje (HPDE6) (fig 4A). Immunhistokemi (IHC) viste, at SR-B1-ekspression var 3,7 gange større i PDAC væv sammenlignet med normal pancreas (fig 4B). I overensstemmelse med figur 2, fandt vi, at ApoA-II-ekspression var højere i tumorer, når mus blev injiceret med kombinationen af ​​lipid og ApoA-II emulsion (Fig 4C), mens der ikke var nogen forskel i SR-B1 ekspression i tumorer i nogle grupper ( fig 4C).

(A) HPDE6, PANC-1, MiaPaCa-2, CFPAC-1 og BxPC3 celler blev dyrket og SR-B1-ekspression blev målt ved Western blotting. Bandet intensitet proteinerne blev normaliseret med β-actin og HPDE6 blev defineret som 1. Værdier er gennemsnittet af to separate forsøg. (B) Ekspression af SR-B1 ved IHC på normal bugspytkirtlen (NP) og menneskelige PDAC væv. Indpresningsdybde, IgG repræsenterer isotypebestemt matchede primære antistof til anti SR-B1. Graf viser kvantificering af SR-B1 udtryk ved procentdelen af ​​farvede celler X intensitet fra 3 separate patienter og NP blev defineret som 1. (C) Angivelse af SR-B1 og ApoA-II ved IHC i tilsvarende xenotransplanterede PDAC tumorer ved 48 h efter haleveneinjektion af lipid med eller uden ApoA-II. Indpresningsdybde, IgG repræsenterer isotypebestemt matchede primære antistof til anti-ApoA-II. (D) Virkninger af anti SR-B1 alene i HPDE6, PANC-1, MiaPaCa-2, CFPAC-1 og BxPC3 cellevækst. (E) Celler blev forbehandlet med eller uden SR-B1-antistof (2,5 ug /mL) i 2 timer og derefter behandlet med ApoA-II, lipid og lipid plus ApoA-II i 48 timer. Proliferation blev målt ved krystalviolet assay. Værdier er middel ± SD;

n

= 4. *

, ‡, # og ± p 0,05 over for kontrol, ApoA-II, lipid og lipid + ApoA-II, med anvendelse af variansanalyse.

ApoA-II forbedret celleproliferation i humane cancerceller

Fire PC cellelinier Panc-1, MiaPaCa-2, CFPAC-1 og BxPC3 voksede hurtigere (fig 4E), når de havde lipid og ApoA-II føjet til deres dyrkningsmedium sammenlignet med kontroller, ApoA-II alene eller med lipid alene (undtagen CFPAC-1 celler). Alternativt ApoA-II nedreguleret normale HPDE6 celler (Fig 4E). Dette var mest tydeligt efter 48 timer, og indebærer, at kombinationen af ​​lipid og ApoA-II øgede optagelsen af ​​lipid og dermed energi tillade PC celler til at vokse hurtigere. Der var en lignende effekt på humane kræftceller fra lunge-, bryst- og prostatakræft ved 48 h (S4 Fig). Men ApoA-II ikke fremmer væksten af ​​brystcancer MCF7, som bevarede karakteristika differentiering og vokser langsomt [40]. Desuden præinkubation med anti SR-B1-antistof fuldstændigt omvendt lipid plus ApoA-II stimuleret celleproliferation i PANC-1, CFPAC-1 og BXPC3 celler og delvis men betydeligt i MiaPaCa-2-celler (Fig 4E). Interessant inhibering af SR-B1 forbedret ApoA-II plus lipid induceret nedregulering af cellevækst i HPDE6 (Fig 4E). Anti SR-B1 alene ved 2,5 ug /ml havde ingen signifikant virkning på HPDE6, PANC-1, MiaPaCa-2 og BxPC3 cellelinjer, mens signifikant nedreguleret CFPAC-1 cellevækst (figur 4D). Dette kan skyldes forskellen densitet niveau for SR-B1 i PANC-1, MiaPaCa-2, BxPC3 og CFPAC-1 cellelinjer (Fig 4A).

Discussion

ApoA-II ændret den fysiske struktur af SMOF lipid ved at reducere størrelsen af ​​de lipidpartikler og inducere dannelsen af ​​et dobbeltlag membran nanoparticle- lignende struktur. Dette er i overensstemmelse med den kendte struktur og funktion af ApoA-II i HDL [41]. Kombinationen af ​​ApoA-II og lipid fremmes signifikant væksten af ​​PC cellelinier og cellelinier fra lunge-, bryst- og prostatacancer. Desuden ApoA-II forbedre lipidoptagelse i PANC-1, CFPAC-1, primære tumorceller og i PDXT. Optagelsen af ​​eksogent lipidemulsion med ApoA-II, i PC tumorer kan udnytte SR-B1-receptoren (Fig 2A4), fordi den danner en HDL lignende struktur, som har en høj affinitet til SR-B1 [26].