PLoS ONE: Fælles og Sjælden EGFR og KRAS mutationer i en hollandsk ikke-småcellet lungekræft Befolkning og deres kliniske Outcome

Abstrakt

Introduktion

I randomiseret forsøg med kun EGFR TKI en mindre andel af patienter med NSCLC har genetisk profilerede biopsier. Retningslinjer bevis til at udføre EGFR og KRAS mutation analyse i ikke-pladecellekræft NSCLC. Vi undersøgt tumor biopsi kvalitet tilbydes til mutation test, forskellige mutationer distribution og resultatet med EGFR TKI.

Patient og metoder

Kliniske data fra 8 regionale sygehuse blev undersøgt for patient- og tumor egenskaber, behandling og samlet overlevelse. Biopsier sendes til den centrale laboratorium blev evalueret for DNA kvalitet og efterfølgende analyseret for mutationer i exon 18-21 af EGFR og exon 2 af KRAS ved tovejs sekvensanalyse.

Resultater

Tumorer fra 442 efterfølgende patienter blev analyseret. For 74 patienter (17%) tumorer var uegnet til mutation analyse. Tredive-otte patienter (10,9%) havde EGFR mutationer med 79% kendte aktiverende mutationer. Et hundrede otte patienter (30%) havde funktionelle KRAS-mutationer. Mutationen spektret var sammenlignelig med den kosmiske database. Efter behandling i den første eller anden linie med EGFR TKI mediane samlede overlevelse for patienter med EGFR (n = 14), KRAS (n = 14) mutationer og vildtype EGFR /KRAS (n = 31) blev ikke nået, 20 og 9 måneder henholdsvis.

Konklusion

En ud af hver 6 tumorprøver var utilstrækkelig for mutation analyse. Patienter med EGFR aktiverende mutationer behandlet med EGFR-TKI har den længste overlevelse

Henvisning:. Kerner GSMA, Schuuring E, Sietsma J, Hiltermann TJN, Pieterman RM, de Leede GPJ, et al. (2013) Fælles og Sjælden EGFR og KRAS mutationer i en hollandsk Ikke-småcellet lungekræft Befolkning og deres kliniske resultat. PLoS ONE 8 (7): e70346. doi: 10,1371 /journal.pone.0070346

Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: Marts 8, 2013; Accepteret: 17 juni 2013; Udgivet: 29 juli 2013

Copyright: © 2013 Kerner et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist finansieret af CTMM Air force-konsortiet (https://www.ctmm.nl). CTMM betaler for GSMAK løn og havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre eller tilberedning af manuskriptet. Ingen andre eksterne finansieringskilder til denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:. Det CTMM Air Force Consortium er et privat /offentligt konsortium med inddragelse af den akademiske verden, private virksomheder, og regeringen. Det er ikke en kommerciel finansieringskilde. Gerald Kerner er finansieret af CTMM konsortium til at udføre forskningsprojektet (translationel og billedbehandling forskning i lungekræft), som er en del af hans afhandling. Forfatterne har ret til at offentliggøre alle hans arbejde og dele alle deres data offentligt. Ingen rådgivning, patenter eller produkter i udvikling er involveret. Alt sammen, dette har ingen indvirkning på forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer. Alle forfattere erklæret ikke at have nogen konkurrerende interesser.

Introduktion

Effekten af ​​EGFR tyrosinkinaseinhibitorer (TKI) hos patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) afhænger af EGFR-mutation status. Derfor vælge passende tumor prøve til mutationsanalyse er et vigtigt emne at gøre behandlingen beslutninger i NSCLC. I tidligere randomiserede undersøgelser, der sammenligner EGFR TKI terapi til regelmæssig kemoterapi, andelen af ​​patienter med tilstrækkelig tumorvæv til analyse varierede alligevel fra 10 til 38% [1], [2], [3], [4], [5], [6 ]. De fleste randomiserede studier brugt forskellige EGFR mutation test, der kun undersøgt et meget begrænset antal hotspot mutationer såsom L858R og exon 19 sletninger [2], [7], [8], [9], [10]. Hvad skete der med mindre hyppige mutationer er ikke altid indlysende. Da EGFR mutationer er kun til stede i ikke-pladecellekræft NSCLC [11], nøjagtig histologiske fænotypebestemmelse er obligatoriske for at træffe beslutninger om, hvilken type kemoterapi og til at forudsige a priori tilstedeværelse af mutationer. Den IASLC /ATS /ERS retningslinje anbefaler mutational test i ikke-pladecellekræft NSCLC [12].

I kaukasiske patienter med ikke-planocellulært lunge karcinom, KRAS mutation er mest almindelige (20-30% af tilfældene) [13], [14], efterfulgt i frekvens af mutationer i EGFR-genet (10-20% af tilfældene) [13], [15]. Inden histologiske fænotyper, visse træk synes at være forbundet med specifikke mutationer, f.eks mikropapillær aspekt af adenocarcinom med BRAF V600-mutationer [16]. Selv om det er fordelagtigt for patienter med aktiverende EGFR-mutationer for at modtage EGFR TKI [2], [3], [8], [17], [18], [19], hos patienter med andre typer af genetiske afvigelser denne behandling er ikke effektiv. For eksempel i en undersøgelse af patienter med EML4-ALK translokationer manglende tumorrespons til EGFR TKI blev rapporteret [20]. Men for NSCLC patienter med KRAS-mutationer beviserne er overbevisende. Adskillige undersøgelser viste en fuldstændig mangel på respons på behandling med en EGFR TKI [17], [21], [22], en undersøgelse viste, at NSCLC-patienter med tumorer indeholdende KRAS-mutationer havde en resultatet svarer til enten EGFR TKI eller kemoterapi [3] . Tumorer med KRAS-mutationer er blevet vist at have dårligere resultat sammenlignet med patienter med vildtype KRAS (WT) både når de behandles med kirurgi [23] eller med kemoterapi [24].

Formålet er at undersøge fordelingen af almindelige og sjældne EGFR og KRAS-mutationer sendt fra 8 regionale sygehuse til universitetet patologi afdelingen. Kvaliteten af ​​tumor biopsier indsendt til mutationsanalyse blev vurderet og mutation status blev relateret til behandling med EGFR TKI resultat.

Metoder

Patienter

Denne undersøgelse vedrører alle NSCLC tumor prøver fra otte regionale hollandske hospitaler i perioden november 2008 til april 2011, at der blev testet for mutationsstatus af en central patologi afdeling. Data om køn, rygning status, alder ved diagnose, stadium diagnose, lokalisering af metastaser, startdato og (forskellige) linjer af behandling modtaget blev indsamlet. Tumor prøver blev opnået ved enten bronkoskopi, transtorakal lunge biopsier og /eller fra pulmonal resektioner og blev sendt til de respektive patologi afdeling for histologisk undersøgelse. Histologi var ifølge 2004 WHO kriterier [25]. Respons på behandling blev udført i henhold til RECIST kriterier [26].

procedure Sample indsamling og DNA-ekstraktion

Fra hver formalin-fikseret og paraffin indstøbt (FFPE) tumorvæv blok, der blev sendt til patologi afdeling 4 um snit blev skåret. Efter hematoxylin og eosin-farvning blev objektglassene evalueret af en erfaren lunge patolog for tilstedeværelsen af ​​tilstrækkelig tumorvæv og estimere procentdelen af ​​tumorceller. Prøver med klart mindre end 50% tumorcellerne blev defineret som utilstrækkelige til EGFR /KRAS mutation test. Områder med 50% tumorceller præget af patologen på diaset. Dette område blev skrabet fra slide under anvendelse af en skalpel og opløst i TE-4 og 20 mg /ml proteinase K (Life Technologies, Grand Island, NY, USA). DNA blev ekstraheret ved inkubering natten over ved 55 ° C, efterfulgt af opvarmning til 100 ° C i 5 minutter for at inaktivere proteinase K og centrifugeret ved stuetemperatur ved 13.000 rpm. Den vandige opløsning blev direkte anvendt til PCR analyse eller opbevaret ved -20 ° C. DNA-koncentrationen blev målt på en ND1000 spektrofotometer (NanoDrop, Wilmington, DE, USA). Alle DNA isolater blev sat til 10 ng /pl i TE-4 før anvendelse. Til kvalitetskontrol blev genomisk DNA amplificeret i en multiplex-PCR, der indeholder en kontrol gen primersæt resulterer i produkter af 100, 200, 300, 400 og 600 bp efter BIOMED-2-protokol [27]. Kun DNA-prøver med PCR-produkter på 300 bp og større blev anvendt til mutationsanalyse. Alle prøver blev testet på DNA ekstraheret fra to uafhængige objektglas (dubletter). blev taget Alle standard forholdsregler for at undgå forurening af amplifikationsprodukter bruger separate laboratorier for præ- og post-PCR håndtering. For at undgå krydskontaminering, blev en ny mikrotom klinge bruges hver gang en ny prøve blev sektioneret.

Enten direkte sekventering eller høj opløsning smeltning (HRM) med bekræftende direkte sekventering blev udført i henhold til protokollen. Identiske mutationer i frem og bak sekventering blev påkrævet, før et positivt resultat rapporteres. Protokollen er beskrevet i tillæg S1. De anvendte primere til direkte sekventering eller HRM er beskrevet i supplerende tabel 1.

informeret samtykke og etik

Når patienter først besøgte ambulante afdeling, skriftligt informeret samtykke for blod og tumorvæv blev opnået for mutationsanalyse. EGFR og KRAS blev udført som en del af rutinemæssig diagnostisk tilgang og resultatet af disse tests blev dokumenteret i patientjournalen og kommunikeret med patienterne. Da dette er en retrospektiv undersøgelse for at indsamle og analysere kliniske patientdata, under det nederlandske lov til human medicinsk forskning (WMO), ingen samtykke var nødvendigt fra den medicinske etiske komité. Data blev kodet og ikke spores til den enkelte patient.

Statistik

Beskrivende statistik blev udført for patient- og tumor egenskaber. Hyppigheden af ​​almindelige og sjældne mutationer blev tabuleret. Hyppigheden af ​​EGFR og KRAS-mutationer blev sammenlignet med tilgængelige data om lungevæv fra kataloget af somatiske mutationer i Cancer database, (Cosmic DB; https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/). Forholdet mellem tilstedeværelse eller fravær af mutationer og forekomsten af ​​de fleste almindelige tumormetastaser blev bestemt under anvendelse af tosidet Fisher eksakt test. For denne særlige analyse patienterne med enten en EGFR eller et KRAS mutation blev sammenlignet med patienter, som blev bedømt som værende både EGFR og KRAS WT. Samlet overlevelse (OS) blev beregnet fra tidspunktet for diagnosticering stadie IV sygdom indtil censur eller død. Kun patienter med tilgængelige kliniske data, der havde udviklet sig til at iscenesætte IV sygdom og efterfølgende blev behandlet blev inkluderet for overlevelse analyse. Alle patienter, der behandles med en EGFR TKI uanset deres mutationsstatus blev evalueret for samlet overlevelse.

univariate Cox regressionsanalyse blev udført med kovariater alder, køn, histologi (tilstedeværelse af adenocarcinom, planocellulært og storcellet carcinoma) , blev også analyseret KRAS og EGFR mutation status, metastatisk websted (hjerne, knogle, lunge). Variabler med

s

-værdi mindre end 0,20 blev anvendt til den multivariate analyse.

Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS-version 18.0. Nominel

P

-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som signifikante.

Resultater

EGFR og KRAS-mutationer

Fra november 2008 til april 2011 474 prøver fra 442 patienter blev sendt til den centrale patologi afdeling for mutation analyse. Den mest almindelige histologiske klassifikation var adenocarcinom (80%), 8% af prøverne kom fra histologiske undertyper ikke forbundet med EGFR-mutationer (tabel 1).

To hundrede og enogtyve patienter (60,1% af alle testede patienter , 50% af alle patienter) var EGFR og KRAS WT. Tredive otte patienter (10,9% af alle testede patienter, 8,6% af alle patienter) havde en EGFR mutation (tabel 2). I 5 patienter, 2 forskellige EGFR mutationer faldt sammen i samme tumorvæv resulterer i alt 43 mutationer. Tredive af 38 patienter med EGFR-mutationer (79%) var aktiverende EGFR mutationer. Kun en patient havde en T790M mutation i den primære tumor. TTF-1 positive adenocarcinomer viste en EGFR mutation oftere end dem, der var TTF-1 negativ (26/150 vs 1/50, Fishers eksakte 2-sidet test,

s

= 0,01).

i alt 110 patienter (30% af alle testede patienter, 24% af alle patienter) havde en KRAS mutation med G12C (41%) og G12V (18%) er de hyppigste mutationer og vise en lignende fordeling som i Cosmic database (tabel 3). Vi fandt også 1 (1%) sjælden KRAS mutation i kodon 13, (p.G13Y). Desuden 2 patienter havde KRAS-mutationer uden for hotspot (p.V14L og p.L19F), disse er ikke-funktionel. Det betyder, at en funktionel KRAS mutation i alt 108 patienter blev påvist i vores kohorte. Sammenligningen af ​​mutationsmønstre resultater i de forskellige undertyper af NSCLC i vores befolkning er vist i tabel 4.

Kvalitet af tumor prøver til mutation analyse

Halvfjerds fem tumorprøver ( (16%) var ikke tilstrækkelige til mutation analyse. i 59 prøver væv indeholdt mindre end 50% tumorceller (mest på grund af omfattende sammenblandingen inflammation) og i 16 af kvaliteten af ​​DNA optrådte uegnet til mutation test. i fire af disse patienter en passende vævsprøve blev givet ved re-biopsi. I 3 tumorer ikke yderligere mutation analyse blev udført (SCC /carcinoid). Dette betyder, at fra 74 (75 + 3-4) (17%) patienter ingen resultater blev opnået fra mutationsanalyse. I i alt 345 patienter tumorprøverne var passende for både EGFR og KRAS-analyse. en enkelt KRAS eller EGFR mutation analyse blev udført i tumorprøverne på 18 og 5 patienter, henholdsvis (figur 1).

* 2 KRAS mutationer uden for hotspot, disse er formentlig ikke funktionel.

EGFR og KRAS mutationer og metastaser distributionen

Brug de kliniske data fra 303 patienter, blev vi i stand til at analysere præference for de kendte fælles metastatiske regioner for de patienter med NSCLC med KRAS og EGFR mutationsstatus. Pulmonal knuder

(p

= 0,01), vertebral (

s

= 0,03) og andre knoglemetastaser (

s

= 0,04) blev identificeret til at være signifikant associeret med EGFR-mutationer . Ingen association blev fundet mellem EGFR mutationer og pleural (

s

= 0,15), cerebral (

s

= 1,0), hepatisk (

s

= 0,46) eller adrenal (

s

= 0,37) metastatiske lokaliseringer. Ingen af ​​disse steder var forbundet med KRAS-mutationer.

Survival analyse

I univariat analyse fra de kliniske data, storcellet histologi (HR 1,8, 95% CI., 1,2-2,8,

s

. 0,01) og spinal knoglemetastaser (HR 1,5, 95% CI, 1,0-2,2,

s

= 0,05) var forbundet med en dårligere overlevelse, mens EGFR-mutation (HR 0,4, 95 .% CI, 0,2-0,7,

s

0,01) var forbundet med en bedre overlevelse. I en multivariat model, histologi (storcellet karcinom, HR 2,2, 95% CI, 1,4-3,4,

s

. 0,01)., Spinal knogle metastaser (HR 1,7, 95% CI, 1,2-2,6 ,

s

. 0,01), og mutationsstatus (EGFR mutation, HR 0,3, 95% CI, 0,1-0,6

s

0,01) var signifikant associeret med overlevelse. (Tabel 5).

Når du vælger patienter, som fik EGFR TKI behandling i den første eller anden linie, den mediane samlede overlevelse efter start af denne behandling ikke blev nået i patienter med EGFR-mutation (n = 14 ), 20 måneder (95% CI., 0-46, n = 14) for patienter med KRAS mutation, og 9 måneder (95% CI., 0-28, n = 31) for patienter med EGFR /KRAS WT. (Figur 2A og 2B).

Sjælden EGFR og KRAS mutationer og respons på behandling

Mutationer, der ikke tidligere er beskrevet i COSMIC DB er beskrevet i tabel 6. Behandling med en EGFR TKI hos patienter med disse sjældne EGFR mutationer resulterede ikke i klinisk fordel undtagen i en patient, som også havde en yderligere aktiverende EGFR mutation.

diskussion

EGFR er et celleoverfladeprotein som fører til aktivering af proliferation og invasion via forskellige signaltransduktionsveje [28]. KRAS er en downstream mål af EGFR. Aktiverende eller sensibiliserende mutationer forårsage en konstitutiv aktivering af tyrosinkinasedomænet af EGFR-proteinet, ved at destabilisere autoinhibiting konformation [29]. EGFR TKI såsom gefitinib har øget bindende evner for disse mutantproteiner. Forholdene mellem denne øgede bindende evne er op til 100 gange sammenlignet med vildtype-EGFR protein [29].

De to mest almindelige sensibiliserende EGFR mutationer til EGFR TKI, i ramme sletninger af exon 19 og L858R mutationen [19], [30], [31], [32], [33] udgjorde over halvdelen af ​​alle EGFR mutation patienter. Andre sensibiliserende afvigelser blev fundet i tre patienter, der har en G719X mutation og i en anden patient en L861R mutation [33], [34], [35]. Vi observerede 5 sjældne eller tidligere ubeskrevne mutationer (tabel 2) og har karakteriseret deres respons på TKI behandling (tabel 6). Af særlige note er p.D770GY mutation, som blev fundet i to patienter, med forskellig respons. Den første af disse patienter havde en kombination af p.D770GY og en p.G719C mutation mens den anden havde kun en p.D770GY mutation. Den første patient reagerede på EGFR TKI og forbliver sygdomsfri efter 15 måneder, mens patienten uden det sekundære mutation havde progressiv sygdom diagnosticeret på 4 uger. Tidligere 2 tilfælde af denne mutation blev beskrevet uden oplysninger om tumor respons [36], [37]. Vores data tyder på, at p.G770GY mutationen ikke giver fordele for EGFR TKI behandling. Desuden viste vi, at også patienter med en af ​​de andre 4 sjældne EGFR-mutationer (p.K708N, p.G709_T710 M, p.L833F og p.A840T) havde ingen gavn af EGFR-TKI

Lille. tumorprøver hovedsageligt fra bronkoskopisk eller transtorakal kerne biopsier kan være et problem for tilstrækkelig mutation test. Vi identificerede årsager til mutationsanalyse ved vores laboratorium ikke var muligt i 17% af patienterne. Det var enten på grund af utilstrækkelig antal tumorceller (12%) eller på grund af utilstrækkelig DNA kvalitet (4%) fremhæver behovet for passende tumorvæv valg for mutationsanalyse. Retrospektive studier, hvor lang tid arkiveret paraffinindlejret væv blev anvendt til bestemmelse EGFR status viste en lav andel af passende tumorvæv tilgængelig [1], [2], [3], [4], [5], [6]. En måde at få flere tumorceller er ved gentagne biopsier eller cryobiopsies [38]. Nye teknologiske udviklinger er langt mere følsomme end tidligere, hvilket giver færre tumorceller både kvalitativt (%) og kvantitativt (absolutte antal), der kræves til påvisning af mutationer. Men med hensyn til tumor heterogenitet, denne øgede sensitivitet rummer en øget risiko for stikprøvefejl og detektion af mindre kloner, der kan være mindre relevant for terapi. En undersøgelse viste, at omkring to tredjedele af alle somatiske mutationer syntes ikke at kunne påvises på tværs af alle tumor region [39].

EGFR mutationer forekom oftest i TTF-1 positiv adenocarcinom. To nylige undersøgelser viste denne cellelinie forening [40], [41]. Funktionelt, TTF-1-induceret ROR-1 er nødvendigt for at opretholde EGFR-signalvejen i lunge adenocarcinom cellelinier [42].

Vi identificerede præference for EGFR mutant tumorer at sprede sig til intrapulmonal og både hvirvlen og andre knogle lokaliseringer. Dette står i kontrast med en undersøgelse af Doebele et al, der kun observeret en præference for hepatisk metastatisk spredning i EGFR mutant tumorer [43] .I modsætning observerede vi den typiske miliær mønster af tumorer med EGFR exon 19 sletning som tidligere [44] beskrevet. Vores resultater for KRAS muterede tumorer (71 patienter) var som tidligere beskrevet af Doebele et al (49 patienter) [43].

I vores befolkning udfaldet af patienter med en KRAS mutation reagerede på samme måde som KRAS WT både med hensyn til kemoterapi og til EGFR TKI. Tidligere blev det påvist, at patienter med KRAS vildtype har et bedre resultat end patienter med KRAS-mutationer, når de behandles med en EGFR TKI [22]. Andre undersøgelser viste tilstedeværelsen af ​​KRAS-mutationer i lungekræft som indicier for dårligere resultat uanset hvilken behandling de modtog [45], [46]. I TITAN undersøgelse var der nogle beviser for en højere risiko for død i KRAS mutant tumor patienter behandlet med erlotinib sammenlignet med kemoterapi, men der var ingen forhøjet risiko for tumor progression [4]. I vores undersøgelse har vi ikke samle EGFR mutation positive patienter med EGFR /KRAS WT, når man sammenligner disse patienter med KRAS muterede patienter. Da patienter med EGFR-mutationer tendens til at have bedre resultater derefter EGFR WT patienter, dette kunne forklare vores resultater.

Som konklusion, vi fandt i 10,9% og 30% af alle de testede patienter en EGFR eller KRAS mutation, henholdsvis . Vi identificerede også 5 nye eller sjældne EGFR mutationer og 2 nye KRAS-mutationer i vores befolkning. Sytten procent af patienterne havde utilstrækkelig tumorvæv at udføre mutation analyse, hovedsagelig på grund af utilstrækkelig tumor volumen og /eller procent. Der var ingen forskel i den samlede overlevelse efter start EGFR-TKI hos patienter med KRAS mutation og EGFR /KRAS WT.

Støtte oplysninger

Appendiks S1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0070346.s001

(DOC)

Tak

Vi er taknemmelige for Klaas Kooistra, Erik Nijhuis, Anke van de Berg for deres bidrag til EGFR mutation analyse og til Roel Soesbeek for at hjælpe med indsamlingen af ​​data.