PLoS ONE: Sekvens-afhængige antiproliferative virkninger af Gefitinib og Docetaxel om ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) Celler og mulig mekanisme

Abstrakt

Formål

Seneste kliniske undersøgelser viste, at den sekventielle kombination af epidermal vækstfaktor receptor tyrosinkinasehæmmere (EGFR-TKI’er) og kemoterapi kan forlænge PFS og /eller OS af avancerede ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) hos patienter med EGFR-mutation. Formålet med denne undersøgelse var at vurdere den optimale kombination sekvens og til at udforske dens mulige mekanisme.

Metoder

PC-9 celler og A549 celler, de lungeadenokarcinom celler med mutant og wide-typen EGFR henholdsvis blev behandlet med docetaxel /gefitinib alene eller i forskellige kombination tidsplaner. EGFR og K-ras genet status blev bestemt ved qPCR-HRM teknik. Celleproliferation blev detekteret ved MTT-assayet. Ekspression og phosphorylering af EGFR, ERK, Akt og IGF-1R blev påvist ved western blot. Cellecyklusfordeling blev observeret ved flowcytometri

Resultater

Kun sekventiel administration af docetaxel, efterfulgt af gefitinib (D → G) inducerede signifikant synergistisk effekt i begge cellelinier. (Kombination Index 0,9). Det omvendte rækkefølge (G → D) resulterede i en antagonistisk interaktion i begge cellelinier (CI 1,1), mens den samtidige administration (D + G) viste additiv (0,9 CI 1,1) -synergistic effekt i PC-9 celler og antagonistisk-additiv virkning i A549-celler. Mekanisme undersøgelser viste, at docetaxel-induceret phosphorylering af EGFR og ERK blev undertrykt af efterfølgende anvendes gefitinib, men ikke ved samtidig eksponering af gefitinib. Den gefitinib-undertrykt phosphorylering af EGFR og ERK blev vendt hverken ved samtidig eller ved efterfølgende administration af docetaxel. D + G styrket deres hæmning på phosphorylering af IGF-1R i PC-9 celler.

Konklusioner

De cytotoksiske lægemidler efterfulgt af EGFR-TKI’er kan være den optimale kombination til antiproliferative effekter i EGFR -mutant NSCLC celler og phosphorylering af EGFR og ERK kan bidrage til denne virkning

Henvisning:. Chen B, Zheng J, Zeng Y, Li B, Xie B, Zheng J, et al. (2014) Sekvens-afhængig antiproliferative virkninger af Gefitinib og Docetaxel om ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) Celler og mulig mekanisme. PLoS ONE 9 (12): e114074. doi: 10,1371 /journal.pone.0114074

Redaktør: Karl X. Chai, University of Central Florida, USA

Modtaget: Juni 25, 2014, Accepteret: November 3, 2014; Udgivet: December 4, 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (https://www.nsfc.gov (nr 81.172.225, 81.101.821 og 81.000.819.). cn /). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) er den førende årsag til kræft død verden over. Det er velkendt, at for behandling af fremskreden NSCLC, er epidermal vækstfaktor receptor tyrosinkinasehæmmer (EGFR-TKI) og kemoterapi anbefales som første-linje-behandling til patienter med aktiv EGFR mutation og vildtype EGFR hhv. Denne anbefaling er baseret på resultaterne af et fase III randomiseret forsøg iPass, hvor patienter med EGFR-mutationer, der fik gefitinib havde øget progressionsfri overlevelse (PFS 24,9% vs. 6,7%), responsrate (RR 71,2% vs. 47,3%) og livskvalitet sammenlignet med dem, der modtager kemoterapi [1]. Men anvendelsen af ​​platinbaseret kemoterapi og EGFR-TKI har nået et terapeutisk plateau. Selv om der ikke ny revision vises i sidste retningslinje, nogle fase III kliniske forsøg herunder FASTACT-2 [2] og INFORM [3] har taget endnu et skridt og viste, at kemoterapi kombineret med EGFR-TKI i specifikke tidsplaner kunne forbedre prognosen, især hos patienter med EGFR-mutationer. Derfor vi formodes at yderligere forbedringer kan komme fra resultaterne af nye mål, overvindelse af EGFR-TKI’er tolerance og kombinationen af ​​EGFR-TKI med kemoterapi, da mekanismerne i deres anti-tumor aktivitet er forskellige.

for kombinationsbehandlingen blev grundlæggende tre skemaer diskuteret i de seneste kliniske forsøg: 1. samtidige administration; 2. kemoterapi efterfulgt af EGFR-TKI; 3. EGFR-TKI efterfulgt af kemoterapi. INTAKT-2 viste TRIBUTE og talent undersøgelser, responsrate og gennemsnitlig overlevelse (OS) begunstiget samtidig kombination kun EGFR-mutant patienter, men ikke i vild-type eller umarkerede patienter [4] – [6]. WJTOG0203 og informere forsøg viste, at sekventiel administration af kemoterapi efterfulgt af EGFR-TKI virkede gavnligt for fravalgt befolkning (med væsentligt forbedret OS og PFS) [7], [3]. En anden fase III studie FASTACT-2 for nylig rapporteret, at indskudt kemoterapi og erlotinib var en anden farbar første-linje for patienter med ukendt EGFR-status. Det blev vist, at PFS og OS blev signifikant forlænget med kemoterapi plus erlotinib versus kemoterapi plus placebo (PFS: 7,6 m vs. 6,0 m, P 0,0001; OS: 18,3 m vs. 15,2 m, P = 0,042). Fordelen var endda størst for patienter EGFR-mutant [2]. Derimod Kanda et al viste i et fase II forsøg, at gefitinib efterfulgt af kemoterapi fik et bedre PFS i EGFR-mutant patienter sammenlignet med tidligere rapporter ved hjælp gefitinib alene som den første linje behandling [8]. Men ved nu ikke klinisk forsøg har sammenlignet de tre skemaer med hinanden og fortalte hvilken var optimal. I denne forbindelse er det første formål med den foreliggende undersøgelse er at finde ud af den optimale tidsplan af tre forskellige kombinationsstrategier af docetaxel og gefitinib.

På den anden side, den cellulære mekanisme af sekvens-afhængig effekt af gefitinib i kombination med kemoterapeutiske stoffer er fortsat et åbent spørgsmål. Nogle tidligere undersøgelser viste, at den synergistiske virkning fremkaldt af sekventielt administreret EGFR-TKI efter cytostatika kan være korreleret med EGFR fosforylering, mens en antagonistisk effekt af EGFR-TKI’er efterfulgt af kemoterapi var relateret med reguleringen af ​​cellecyklus fordeling [9], [ ,,,0],10]. Desuden rapporterede seneste undersøgelser, at insulin-lignende vækstfaktor receptor-1 (IGF-1R) påvirkede cellen følsomhed over for kemoterapi samt EGFR-TKI’er gennem regulering af signalvejen såsom PI3K /AKT og MARK /ERK [11], [12]. Baseres på disse resultater, vores anden mål er at sonde ind i den cellulære mekanisme af sekvens-afhængige effekter af docetaxel og gefitinib på lungekræft celler gennem vurdering af de mulige ændringer i de ovennævnte signalveje og i cellecyklus distribution.

Materialer og metoder

Materialer

Gefitinib (Astra Zeneca, UK) og docetaxel (Sanofi Aventis, Frankrig) fremstilles i dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma Aldrich, USA) og opbevares ved – 20 ° C. De lægemidler blev fortyndet i frisk medium før forsøget, og den endelige DMSO-koncentration oversteg aldrig 0,1%.

Cell Culture

Menneskelig lungeadenokarcinom celle A549 og PC-9 [13] blev venligt givet ved Institut for Biokemi og Cellebiologi (Shanghai, Kina) og National Cancer center Hospital of Japan (Tokyo, Japan), hhv. Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité og revision bestyrelse vores hospital. Celler blev dyrket i RPMI-1640-medium suppleret med 10% bovint serum (Gibco, Grand Island, NY, USA) i en fugtig atmosfære (Forma Scientific, Marietta, OH, USA) indeholdende 5% CO

2 ved 37 ° C .

Identifikation af EGFR og K-ras genet status

DNA blev ekstraheret fra A549 og PC-9 celler under anvendelse af Qiamp væv (Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Exon 18, 19, 20 og 21 i EGFR-genet samt exon 2 og 3 i K-ras-genet blev påvist ved brug af kvantitativ PCR høj opløsning smeltning (qPCR-HRM) -teknik.

MTT assay

A549 og PC-9-celler blev podet i 96-brønds plader (10

4 celler per brønd) og blev opdelt i 6 grupper og behandlet som følger: 192 Kontrolgruppe (C): celler blev inkuberet med PBS i 72 timer; 193 Docetaxel gruppe (D): celler blev behandlet med docetaxel i 72 timer; 194 Gefitinib gruppe (G): celler blev behandlet med gefitinib i 72 timer; Docetaxel → Gefitinib gruppe (D → G): celler blev inkuberet med docetaxel i 24 timer efterfulgt af gefitinib i 48 timer; Gefitinib → Docetaxel gruppe (G → D): celler blev inkuberet med gefitinib i 48 timer efterfulgt af docetaxel i 24 timer; Samtidig gruppe (D + G): celler blev inkuberet i takt med docetaxel og gefitinib i 72 timer. Celleproliferation blev bestemt ved MTT-assayet. Den optiske densitet (OD) ved 490 nm blev bestemt under anvendelse af en 96-brønds MultiScanner auto-læser (Dynatech MR 5000). Hver test blev udført tre gange. Inhibition sats% = 100% – (OD

test-OD

blank) /(OD

kontrol-OD

blank) × 100%. Hvert forsøg blev gentaget tre gange.

Beregning af Combination Index (CI)

De antiproliferative virkninger af den kombinerede behandling blev vurderet ved Kombination Index (CI). Celler blev behandlet med tre forskellige sekvenser som nævnt ovenfor: D → G; G → D; D + G. Det stof doser blev kombineret i faste forhold mellem IC50-værdier beregnet ud fra MTT-analysen. Således har vi brugt 0,125, 0,25, 0,5, 1, 2 og 4 gange af IC50 doser af docetaxel og gefitinib. Resultaterne af sekventielle behandlinger blev analyseret ifølge fremgangsmåden af ​​Chou [14]. CI blev beregnet ved hjælp af CompuSyn software (ComboSyn, Inc., Paramus, NJ, USA), med CI 1,1, CI = 0,9-1,1 og CI 0,9 indikerer antagonistisk, additive og synergistiske virkninger, hhv. Hvert forsøg blev gentaget tre gange.

Western blot

A549 og PC-9 celler blev lyseret i buffer indeholdende proteinaseinhibitorer. Det totale protein af celler blev opnået ved anvendelse af kerneekstrakt Kit (Active Motif Corp, USA). Proteinkoncentrationen blev bestemt ved BCA-proteinassay (Pierce, Rockford, IL, USA). Prøver indeholdende 100 ug totalt protein blev elektroforesebehandlet på 10% SDS-PAGE og overført til en nitrocellulosemembran ved elektroblotting. Blottene blev probet under anvendelse af de følgende antistoffer: anti-EGFR (1:1000, Santa Cruz, CA), anti-phosphoryleret-EGFR (1:1000), anti-ERK1 /2 (1:600), anti-phosphoryleret-ERK1 /2 (1:600), anti-AKT (1:1000), anti-phosphoryleret-AKT (1:1000), anti-IGF-1R (1:600), anti-phosphorilated-IGF-1R (1:600 ) og anti-β-actin-antistof (1:800) (alle de ovennævnte antistoffer var fra Cell Signaling Technology, USA), efterfulgt af inkubation med peberrodsperoxidase (HRP) konjugeret gede-anti-muse-sekundært antistof (Santa Cruz, CA, USA). Blottene blev visualiseret ved en forøget kemiluminescens-kit (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL, USA) ifølge producentens anvisninger. Hvert forsøg blev udført tre gange.

Cell cyklus analyse

Frisk tilberedt celler blev overført til kryopræservering rør. Hver gruppe bestod af 3 rør. Efter behandlingerne blev celler vasket to gange med PBS og derefter fikseret med 70% alkohol ved 4 ° C natten over. Efter centrifugering ved 1000 rpm i 5 min, blev celler inkuberet med propidiumiodid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ved 4 ° C i 30 minutter i mørke før det underkastes et flowcytometer (FACScan, Becton Dickinson , Mountain View, CA). Celle cyklus blev analyseret ved anvendelse Multicycle-DNA Cell Cycle Analyseret software. Hvert forsøg blev udført tre gange.

Statistisk analyse

Forskellene mellem midler blev analyseret med ANOVA og data blev udtrykt som gennemsnit ±

SD

. Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse af SPSS 13.0 software (Chicago, IL). Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant, når

P

. 0,05

Resultater

EGFR og K-ras genet status i A549 og PC-9 cellelinier

qPCR-HRM teknik viste, at A549-celler husede en mutation i K-ras exon 2 og ingen mutation i EGFR-genet. PC-9 celler nærede en mutation i EGFR exon 19 og ingen mutation i K-ras, som var i overensstemmelse med tidligere undersøgelser [13].

Effekter af forskellige eksponering tidsplaner for gefitinib og docetaxel på celleproliferation

MTT assay viste, at docetaxel (10

-4 M~10

-10 M) eller gefitinib (10

-4 M~10

-8 M for A549 celler; 10

-4 M~10

-10 M til PC-9 celler) alene signifikant hæmmede udbredelsen af ​​A549 og PC-9 celler i en dosisafhængig måde (

P

0,05). IC

50 af docetaxel og gefitinib var 2,05 × 10

-7 mol /L og 1,22 × 10

-5 mol /l respe ctively for A549-celler (fig. 1A), og var 2,41 × 10

-8 mol /L og 5,65 × 10

-8 mol /l for henholdsvis PC-9 celler (fig. 1B). Især den inhiberende virkning af gefitinib på PC-9 celler var næsten 10

3-folder stærkere end på A549-celler (

P

0,05).

Celler blev behandlet med gradient koncentrationer (10

-4 M~10

-10 M) af gefitinib eller docetaxel i 72 timer. Celleproliferation blev bestemt ved MTT-assayet. (A) A549-celler; (B) PC-9 celler. *

P

0,05 sammenlignet med kontrolgruppen.

Bars

: ± SD, n = 3.

Vi derefter evaluerede antiproliferative virkninger af forskellige eksponering tidsplaner for gefitinib og docetaxel på både EGFR-TKI-resistente (A549) og EGFR -TKI-sensitive (PC-9) cellelinier. Som vist i figur 2, kun sekventiel administration af docetaxel efterfulgt af gefitinib (D → G) inducerede en tydelig synergistisk virkning (Cl 0,9) i begge cellelinier (inhiberende virkninger på IC

50 var 60,00 ± 4,90% for A549 og 62,15 ± 3,84% for PC-9 celler). Tværtimod G → D-sekvens resulterede i en antagonistisk interaktion (CI 1.1) i begge cellelinier. Samtidig administration af docetaxel og gefitinib (D + G) viste antagonistiske og tilsætningsstof (0,9 CI 1,1) effekter i A549 celler som koncentrationen narkotika steget; . Henviser i PC-9-celler, D + G viste additiv virkning med lav dosiskombination og synergistiske virkninger i høj dosiskombination

Celler blev behandlet med tre forskellige sekvenser af gefitinib og docetaxel (D → G; G → D ; D + G). De lægemiddeldoser blev kombineret i faste forhold af IC50-værdier (0,125, 0,25, 0,5, 1, 2 og 4 gange i IC50). (A, B) blev inhiberingshastigheden bestemt ved MTT-assayet. *

P

0,05, D → G versus G → D; #

P

0,05 D → G versus D + G. D → G sekvens produceret de mest potente inhiberende virkning. (C, D) Kombinationen index (CI) blev beregnet under anvendelse CompuSyn software. Kun D → G sekvens viste synergistisk virkning. (D-G) docetaxel efterfulgt af gefitinib; (G-D) gefitinib efterfulgt af docetaxel; (D + G) docetaxel og gefitinib administreres samtidig.

Bars

: ± SD, n = 3.

Effekter af forskellige eksponering tidsplaner for gefitinib og docetaxel på celle signalveje

Vi yderligere sonderet ind i mulig mekanisme af sekvens-afhængig virkning af gefitinib og docetaxel. Figur 3 viser, at for begge cellelinier, docetaxel alene forøgede phosphorylering af EGFR og ERK, hvorimod gefitinib alene undertrykt phosphoryleringen af ​​disse to proteiner. For D → G tidsplan, blev docetaxel-forstærket phosphorylering af EGFR og ERK betydeligt undertrykt af efterfølgende anvendes gefitinib, og dette omvendte effekt var meget stærkere i EGFR-mutant PC-9 celler. Tværtimod med hensyn til G + D og G → D tidsplaner blev gefitinib-undertrykt phosphorylering af EGFR og ERK vendes ved hverken samtidig eller efterfølgende administration af docetaxel.

Udtrykket og fosforylering af nogle repræsentative molekyler i korrelerede celle signalveje herunder EGFR, ERK, Akt og IGF-1R blev påvist ved western blot. (A) A549-celler; (B) PC-9 celler. (C) kontrolgruppe; (D) docetaxel alene; (G) gefitinib alene; (D-G) docetaxel efterfulgt af gefitinib; (G-D) gefitinib efterfulgt af docetaxel; (D + G) docetaxel og gefitinib administreres samtidig.

Både D → G og D + G tidsplaner hæmmede signifikant phosphorylering af IGF-1R i PC-9 celler, mens der i A549 celler, sådan hæmning virkning var knap registreret. Tværtimod G → D tidsplan øget phosphorylering af IGF-1R i begge cellelinier. Desuden ingen af ​​de tre skemaer viste påviselig effekt på udtryk og fosforylering af AKT.

Effekter af forskellige tidsplaner for gefitinib og docetaxel på cellecyklus distritution

Figur 4 viste, at for PC-9 celler, gefitinib alene inducerede markant G

0 /G

1 fase anholdelse sammenligner med kontrolgruppen (86,94 ± 2,33% vs. 57,32 ± 3,79%,

P

0,05); mens docetaxel alene inducerede markant G

2 /M fase anholdelse (45,67 ± 3,90% vs. 15,54 ± 2,57%,

P

0,05). D → G også signifikant anholdt cellecyklus i G

2 /M fase (56,31 ± 1,86% vs. 15,54 ± 2,57%,

P

0,05). Men viste G → D, blot en tendens til øget G

0 /G

1 fase (74,39 ± 2,78% vs. 57,32 ± 3,79%,

P

0,05).

virkningerne af forskellige administrative tidsplaner for gefitinib og docetaxel på cellecyklusfordeling blev påvist ved flowcytometri. (C) kontrolgruppe; (D) docetaxel alene; (G) gefitinib alene; (D-G) docetaxel efterfulgt af gefitinib; (G-D) gefitinib efterfulgt af docetaxel; (D + G) docetaxel og gefitinib administreres samtidig. *

P

0,05 sammenlignet med kontrolgruppen. n = 3.

For A549 celler, gefitinib alene havde ingen bemærkelsesværdige virkninger på cellecyklus distribution, mens docetaxel alene inducerede markant G

2 /M fase anholdelse sammenligner med kontrolgruppen (49,58 ± 2,70 % vs. 6,87 ± 1,35%,

P

0,05). D → G også signifikant anholdt cellecyklus i G

2 /M fase (60,74 ± 3,57% vs. 6,87 ± 1,35%,

P

0,05). Men viste G → D, blot en tendens til øget G

0 /G

1 fase (78,42 ± 2,52% vs. 72,13 ± 3,89%,

P

0,05).

diskussion

Den foreliggende undersøgelse undersøgte sekvens-afhængige antiproliferative virkninger af gefitinib og docetaxel i tre forskellige kombinationsmuligheder tidsplaner i både PC-9 celler (EGFR mutant, K-ras WT) og A549 celler (EGFR WT, K-ras mutant). Når gefitinib og docetaxel blev brugt alene i de to cellelinier, den inhiberende virkning af gefitinib på PC-9 celler var dramatisk stærkere end på A549-celler, som var i overensstemmelse med tidligere rapporter [1]. Imidlertid IC50 for gefitinib var kun halvdelen i PC-9 sammenlignes med den i A549; mens der i det kliniske arbejde, gefitinib er langt mere effektiv for patienter med EGFR-mutation end docetaxel. Vi skulle dette kunne være, fordi i

i

vitro

undersøgelse, test agenter blev anvendt direkte på målceller, men i

i

vivo

undersøgelse agenterne blev normalt givet gennem cirkulation system, som kunne påvirke fordelingen og koncentrationen af ​​forskellige stoffer.

Vores resultater viste også, at docetaxel efterfulgt af gefitinib (D → G) var signifikant bedre end andre transportformer i forbindelse med antitumorvirkninger ikke kun i EGFR-mutant og K-ras WT PC-9-celler, men også i EGFR WT og K-ras mutant A549-celler. Dette var i overensstemmelse med en række prækliniske undersøgelser, som er indskrevet et panel af forskellige lungekræft cellelinier behandlet med kemoterapi /EGFR-TKI og rapporterede, at rækkefølgen af ​​kemoterapi → EGFR-TKI havde fordel i forhold til andre modaliteter [8], [9], [ ,,,0],15]. Nogle fase III kliniske forsøg herunder WJTOG0203, INFORM og FASTACT-2 også valideres at den sekventielle administration af kemoterapi efterfulgt af EGFR-TKI bemærkelsesværdigt forbedret resultatet [4] – [6]. Derfor vores resultater produceret stærk prækliniske støtte til at overvinde den terapeutiske plateau af EGFR-TKI og kemoterapi, og kan være særligt vigtigt for bekæmpelse mod refraktær NSCLC. Det er nødvendigt at bemærkes, at i den foreliggende undersøgelse, blev D → G synergisme også observeret i EGFR vildtype cellelinier. Selvom lignende resultater også blev rapporteret af nogle prækliniske og kliniske forsøg [8], [16], [17], mange flere data viste, at patienter med vildtype-EGFR ikke kunne drage fordel af EGFR-TKI behandling [4] – [6] . Vi formodede, at det var fordi i vores studie IC50 doser af gefitnib for hver cellelinje blev anvendt, hvilket betød en tusind folder af gefitinib blev brugt til A549 celler sammenlignet med PC-9 celler. Naturligvis så ekstremt høje doser kunne ikke duplikeres direkte i klinisk arbejde, men relativt høj dosis af EGFR-TKI er allerede blevet forsøgt for NSCLC patienter med hjernemetastaser og positive resultater blev rapporteret [18], [19]. Det bør være særligt gavnligt for patienter med vildtype-EGFR hvis lignende tilstande blev forsøgt, og det lykkedes i en sådan undergruppe.

Med hensyn til samtidig administration af docetaxel og gefitinib, vores resultat syntes slags kompliceret, med additiv (0,9 CI 1,1) -synergistic effekt observeret i PC-9 celler og antagonistisk-additiv effekt i A549 celler. Dette indikerede, at D + G var mere effektivt i EGFR mutantceller end i vildtypeceller. Sådanne data svarede til andre prækliniske rapporter, som indikerede, at EGFR-genet status kunne være en prædiktor for aktiviteten af ​​kombinationen samtidig [9]. Selvom tidlige fase III-studier ikke påvist fordel af samtidig kombination af kemoterapi + EGFR-TKI løbet kemoterapi alene i uselekterede patienter, en undergruppe analyse af TRIBUTE viste, at erlotinib samtidig kombineret med kemoterapi tillagt en bemærkelsesværdig højere responsrate hos patienter med mutant EGFR end patienter med vildtype-EGFR (53% vs. 18%,

P

0,01) [20]. Derfor er vi formodes at for samtidig kombination, kan EGFR mutation forudsige en terapeutisk fordel. Tilsvarende er det også nødvendigt at bemærkes, at de doser af gefitinib anvendes i A549-celler var meget mere højere end i PC-9-celler, hvilket kunne have blyholdig til D + G -induceret additiv effekt observeret i A549-celler.

Vi yderligere undersøgt i den mekanisme, der ligger til grund synergien induceret af D → G tidsplan. Det er blevet påvist, at EGFR-TKI’er kompetitivt bundet med EGFR og blokerede flere nedstrøms signalveje herunder PI3K /Akt og MARK /Erk, resulterede i inhibering af tumorcelleproliferation, tumorvaskularisering og metastase [21], [22]. En tidsplan undersøgelse fra Jiang et al. afslørede, at synergisme af D → G tidsplan kan være relateret med MAPK phosphorylering forholdet [15]. Vores data viste, at phosphorylering af EGFR og ERK (pEGFR og pERK) blev styrket ved docetaxel og blev undertrykt af gefitinib. Når gefitinib blev brugt efter docetaxel (D → G), docetaxel-øget pEGFR og pERK blev undertrykt af efterfølgende anvendes gefitinib. Men denne vending ikke påvist i to andre skemaer. Dette var i overensstemmelse med Giovannetti s [8] og Van Schaeybroeck s [23] undersøgelser, der rapporterede, at kun de celler udviste øget pEGFR kunne drage fordel af sekventielt brugt EGFR-TKI. Det blev derfor foreslået, at kemoterapi-induceret opregulering af pEGFR og pERK forstærket følsomhed lungekræft celler til efterfølgende anvendes EGFR-TKI, og til sidst resulterede i forbedrede resultater.

Western blot viste også, at gefitinib-induceret undertrykkelse af pEGFR og pERK blev ikke vendes ved samtidig eksponering af docetaxel, er det derfor antages, at gefitinib undladt at forstærke den hæmmende effekt af samtidig anvendt docetaxel grund af det lave niveau af pEGFR og pERK i A549 celler. Konsekvent, Van Schaeybroeck et al. [24] viste, at i kolorektale cancerceller, nedregulering af pEGFR førte til den antagonistiske interaktion mellem EGFR-TKI og cytotoksiske midler. Tværtimod blev der observeret synergistisk aktivitet af samtidig administration i EGFR mutant celler PC-9. Men ifølge vores resultater er nævnt ovenfor, EGFR og ERK fosforylering måske ikke den mulig mekanisme. Der var flere beviser viser, at IGF-1R ekspression blev korreleret med celle følsomhed over for kemoterapi og EGFR-TKI’er [25], [26]. Interferens af IGF-1R udtryk eller til administration af IGF-1R-inhibitor forbedret resultatet af cytostatika og EGFR-TKI’er, som kunne være korreleret med undertrykkelsen af ​​PI3K /Akt vej [27], [28]. I den foreliggende undersøgelse, D + G inhiberede signifikant phosphorylering af IGF-1R i PC-9-celler, hvorimod i A549-celler, blev en sådan inhibering virkning næppe påvises. Vi har derfor antaget, at den stærke hæmning af IGF-1R fosforylering kunne bidrage til synergien opnået i PC-9 celler. Yderligere bekræftelse er begrundet i opregulering og nedregulering af pIGF-1R i PC-9 celler.

G → D tidsplan viste antagonistisk effekt i både A549 og PC-9 celler. , Regulering af pEGFR og pERK undlod imidlertid at give en plausibel forklaring gefitinib-induceret nedregulering af pEGFR og pERK ikke blev vendt ved efterfølgende eksponering for docetaxel. I overensstemmelse med andre Forskere ‘tidligere undersøgelser [29], den flowcytometri analyse viste, at gefitinib faldt celler S og G

2 /M-fasen. Dette fald i celler i proliferativ fase kan dæmpe cellen følsomhed over for efterfølgende anvendes docetaxel som selektivt rettet mod G

2 /M-fase-celler, og resultere i antagonistiske virkninger.

Konklusion

kollektivt, foreslog vores data, at blandt de kombi modaliteter tilgængelige i klinisk arbejde, den mest effektive fremgangsmåde var sekvensen af ​​anvendelse af cytotoksiske midler efterfulgt af EGFR-TKI. Phosphorylering af EGFR og ERK kunne have bidraget til denne synergi. Men da kun to cellelinjer blev inkluderet i dette studie, udvidelse til et panel af NSCLC cellelinier med forskellig EGFR status samt

i

vivo

undersøgelser af dyremodeller er berettiget til yderligere vurdering af tidsplanen-afhængige effekt. Det er også værd at sammenligne de tre kombination skemaer i kliniske forsøg for at identificere den mulige “optimale” behandling modalitet for patienter med fremskreden NSCLC.