PLoS ONE: antitumoraktivitet Sorafenib i menneskelige kræftceller med erhvervet resistens over for EGFR og VEGFR tyrosinkinasehæmmere

Abstrakte

Behandling af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) og kolorektal cancer (CRC) har ændret væsentligt i de senere år med indførelsen af ​​epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) hæmmere i klinisk praksis. Forståelsen af ​​mekanismer, der regulerer celler følsomhed over for disse stoffer er nødvendig for deres optimale udnyttelse.

En in vitro-model af erhvervet resistens til to tyrosinkinasehæmmere (TKI) rettet mod EGFR, erlotinib og gefitinib, og i TKI målretning EGFR og VEGFR, Vandetanib, blev udviklet ved kontinuert behandling af det humane NSCLC cellelinie CALU-3 og den humane CRC HCT116 med stigende doser af hvert lægemiddel. MTT, western blot-analyse, migration, invasion og forankringsuafhængige kolonidannende assays blev udført in vitro og forsøg med etablerede xenotransplantater i athymiske nøgne mus blev udført in vivo i følsomme, vildtype (WT) og TKI-resistent CALU-3 og HCT116 cellelinier.

i forhold til WT CALU-3 og HCT116 humane cancerceller, viste TKI-resistente cellelinier en betydelig stigning i niveauet af aktiveret, phosphoryleret AKT, MAPK, og survivin. I betragtning af den rolle RAS og RAF downstream signaler af både EGFR og VEGFR veje behandlede vi resistente celler med sorafenib, en inhibitor af C-RAF, B-RAF, c-KIT, FLT-3, RET, VEGFR-2, VEGFR-3, og PDGFR-β. Sorafenib reduceret aktivering af MEK og MAPK og forårsagede en inhibering af celleproliferation, invasion, migration, forankringsuafhængig vækst in vitro og af tumorvækst in vivo af alle TKI-resistente Calu-3 og HCT116 cellelinier.

Disse data antyder, at resistens over for EGFR inhibitorer overvejende drives af RAS /RAF /MAPK-vejen og kan overvandt ved behandling med sorafenib

Henvisning:. Morgillo F, Martinelli E, Troiani T, Orditura M, de Vita F, Ciardiello F (2011) antitumoraktivitet Sorafenib i humane cancercellelinier med erhvervet resistens over for EGFR og VEGFR tyrosinkinaseinhibitorer. PLoS ONE 6 (12): e28841. doi: 10,1371 /journal.pone.0028841

Redaktør: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Italien

Modtaget: 25. maj 2011; Accepteret: November 16, 2011; Udgivet: 9. december 2011

Copyright: © 2011 Morgillo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), Milano, Italien. Floriana Morgillo er modtageren af ​​en European Society of Medical Oncology (ESMO) translationel forskning fællesskab. der finansierer havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) er en central regulator af kræft celledeling og progression i flere humane typer kræft. Den kliniske effekt af EGFR-hæmmere (cetuximab, panitumumab, erlotinib, gefitinib og Vandetanib) indført i den kliniske praksis til behandling af metastatisk kræft er begrænset til en undergruppe af patienter med størstedelen af ​​kræftpatienter viser enten iboende eller erhvervet resistens over for disse stoffer [1].

de seneste fremskridt inden for viden om kræft biologi og narkotika-resistensmekanismer har identificeret blandt de intracellulære signalveje, der fungerer som nedstrøms til EGFR, at AKT og RAS /RAF /mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) veje som ved store ansvarlig for udviklingen af ​​cancer celle modstand mod EGFR inhibitorer [2] -. [4]

Men vi for nylig vist, at det i vores in vitro ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) model af erhvervet resistens over for erlotinib og gefitinib, behandling med flere midler, der vides at målrette direkte eller indirekte AKT signalvejen, sådanne ad LY294002, deguelin og everolimus, var ikke effektive til inhibering erlotinib- (ERL-) og gefitinib – (GEF-) resistent kræft celledeling [5]

på den anden side, har mutationer af K-RAS-genet blevet beskrevet både i NSCLC og kolorektal cancer (CRC) patienter som har ansvaret for en dårlig prognose. og dårlig respons på EGFR inhibitorer [6]. Disse mutationer forårsager KRAS proteiner til at akkumulere i GTP-bundne, aktive form fører til konstitutiv, vækst-faktor-receptor uafhængig aktivering af KRAS nedstrøms signalering i tumorceller [7]. Udviklingen af ​​terapeutiske strategier for patienter med KRAS-mutationer er således et vigtigt klinisk mål. RAF serin-threonin-kinaser er de vigtigste effektorer af RAS i MAPK-signalvejen, og er derfor et potentielt mål for cancerterapi. Til dato den mest succesfulde kliniske inhibitor af RAF-aktivitet er sorafenib (Nexavar, BAY 43-9006) [8] – [10], en oralt tilgængelig multi-målrettet kinaseinhibitor, som blokerer aktiveringen af ​​C-RAF, B-RAF (både vild-type og den aktiverede V600E mutant), c-KIT, FLT-3, RET, vaskulær endotelvækstfaktor receptor 2 (VEGFR-2), VEGFR-3, og blodpladeafledte vækstfaktorreceptor β (PDGFR- β) [8] – [10], i dag godkendt til behandling af metastatisk renalcellecarcinom (RCC) og for avanceret hepatocellulært carcinom (HCC), og under efterforskning i andre maligniteter. Sorafenib påvirker tumorvækst med direkte inhibering af tumorcelleproliferation og fremme apoptose i en række forskellige tumortyper såvel som ved at inhibere tumorinduceret neoangiogenesis.

Vores laboratorium har for nylig fremlagt dokumentation for en synergistisk vekselvirkning mellem sorafenib og erlotinib eller mellem sorafenib og cetuximab, et monoklonalt antistof rettet mod det ekstracellulære domæne af EGF-receptoren, i et panel med NSCLC og kolorektal cancer (CRC) cellelinier,

in vitro

in vivo

, som er ledsaget af en markant og vedvarende inhibering af MAPK- og AKT-afhængig intracellulære signaler [11].

Vores hypotese, at behandling med sorafenib kunne overvinde den inducerede EGFR TKI-resistens ved dets evne til at blokere flere vækstfaktor receptor-drevne signaler. Desuden fordi sorafenib blokerer B-RAF, og det kunne være effektiv i kræft cellelinjer, der udtrykker aktivering K-RAS mutationer.

I den foreliggende undersøgelse rapporterer vi på udvikling og på karakterisering af humane NSCLC og CRC cellelinjer med erhvervet resistens til to tyrosinkinasehæmmere (TKI) rettet mod EGFR, erlotinib og gefitinib, og en TKI målrettet EGFR, VEGFR og RET, Vandetanib, og om de antitumor virkninger af sorafenib i disse resistente kræftceller.

Resultater

Udvikling og karakterisering af TKI-resistente Calu-3 og HCT116 kræftceller

den menneskelige NSCLC CALU-3 cellelinie og den humane CRC HCT116 cellelinie havnen vildtype EGFR gen og et aktiverende K-RAS (KRASp.G13D) genmutation. I modsætning til de andre K-RAS mutationer, har denne mutation blevet beskrevet som ikke påvirker følsomheden over for anti-EGFR behandling, navnlig cetuximab [11]. Disse cancercellelinier er tidligere blevet karakteriseret ved vores gruppe til ekspression af de fire EGF-relaterede vækstfaktorreceptorer (EGFR, ERBB2, ErbB3, og ErbB4) og tre VEGF-receptorer (VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3 ), samt til ekspression af tre EGFR-ligander (amphiregulin, EGF, og TGFa) og af tre VEGFR ligander (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C), ved anvendelse af kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) [12]. Alle testede ligand mRNA’er blev udtrykt i CALU-3 og HCT116 cellelinier. CALU-3 celler udtrykte også EGFR mRNA, hvorimod lave niveauer af ERBB2 og ErbB3 mRNA var målbare. VEGFR-2 og VEGFR-3-mRNA-ekspression blev detekteret i CALU-3 cellelinie. Ekspression af EGFR og dets specifikke ligander antyder, at en EGFR-drevet autokrine omsætningsvej i disse humane cancercellelinjer er relevant for cancer celleproliferation. Faktisk CALU-3 og HCT116 celler er vækst-inhiberet ved behandling med selektiv EGFR TKI’er, såsom gefitinib eller erlotinib [13]. Desuden er disse cancerceller udtrykker både VEGF ligander og VEGFRs og er vækst hæmmes ved behandling med anti-angiogene TKI’er [13].

Derfor Calu-3 og HCT116 celler blev udvalgt som en model for at udforske erhvervet resistens mekanismer til behandling med EGFR TKI’er erlotinib og gefitinib, eller med det dobbelte EGFR /VEGFR tyrosinkinaseinhibitoren Vandetanib.

gefitinib- (GEF-R), erlotinib- (ERL-R) og vadetanib- (VAN -R) resistente cellelinier blev opnået ved kontinuerlig dyrkning CALU-3 og HCT116-celler i nærvær af stigende doser af hvert lægemiddel i 12 måneder. Efter oprettelsen af ​​tre forskellige TKI-resistente CALU-3 og tre forskellige TKI-resistent CALU-3 HCT116 cellelinier, vi kendetegnet deres fænotype ved at gøre celleproliferationsassays i nærvær af hver af disse inhibitorer. Som illustreret i tabel 1, en ca. 10 ganges forøgelse i IC

50 for hver TKI-resistent cellelinje sammenlignet med parentale celler blev observeret. ERL-R, GEF-R og VAN-R CALU-3 og HCT116 humane cancercellelinjer var krydsresistente over for enten gefitinib, erlotinib eller Vandetanib behandling. Vi bekræftede næste etableringen af ​​stabile TKI-resistente CALU-3 og HCT116 kræftceller i et stoffrit dyrkningsmedium. I virkeligheden kunne alle seks TKI-resistente cellelinier vokse i fravær af hvert medikament i længere tid (tre til seks måneder) og opretholder deres TKI-fænotype (data ikke vist).

for yderligere at karakterisere de TKI-resistente CALU-3 og HCT116 cellelinier, undersøgte vi differentiel proteinekspression blandt vildtype, følsomme CALU-3 og HCT116-celler og deres TKI-resistente derivater.

Aktivering af EGFR leads til en kompleks intracellulær signalering, som omfatter aktivering af pro-overlevelse PI3K /AKT pathway og den mitogene RAS /RAF /MEK /MAPK-vejen [13], [14]. Vi har derfor undersøgt ved immunoblotting analyse disse molekylære veje. Som illustreret i figur 1, blev aktivering af EGFR EGF-stimuleret effektivt blokeret i WT og ERL-R, GEF-R og VAN-R-celler som påvist ved inhibering af EGFR auto-fosforylering (P-EGFR).

Western blotting-analyse af EGFR og nedstrøms signalveje i parentale humane CALU-3 og HCT116-celler (WT) og i deres TKI-resistente derivater (ERL-R, GEF-R, VAN-R). β-actin blev inkluderet som en belastning kontrol.

Da de aktiverede, phosphorylerede former af AKT og MAPK er vigtige intracellulære mediatorer af vækstfaktor-aktiveret celle overlevelse og spredning signaler [13], [14] undersøge aktiveringstilstanden af ​​disse molekylære veje kan være af interesse i at forstå resistensmekanismer. Aktivering af MAPK og AKT med en stigning i deres phosphorylerede former (P-MAPK og P-AKT) samt en stigning i survivin proteinniveauer blev observeret i alle tre TKI-resistente CALU-3-cellelinier og i alle tre TKI-resistente HCT116 cellelinier i forhold til deres parentale modstykke (figur 1).

taget sammen antyder disse resultater, at i denne kræftcelle model af erhvervet resistens til tre forskellige TKI’er, aktivering af AKT- og MAPK-drevet intracellulære signaler kan være ansvarlig for cancercellevækst i nærvær af enten selektiv anti-EGFR TKI’er, såsom gefitinib eller erlotinib, eller i nærvær af bredspektrede TKI, såsom Vandetanib.

Virkninger af sorafenib på TKI-resistente CALU-3 og HCT116 cancercellevækst

i lyset af den rolle, RAS og RAF downstream mediatorer af både EGFR og VEGFR signaler fra celleoverfladen, testede vi antiproliferativ virkning af sorafenib, et multi- målrettet kinaseinhibitor, blokerer aktiveringen af ​​C-RAF, B-RAF, c-KIT, FLT-3, RET, VEGFR-2, VEGFR-3, og PDGFR-β [8] på den parentale WT og TKI-resistente CALU -3 og HCT116 kræftceller. En væsentlig inhibering af cellevækst blev observeret i både WT CALU-3-celler og WT HCT116 celler og deres tilsvarende tre TKI-resistente derivater efter sorafenib behandling, med en IC

50 i området fra 0. 1 til 0,5uM, (figur 2 ) .Vi yderligere karakteriseret effekten af ​​sorafenib behandling på intracellulær signalering ved Western blotting. Som illustreret i figur 3, har behandling af ERL-R, GEF-R og VAN-R CALU-3 og HCT116 celler med sorafenib i 48 timer ikke påvirke de samlede MEK og MAPK proteinniveauer, mens den forårsagede et markant fald af den phosphorylerede, aktiverede former af MEK (P-MEK) og af MAPK (P-MAPK). Desuden undersøgte vi aktiveringen status for alle molekylære mål af sorafenib ved studere protein ekspressionsniveauer af C-RAF, B-RAF, c-Kit, FLT-3, RET, VEGFR-2, VEGFR-3 og PDGFRβ, og deres phosphoryation status ved western blotting-analyse. Blandt alle de mål af sorafenib aktivitet, resulterede kun C-RAF og B-RAF aktiveres resistente Calu-3 og HCT116 cancercellelinier, og derfor stærkt inhiberet af sorafenib behandling (figur 3).

MTT celleproliferation analyser blev udført i forældrenes lungeadenokarcinom CALU-3 og kolorektal cancer HCT116 celler. (WT) og i deres TKI-resistente derivater (ERL-R, GEF-R, VAN-R), behandlet i tre dage med de angivne koncentrationer af sorafenib. Resultaterne repræsenterer gennemsnittet (± SD) af tre separate forsøg, hver udført i fire eksemplarer.

Western blotting-analyse af C-RAF, B-RAF, MEK og MAPK-aktivering efter behandling med den angivne koncentration af sorafenib af lunge adenocarcinom CALU-3 og kolorektal cancer HCT116 celler TKI-resistente derivater (ERL-R, GEF-R, VAN-R). β-actin blev inkluderet som en belastning kontrol.

Virkninger af sorafenib behandling på invasionen, migration og forankringsuafhængig vækst af TKI-resistente Calu-3 og HCT116 kræftceller

det er blevet foreslået, at cancerceller gennemgår resistente over for anti-EGFR lægemidler kunne opnå en mere aggressiv og metastatisk fænotype med øget evne til at invadere, migrere og danne kolonier i halvfast medium [15]. Derfor har vi vurderet disse egenskaber i TKI-følsomme WT CALU-3 og HCT116 kræftceller og i deres TKI-resistente derivater. Som illustreret i figur 4, WT CALU-3 og HCT116-celler demonstrerede ringe eller ingen evne i invasion og migration. Tværtimod alle TKI-resistent CALU-3 og HCT116 cellelinjer udviste betydelige invasive og vandrende evner. Desuden har deres forankringsuafhængig kolonivækst forøget af ca. 3 gange i sammenligning med WT-celler (figur 4). Kollektivt antyder disse resultater, at cancercellelinier med erhvervet resistens over for erlotinib, har gefitinib og Vandetanib erhvervet en mere invasive og potentielt mere metastatiske adfærd.

forankringsuafhængig vækst (A), migration (B) og invasion (C), blev evalueret i TKI-resistent CALU-3 og HCT116-derivater (ERL-R, GEF-R, VAN-R) efter behandling med de angivne koncentrationer af sorafenib. Resultaterne er gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg, hver udført in triplo. Repræsentative billeder er vist for migrationen og invasion evner CALU-3 WT og resistente cellelinier.

Vi næste evaluerede effekten af ​​sorafenib på de invasive og vandrende kapaciteter af TKI-resistente CALU-3 og HCT116 cellelinier. Vi har ikke testet effekten af ​​sorafenib behandling på TKI-følsom WT kræft cellelinjer i betragtning af fraværet af vandrende og invasive evne. En væsentlig dosisafhængig inhibering af invasion og migration blev observeret i alle TKI-resistente cellelinier efter behandling med sorafenib (figur 4).

Virkninger af sorafenib på TKI-resistent CALU-3 og HCT116 tumorxenoplantater

Vi endelig undersøgt in vivo antitumoraktiviteten af ​​sorafenib i nøgne mus med WT CALU-3 og HCT116 eller TKI-resistent CALU-3 og HCT116 cellelinier, der blev dyrket subkutant som xenotransplantater. I WT CALU-3 og HCT116 tumorxenoplantater, behandling med sorafenib forårsagede et signifikant fald i tumorstørrelse sammenlignet med kontroldyr ubehandlede mus. For eksempel, på dag 35 fra start af behandling var de gennemsnitlige tumorvolumen i mus med WT tumorxenoplantater og behandlet med sorafenib henholdsvis 38% og 31% i CALU-3 og HCT116 sammenlignet med kontroldyr ubehandlede mus (figur 5, 6 ). Også i mus med ERL-R, GEF-R eller VAN-R CALU-3 og HCT116 tumorxenoplantater, behandling med sorafenib inducerede en signifikant reduktion i tumorvækst (figur 5, 6). I den forbindelse på dag 35 fra start af behandling var de gennemsnitlige tumorvolumener hos de sorafenib-behandlede mus var på mellem 27% og 40%, sammenlignet med kontroldyr ubehandlede mus.

A, Parental (WT) CALU-3 cancerceller; B, GEF-R CALU-3 cancerceller; C, VAN-R CALU-3cancer celler; D, ERL-R CALU-3 cancerceller. Athymiske nøgne mus blev injiceret subkutant i den dorsale flanke med 10

7 cancerceller. Efter 7 til 10 dage (gennemsnitlig tumorstørrelse, 75 mm

3), mus blev behandlet som angivet i Materialer og Metoder til 5 uger. Hver behandlingsgruppe bestod af 8 mus. Data viser gennemsnittet (± SD). Studerendes

t

test blev anvendt til at sammenligne tumor størrelser blandt forskellige behandlingsgrupper på dag 35 efter behandlingens start. A, CALU-3 WT: sorafenib versus kontrol (tosidet p 0,001); B, CALU-3 GEF-R: sorafenib versus kontrol (tosidet p 0,001). C, CALU-3 VAN-R: sorafenib versus kontrol (tosidet p 0,001); D, CALU-3 ERL-R:. Sorafenib versus kontrol (tosidet p 0,001)

A, Forældrekontrol (WT) HCT116 kræftceller; B, GEF-R HCT116 cancerceller; C, VAN-R HCT116 cancerceller; D, HCT116 kræftceller. Athymiske nøgne mus blev injiceret subkutant i den dorsale flanke med 10

7 cancerceller. Efter 7 til 10 dage (gennemsnitlig tumorstørrelse, 75 mm

3), mus blev behandlet som angivet i Materialer og Metoder til 5 uger. Hver behandlingsgruppe bestod af 8 mus. Data viser gennemsnittet (± SD). Studerendes

t

test blev anvendt til at sammenligne tumor størrelser blandt forskellige behandlingsgrupper på dag 35 efter behandlingens start. A, HCT116 WT: sorafenib versus kontrol (tosidet p 0,001); B, HCT116: sorafenib forhold til kontrol (tosidet p 0,001). C, HCT116 VAN-R: sorafenib versus kontrol (tosidet p 0,001); D, HCT116 ERL-R:. Sorafenib versus kontrol (tosidet p 0,001)

Diskussion

Aktivering af EGFR og VEGFR veje spiller en central rolle i udviklingen og progression af flertallet af epiteliale cancere, herunder NSCLC og CRC. Det er dog kun en undergruppe af patienter fordele ved behandlinger med lægemidler rettet mod EGFR eller VEGFR veje [16]. Selv i oprindelig responderende patienter sekundær eller erhvervet resistens opstår forårsage kræft progression og behandlingssvigt. Adskillige molekylære mekanismer er blevet foreslået til at forklare erhvervelsen af ​​kræftcellen modstand mod molekylært målrettede kræftmedicin [16].

Kræft celle modstand mod EGFR-antagonister kan skyldes flere årsager. Host relaterede mekanismer, såsom defekte immunsystemet aktivitet, hurtig metabolisme eller dårlig absorption, er ansvarlige for iboende eller primær resistens. Desuden genetisk ustabilitet af disse celler genererer kræft celle kloner med en erhvervet resistens efter langvarig udsættelse for EGFR-hæmmere. Da EGFR antagonister interfererer med aktivering af flere intracellulære signalveje, der kontrollerer celleproliferation, overlevelse, apoptose, metastatisk kapacitet, invasion og tumor-induceret angiogenese, er det klart, at flere forskellige molekylære ændringer kunne være ansvarlig for udvikling af resistens over for disse inhibitorer [ ,,,0],16].

i den foreliggende undersøgelse fandt vi, at cancerceller, der udvikler resistens over for EGFR tyrosinkinaseinhibitorer efter lang tid behandling (erhvervet resistens) udviser aktiveret RAS /RAF /MAPK og AKT pathways. EGFR-uafhængig aktivering af disse nedstrøms veje gør kræftceller ufølsomme til EGFR hæmning og repræsenterer en af ​​de mest almindelige rapporterede årsager til modstand mod EGFR-målrettet terapi i solide tumorer.

Den konstitutive aktivitet af mindst ét af disse to veje er blevet påvist at være i stand til at definerer en resistent fænotype upåvirket af behandling med gefitinib og cetuximab [2], [17].

Vedvarende phosphorylering af RAS /RAF /MAPK og /eller AKT pathways kan forklares med aktiveringen af ​​andre end EGFR celleoverfladereceptorer, såsom insulin-lignende vækstfaktor-1-receptor (IGF-1R) og MET [18] – [21], som vides at være iperexpressed eller aktiveret i nærvær af vedvarende hæmning af EGFR.

Desuden en øget receptor-uafhængige aktivitet af RAS /RAF /MAPK og /eller AKT veje kunne skyldes direkte genamplifikation, aktivering /inaktivering af mutationer eller tab af molekylær regulator [ ,,,0],22], [23].

Men mens inhibering af AKT-vejen ikke forstyrrer spredningen af ​​resistente celler, inhibering af RAF /MEK /MAPK-vejen ved sorafenib behandling reducerer kraftigt cellevækst og overlevelse . Faktisk blandt alle de molekylære mål for sorafenib, kun C-RAF og B-RAF resulterede aktiveres i resistente cellelinier sandsynligvis ved opstrøms receptorer endnu ikke afprøvet i dette arbejde; men disse oplysninger tyder på, at aktiveringen af ​​RAF-afhængige intracellulære signaler kan være en vigtig mekanisme i købet af resistens over for anti-EGFR-behandling.

RAS /RAF /MAPK signalvejen er en lovende terapeutisk target givet sin central rolle i reguleringen af ​​mammal celleproliferation, genudlægning ekstracellulære signaler fra ligandbundne receptortyrosinkinaser på celleoverfladen til kernen via en kaskade af specifikke phosphoryleringsbegivenheder. Den mutations status RAS og B-RAF-gener er blevet påvist at påvirke følsomheden af ​​tumorcellelinier til inhibitorer af EGFR [24]. Imidlertid har terapeutisk målretning af Ras-vejen hidtil været forgæves. RAF serin-threonin-kinaser er de vigtigste effektorer af RAS og betragtes som et vigtigt mål for cancerterapi. Agenter som sorafenib der omgår RAS og hæmmer effektormolekyler nedstrøms for mutant GTPase (fx RAF) er ved at blive evalueret. Prækliniske data har antydet, at sorafenib hæmmer cellevækst ved at inducere G1 anholdelse i NSCLC cellelinjer uafhængig af KRAS genotype [8].

En anden mulig mekanisme af resistens over for EGFR-hæmning kan være en øget angiogene potentiale gennem øget endothelceller spredning og permeabilisering. På grundlag af denne informationer, har flere prækliniske studier blevet realiseret med den hensigt at opdage effekten af ​​en kombineret målretning af den erbB og VEGF veje ved at bruge forskellige tilgange [25] – [29]. Ud over muligheden for at anvende anti-EGFR terapier i kombination med anti-VEGF lægemidler, blev en række tyrosinkinaser som blokerer både EGFR og VEGF-receptoren TK udviklet, såsom Vandetanib, som har vist betydelig aktivitet som enkeltstof og i kombination med traditionelle kemoterapeutika i flere humane tumortyper [27] – [29]

Ofte EGFR-inhibitor-resistente humane cancercellelinjer exhibit, som fælles træk, VEGFR overekspression, øget sekretion af VEGF og placental vækst. faktor, og augmented migration kapaciteter. Sorafenib inhiberer flere RTK’er, der deltager i neovaskularisering, herunder vaskulær endotelvækstfaktor receptor (VEGFR) -2 og VEGFR-3 [30]. Inhibition af angiogenese kan således forventes at bidrage til hæmning af tumorvækst ved dette stof ud over dens virkninger på RAF signalering. Selvom sorafenib tidligere blev vist at inhibere væksten af ​​en række humane tumor xenografter i mus [8], har det været vanskeligt at måle de relative bidrag af sin antiangiogenisk aktivitet og dens direkte antitumorvirkning medieres af RAF-inhibering. Desuden i vores arbejde, udvikling af menneskelige kræftceller resistente over for Vandetanib, udelukkede den mulighed, at sorafenib’efficacy kan afhænge af hæmning af VEGFR.

Bevis for en positiv vekselvirkning mellem sorafenib og anti-EGFR narkotika er for nylig blevet leveret af vores gruppe [12]. Prækliniske beviser støttede en stærk anti-proliferative og anti-vandrende effekter i NSCLC og CRC kræft cellelinjer efter kombination med sorafenib plus ant-EGFR lægemidler [12]. Desuden støttede en klinisk nylig fase II studie kombinationen af ​​erlotinib og sorafenib hos ældre patienter med fremskreden NSCLC i lyset af den højere 1-års overlevelse [30].

I den foreliggende undersøgelse, har vi givet beviser at sorafenib er aktiv i at hæmme væksten af ​​tumorceller

in vitro

in vivo

af humane kræftceller resistente over hæmmer af EGFR og /eller VEGFR. Aktiviteten af ​​sorafenib er strengt knyttet til dens evne til at blokere RAF signalering gennem RAS /RAF /MEK /MAPK-vejen.

Metoder

cellelinjer, medicin og kemikalier

det humane NSCLC CALU-3 og de humane CRC HCT116 cellelinjer blev tilvejebragt af American Type Culture Collection (Manassas, VA) og opretholdt i RPMI 1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; Life Technologies, Gaithersburg, MD) i en fugtig atmosfære med 5% CO

2. Gefitinib og Vandetanib blev leveret af AstraZeneca, Macclesfield, UK; erlotinib blev leveret af Roche, Basel, Schweiz; sorafenib blev leveret af Bayer Schering Pharma, Leverkusen, Tyskland. Primære antistoffer mod P-EGFR (Tyr1173), EGFR, P-MAPK44 /42 (Thr202 /Tyr204), MAPK44 /42, P-AKT (Ser473), AKT, P-MEK (Ser217 /221), MEK, PB-RAF (Ser 445), P- C-RAF (Ser 338), survivin blev opnået fra Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA. Celleinvasion og migration assaykits blev opnået ved Chemicon, Millipore, CA, USA. Alle andre kemikalier blev købt fra Sigma Aldrich, MO, USA.

Etablering af CALU-3 og HCT116 cancer cellelinjer med erhvervet resistens over for forskellige TKI’er

Over en periode på 12 måneder, menneskelig CALU -3 lungeadenocarcinom celler og humane HCT116 colorektale carcinomaceller blev kontinuerligt udsættes for stigende koncentrationer af enten gefitinib, erlotinib eller Vandetanib, som tidligere beskrevet (12). Startdosis var den dosis, der forårsager hæmning af 50% af kræft cellevækst (IC

50) for hver EGFR inhibitor (dvs. .: erlotinib, 3 pM, gefitinib, 6 uM, Vandetanib, 1 uM). Dosis lægemiddel blev gradvist øget til 15 uM i cirka to måneder, til 20 pM efter to andre måneder, til 25 pM efter yderligere to måneder, og endelig til 30 uM i alt 12 måneder. De etablerede resistent cancer cellelinjer blev derefter opretholdt i kontinuerlig kultur med den maksimalt opnåede dosis af hver TKI der tillod celleproliferation (30 uM for hvert lægemiddel).

Cell proliferation assay

Kræftceller var podet i plader med 96 brønde og blev behandlet med forskellige lægemidler, såsom erlotinib, gefitinib, Vandetanib eller sorafenib i 72 timer. Celleproliferation blev målt med 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay. IC

50 blev bestemt ved interpolation fra dosis-respons-kurver. Resultater repræsenterer medianen af ​​tre separate forsøg hver udført i fire eksemplarer.

Western blotting-analyse

Efter behandling blev cancerceller lyseret med Tween-20 lysisbuffer (50 mmol /l HEPES, pH 7,4 , 150 mmol /l NaCl, 0,1% Tween-20, 10% glycerol, 2,5 mmol /L EGTA, 1 mmol /l EDTA, 1 mmol /l DTT, 1 mmol /l phenylmethylsulfonylfluorid og 10 ug /ml leupeptin og aprotinin ) og sonikeret. Lige store mængder protein blev analyseret ved SDS-PAGE. Derefter blev proteiner overført til nitrocellulosemembraner og analyseres ved specifikke primære antistoffer, som angivet i eksperimentet. Proteiner blev påvist via inkubation med peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer og ECL kemiluminescens påvisningssystem.

Invasion assay

invasive evne in vitro blev målt ved anvendelse transwell kamre, ifølge fabrikantens protokol. Kort beskrevet blev celler podet på membranen af ​​det øvre kammer i Transwell ved en koncentration på 2 × 10

5 /ml i 500 pi RPMI-medium og blev efterladt ubehandlet eller behandlet med de angivne doser af sorafenib i 24 timer. Mediet i det øvre kammer var serumfrit. Mediet ved det nedre kammer indeholdt 10% FBS som kilde til kemo-tiltrækningsmidler. Celler, som passerede gennem Matrigel coatede membran blev farvet med Cell farveopløsning indeholdende krystalviolet leveres i transwell invasion assay (Chemicon, Millipore, CA) og fotograferet efter 20 timers inkubation. Absorbans blev målt ved 562 nm med en ELISA-læser efter opløsning af farvede celler i 10% eddikesyre. Analyser blev udført i tre eksemplarer.

Migration assay

Cell migration blev vurderet ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kemotaksiassay. Kort fortalt blev celler inkuberet i RPMI serum-frit medium i 24 hånd blev efterladt ubehandlet eller behandlet med de angivne doser af sorafenib, hvorefter de blev frigjort fra kolber, suspenderet i quenching medium (serumfrit medium indeholdende 5% bovint serumalbumin) og EDTA, og podes i Boyden migration chamber indsatse placeret i en 24-brønds plade. Indsatsene indeholder en mikroporøs membran med en 8-um porestørrelse. Insertioner blev placeret over brønde indeholdende serumfrit medium plus kemo-tiltrækningsstof (10% FBS). Efter en behandlingsperiode på 48 timer blev celler /medier kasseret fra oversiden af ​​migrationskammeret indsatsen og kammeret blev anbragt i brøndene på en ny 24-brønds plade indeholdende Cellefrigørelse opløsning. Efter inkubering i 30 minutter ved 37 ° C blev insertet kasseres, og en opløsning af lyseringsbuffer og CyQuant GR farvestof blev tilsat til hver brønd. CyQuant er et grønt fluorescerende farvestof, der udviser stærk forøgelse af fluorescens ved binding til cellulære nukleinsyrer frigivet af lyseringspuffer, muliggør vurdering af det relative antal af migrerede celler. Fluorescens blev bestemt med et fluorimeter ved 480/520 nm. Analyser blev udført tre gange.

Vækst i blød agar

Celler (10

4 celler /brønd) blev suspenderet i 0,5 ml 0,3% Difco Noble agar (Difco, Detroit, MI) suppleret med komplet dyrkningsmedium. Denne suspension blev lagt over 0,5 ml 0,8% agar-medium basislag i 24 multibrønd klynge retter (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) og behandles med forskellige koncentrationer af sorafenib. Efter 14 dage blev cellerne farvet med nitro blue tetrazolium (Sigma, St. Louis, MO), og kolonier større end 0,05 mm, blev talt.