PLoS ONE: simultane hæmning af EGFR /VEGFR og cyclooxygenase-2 Mål Stemness-relaterede veje i Colorectal Cancer Cells

Abstrakt

På trods af de påviste fordele ved anti-EGFR /VEGF målrettede behandlinger i metastatisk kolorektal cancer (mCRC), mange patienter i begyndelsen reagere, men viser derefter tegn på sygdomsprogression. Nye terapeutiske strategier er nødvendige for at gøre virkningen af ​​tilgængelige lægemidler mere effektiv. Vores undersøgelse har til formål at undersøge, om samtidige målretning af EGFR /VEGF og cyclooxygenase-2 (COX-2) kan støtte behandling og forvaltning af FRK patienter. Den dobbelte tyrosinkinaseinhibitoren AEE788 og celecoxib blev anvendt til at inhibere EGFR /VEGFR og COX-2, henholdsvis i kolorektale cancerceller. COX-2-inhibering med celecoxib augmented antitumormakrofagaktivatoren og antiangiogenisk virkning af AEE788, som indikeret ved inhibering af celleproliferation, induktion af apoptose og G1 cellecyklusstandsning, nedregulering af VEGF-produktion af cancerceller og reduktion af cellemigrering. Disse effekter var relateret med en blokade i EGFR /VEGFR signalering akse. Især den kombinerede AEE788 /celecoxib behandling forhindret β-catenin cellekerneakkumulering i tumorceller. Denne virkning blev associeret med en signifikant nedregulering af FOXM1 proteinniveauer og en forringelse i samspillet af denne transkriptionsfaktor med β-catenin, der er nødvendig for dens kernelokalisering. Desuden den kombinerede behandling reducerede også udtryk for stamcelle markører oktober 3/4, Nanog, Sox-2 og Snail i kræftceller, og bidrog til formindskelse af CSC subpopulationen, som angivet af colonosphere dannelse analyser. Afslutningsvis den kombinerede behandling af AEE788 og celecoxib ikke kun vist bedre antitumoral effekt i kolorektal kræftceller, men også reduceret kolon CSCS delpopulation ved at målrette stemness-relaterede veje. Derfor kan samtidig målretning af EGFR /VEGF og COX-2 støtte i at blokere mCRC progression og forbedre effektiviteten af ​​eksisterende behandlinger i kolorektal cancer

Henvisning:. Valverde A, Peñarando J, Cañas A, López-Sánchez LM, Conde F, Hernández V, et al. (2015) simultane hæmning af EGFR /VEGFR og cyclooxygenase-2 Mål Stemness-relaterede Pathways i Colorectal Cancer Cells. PLoS ONE 10 (6): e0131363. doi: 10,1371 /journal.pone.0131363

Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: 15. december, 2014 Accepteret: 1 jun 2015; Udgivet: 24 JUN 2015

Copyright: © 2015 Valverde et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. EA blev støttet af Instituto de Salud Carlos III (RD12 /0036/0038) (www.isciii.es) Spanish Cancer Network (RTICC),. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de mest almindeligt diagnosticeret kræft og årsag til kræft dødelighed i udviklede lande [1]. I Europa CRC er den tredje mest almindelige kræftform og efter lungekræft det var den næsthyppigste dødsårsag i 2012, med næsten 215.000 dødsfald [2]. Selvom dødeligheden fra CRC er faldet en smule i løbet af de sidste to årtier, og på trods af fremskridt i påvisning og kirurgisk behandling, er metastaserende CRC (mCRC) forbundet med en dårlig prognose, med 5-års overlevelsesraten i størrelsesordenen 5% til 8%. Målretning epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) har vist sig at være en effektiv terapi i CRC. Især har behandling med monoklonale antistoffer (Cetuximabs eller panitumumab) mod det ekstracellulære domæne af receptoren blevet vigtige terapeutiske strategier til behandling af mCRC. Men svarene på EGFR-målrettede antistoffer er relativt lave, med forbedringer i overlevelsen normalt kun varer flere måneder, og effekten er begrænset til visse patientgrupper undertyper [3]. Faktisk CRC patienter defineret som “firdobbelt negative”, med tumorer mangler mutationer i EGFR nedstrømseffektorer KRAS, BRAF, PIK3CA, og PTEN, har den højeste sandsynlighed for respons på anti-EGFR terapier [4]. På den anden side, forskellige strategier rettet mod blokering vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) og dets receptorer er blevet udviklet til at inhibere angiogenese i CRC patienter [5,6]. Trods de demonstrerede fordelene ved disse antiangiogene terapier i forvaltningen af ​​CRC, vil mange patienter med fremskreden sygdom indledningsvis svare anti-VEGF-behandling, men viser derefter tegn på sygdomsprogression, hvilket tyder resistens over for terapien [7]. Derfor er der et klart behov for en bedre karakterisering af de involverede i ineffektivitet af anti-EGFR processer /VEGF målrettede behandlingsformer og finde nye terapeutiske strategier for at gøre virkningen af ​​tilgængelige lægemidler mere effektiv.

I det sidste tiår er det blevet vist, at i tumorer er en population af celler, der almindeligvis omtales som cancer stamceller (CSCS), med evne til at proliferere og frembringe resten af ​​tumormassen [8,9]. Evnen til at selv-fornyelse af CSCS tillader homeostase og vedligeholdelse af tumor, på samme måde som stamceller gør i normale væv. CSCS er meget mere modstandsdygtige end differentierede tumorceller til terapier anvendt klinikken [8]. Det er således blevet vist, at risikoen for colorectal cancer tilbagefald er proportional med ekspression i den primære tumor af en række specifikke og intestinale stamceller gener, også identificere en celle population med CSC egenskaber i tumoren [10]. Vigtigere, de seneste undersøgelser har vist, at CSCS er involveret i de mekanismer, der tumorer unddrager både anti-EGFR og anti-VEGF målrettede behandlinger [11,12]

Celecoxib er en selektiv cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibitor, der anvendes til at forebygge polypdannelse i familiær adenomatøs polypose (FAP) patienter, en population med høj risiko for kolorektal cancerudvikling [13]. undersøgelser tyder dog, at celecoxib kan have effektive anti-tumor og anti-metastatiske egenskaber mod sent tidspunkt CRC. Dermed effektiviteten af ​​en antiangiogenisk tyrosinkinaseinhibitoren (axitinib) er blevet vist, skal øges betydeligt, når det kombineres med celecoxib i en præklinisk model af CRC [14]. Desuden er en opbygning af flere kinaseinhibitorer, har gjort det muligt samtidig inhibering af EGFR og VEGF veje. Dette er tilfældet med AEE788, en oral inhibitor med kraftig aktivitet mod multiple tyrosinkinaser herunder EGFR, og VEGFR [15], som er blevet vist at udøve antitumor virkninger i forskellige humane kræftmodeller [16-18]. Derfor kan den samtidige målretning af EGFR /VEGF og COX-2 også støtte i blokerende mCRC progression. Nærværende undersøgelse viser, at kombinationen af ​​AEE788 med det specifikke COX-2-hæmmer celecoxib ikke kun vist bedre antitumoral effekt i kolorektal cancer celler, men også reduceret kolon CSCS delpopulation ved at målrette stemness-relaterede veje.

Materiale og metoder

Cellekultur

Caco-2-celler (ECACC, Salisbury, UK) blev dyrket i MEM med Earles salte (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Østrig) indeholdende 15% føtalt bovint serum. HCT-116-celler (DSMZ, Braunschweig, Tyskland) blev dyrket i McCoys 5A-medium (Biowest, Nuaille, Frankrig) indeholdende 10% føtalt bovint serum (PAA Laboratories). HCT-116-celler huser en aktiverende mutation i KRAS (G13D), mens Caco-2 celler er KRAS vildtype. Dyrkningsmedier blev suppleret med 2 mM glutamin, 1% ikke-essentielle aminosyrer, penicillin (100 U /ml), streptomycin (100 ug /ml) og amphotericin B (2,5 ug /ml). Celler blev holdt i en fugtig atmosfære ved 37 ° C og 5% CO2. Efter kulturer blev 80% sammenflydende (normalt efter 3 dage), blev cellerne trypsinbehandlet, centrifugeret og suspenderet i frisk medium. Alle celler, der anvendes til forsøg vises 95% levedygtighed og blev podet i plader med 96 brønde, 6-brønds dyrkningsplader, 60 mm dyrkningsplader eller ultralav-montagepladerne (Corning Inc, Lowell, MA, USA). Alle eksperimenter blev udført in duplo og gentaget mindst tre gange.

Reagenser

AEE788 (Novartis Pharma AG, Basel, Schweiz), NS-398 og celecoxib (Sigma-Aldrich, Madrid, Spanien) blev opløst i DMSO til frembringelse stock koncentrationer på 10 mM, 10 mM og 20 mM og opbevaret ved -20 ° C. Arbejdsopløsninger blev fremstillet ved fortynding optøede bestande i celledyrkningsmediet. Koncentrationen af ​​DMSO i den endelige fortynding ikke overstige 0,1% v /v. Human EGF blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) og opløst i glycerol til at producere stock koncentrationer på 10% v /v. Human rekombinant VEGF blev indkøbt fra Sigma-Aldrich og opløst i vand til fremstilling stamkoncentrationer på 10 ug /ml. Til Western blot-analyse blev de følgende antistoffer anvendes: phospho-EGF-receptor (Tyr1068) kanin pAb, phospho-VEGF receptor 2 (Tyr1175) (19A10) kanin mAb, VEGF receptor 2 (55B11) kanin mAb, phospho-p44 /42 MAPK (Erk 1/2) (Thr202 /Tyr204) (D13.14E) kanin mAb, phospho-Akt (Thr308) (C31E5E) kanin mAb, phospho-Akt (Ser473) (587F11) muse-mAb, Akt kanin pAb og β-Catenin kanin pAb blev indkøbt fra cellesignalering Technologies (Danvers, MA, USA). EGFR muse-mAb (0.N.268), actin (C-2) muse-mAb, gede-anti-kanin, ged anti-mus, æsel-anti-gede-sekundære antistoffer, og FOXM1 (K-19): sc-500 blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology. MAP kinase ERK1 /ERK2 kanin pAb var fra Calbiochem-EMD Millipore (Billerica, MA, USA), COX-2-mus mAb (klon CX229) var fra Cayman Chemical (Ann Arbor, Michigan, USA) og EP-Cam muse-mAb var fra Chemicon International (Billerica, MA, USA). Propidiumiodid blev opnået fra Sigma-Aldrich og blev fremstillet ved at opløse 1 mg i 1 ml phosphatbufret saltvand. Denne opløsning blev beskyttet mod lys og lagret ved 4 ° C. RNase, DNase-fri blev opnået fra Roche Applied Science (Indianapolis, IN, USA). Omgående koncentrationer på 500 pg /ml RNase blev fremstillet og holdt at- 20 ° C.

Cellulær proliferation assay

Celleproliferation og levedygtighed blev vurderet ved anvendelse af et XTT kolorimetrisk assay (Roche Applied Science). Celler blev podet på plader med 96 brønde ved en densitet på 4.000 celler /brønd og lad at binde i 24 timer. Cellerne blev derefter behandlet med AEE788 (0-20 uM) som et enkelt middel eller i kombination med celecoxib (10 uM) i nærvær eller fravær af EGF (100 ng /ml). Controls celler blev behandlet med den samme koncentration af DMSO-vehikel. Efter behandling ved angivne tidspunkter og doser blev XTT-analysen udføres efter den protokol, der leveres af producenten ved hjælp af en mikroplade absorbans reader.

Colonosphere dannelse assay

For colonosphere dannelse analysen, efter behandlinger celler blev tripsinized, talt og re-podet ved klontæthed (1 celle /pl) i 96-brønds plade med ultralav fastgørelsesflade (Costar, Corning, NY, USA) med serumfrit Dulbeccos MEM Nutrient Mixture F + 12 Ham medium suppleret med B27 (1:50; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 10 ng /ml basisk fibroblastvækstfaktor (PeproTech, London, UK)), 20 ng /ml EGF (Santa Cruz Biotechnology) og 1% v /v methylcellulose (R BD, Franklin Lakes, NJ, USA)

Angiogenese assay

Angiogenese blev målt som evne af endotelceller til dannelse af tredimensionale strukturer i matrigel basalmembranmatrix (BD Biosciences)

in vitro

. For angiogenese assay HUVEC’er celler (CC-2519 Lonza Sales AG, Basel, Schweiz) blev dyrket på toppen af ​​matrigel ved en densitet på 20.000 celler /brønd i Caco-2-konditionerede medier efter forskellige behandlinger. Caco-2-condition medier efter forskellige behandlinger blev koncentreret i Amicon Ultra-0,5 centrifugalfilter Devices (EMD Millipore) med mulighed for at opnå høje koncentration faktorer og fjerne medicinrester. Som kontrol HUVEC’er celler blev dyrket i EBM-medium (Lonza Walkersville, MD USA) i nærvær eller fravær af VEGF (10 ug /ml). HUVEC’er blev inkuberet i 24 timer ved 37 ° C i 5% CO

2 atmosfære og efter farvning med fluorescens farvestof Calcein AM (Cell Biolabs, Inc) blev røret dannelse undersøgt og fotograferet under anvendelse af et fluorescensmikroskop. Omfanget af rør dannelse (gennemsnitlig rørlængde og afdelingskontorer point) blev kvantificeret gennem imaging software (Image J software).

Antistof arrays

specifikt antistof arrays blev anvendt til at bestemme ekspression af intracellulær receptor (RTK) -relaterede signalveje og ekspressionen af ​​pluripotens-relaterede proteiner i hel-celle ekstrakter efter protokollerne leveret af producenterne. Kort fortalt, blev cellulære ekstrakter fortyndet og inkuberet natten over ved 4 ° C med PathScan RTK Signaling Antibody Array Kit Cell Signaling Technology) eller Proteome Profiler Humant Pluripotente Stamcelle Array (Cat # ARY010, R Reverse primer: 5′-AGCAAGGCCCACAGGGATTT-3, Effektivitet: 2; GAPDH: (240 bp), Forward primer: 5′-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3 ‘;

Reverse primer: 5′-TCCTTGGAGGCCATGTAGGCCAT-3′, Effektivitet: 2; Resultater blev normaliseret med den for GAPDH og kvantificering af relative ekspression blev bestemt ved 2

-ΔΔCt metode.

transient ekspression af mutant K-ras-genet i Caco-2-celler Salg

Caco -2 celler blev transient transficeret med pBabe K-Ras 12V plasmid eller tom vektor (pBABE-puro), leveret af Addgene (plasmider # 12544 og # 1764). PureYield Plasmid Midiprep System (Promega) blev anvendt efter den protokol, der leveres af producenten. Celler blev podet ved 90% konfluens i 6-brønds plader og efter 24 timer blev cellerne transficeret under anvendelse af Lipofectamine 3000 (Life Technologies) som transfektionsreagens, i overensstemmelse med producentens anvisninger. Analyse af EGF-uafhængig aktivering af ERK1 /2 ved Western blot og celleproliferationsassays blev udført i transficerede celler.

Immunofluorescens konfokal mikroskopi

Celler dyrkedes på poly-L-lysin-behandlede dækglas til dannelse af en næsten sammenflydende monolag og efter 6 h af de forskellige behandlinger. Derefter blev dyrkningsmediet bortkastet, celler blev vasket tre gange i PBS og permeabiliseret i methanol. Efter vask med PBS blev dækglassene inkuberet med anti-β-Catenin (1/250) muse-mAb (BD) og FOXM1 (1/250) kanin pAb (Santa Cruz Biotechnology), i 1 time ved stuetemperatur, vasket tre gange i PBS og mærket med et anti-muse-IgG Alexa fluor 488-mærket antistof (1/500) (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) og med anti-kanin IgG (H + L) Alexa fluor 594-mærket antistof (1/500) (Santa Cruz Biotechnology), i 1 time ved stuetemperatur. Endelig blev cellerne inkuberet med 300 nM 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol dihydrochlorid (DAPI) i PBS i 5 minutter ved stuetemperatur. Coverslip blev monteret ved hjælp af Aqua Poly /Mount (Polysciences, Warrington, PA, USA) og visualiseres i en Zeis LSM 5 Exciter Konfokal laser-scanning mikroskop (Zeiss, Tyskland). Billeder blev analyseret ved hjælp af billedet-J software (National Institutes of Health).

Co-immunopræcipitationsanalyser

Cellerne blev lyseret i co-IP buffer (10 mM HEPES, 10 mM KCI, 1,5 mM MgCl

2, 0,5 mM DTT, 0,5 mM, PMSF, 0,075% NP40 og 1% v /v proteaser /phosphataser inhibitor cocktails), centrifugeret og væk for inkubering med 22,5 pi protein A /G gel i 1 time ved 4 ° C. Den præ-klarede supernatant blev underkastet IP med de angivne første antistoffer ved 4 ° C i 1 time. Derefter blev proteinkomplekser opsamlet ved inkubering med 22,5 pi protein A /G-gel ved 4 ° C natten over. De opsamlede proteinkomplekser blev vasket tre gange med PBS-buffer, centrifugeret ved 14000 xg, 4 ° C i 10 minutter og analyseret ved western blotting.

Statistisk analyse

Alle data er udtrykt som middelværdier ± standardafvigelse på middelværdien. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af GraphPad Prism 5. Før sammenligne to datagrupper, en normalitet test og en lige varians test blev udført. Hvis datagrupper bestået begge tests blev en sammenligning foretaget af en parametrisk tilgang (uparret t-test). Hvis normalitet og /eller lig varians test blev krænket, blev en sammenligning, som en ikke-parametrisk metode (Mann-Whitney-test). Forskelle blev betragtet som statistisk signifikante ved p 0.05.

Resultater

AEE788 hæmmer celledeling, inducerer apoptose og ændrer cellecyklus i kolorektale cancerceller

AEE788 udøves en antiproliferativ virkning i HCT-116 og Caco-2 celler med en større antitumorvirkning i tilfælde af Caco-2-celler, (fig 1A). De forskellige følsomhed over for AE788 mellem de to cellelinjer var mere tydelig i tilfældet med EGF-driven celleproliferation, hvori 2,5 uM AE788 reduceret proliferation af Caco-2-celler med 60%, mens K-Ras muteret HCT-116-celler ikke var signifikant påvirket (fig 1B). Efter aftale med disse resultater, AEE788 udøvede en dosis-afhængig apoptotisk celledød i Caco-2, men ikke i HCT-116-celler (Fig 1C). Desuden behandling af Caco-2 celler med forskellige doser af AEE788 resulterede i en forøget procentdel af celler i G1-fasen i en dosisafhængig måde sammenlignet med ubehandlede celler, mens disse ændringer i cellecyklus ikke blev observeret i AE788-behandlede K -Ras muteret HCT-116-celler (fig 1D).

A) Celleproliferation blev vurderet efter 72 h behandling med forskellige doser af AEE788. B) Inhibering af celleproliferation med AEE788 blev testet i celler, der vokser i nærvær af EGF (100 ng /ml). C) Den fraktion af apoptotiske celler blev estimeret efter 48 timers behandling med forskellige doser af AEE788 af celler, der vokser i nærvær af EGF (100 ng /ml). D) Analyse af cellecyklus blev udført ved flowcytometri efter 48 timers behandling med forskellige doser af AEE788 af celler, der vokser i nærvær af EGF (100 ng /ml). Dataene er middel ± SEM af tre uafhængige forsøg (* p 0,05, sammenlignet med kontrolgruppen).

AEE788 hæmmer EGFR-signalering i kolorektale cancerceller

Vi næste analyserede aktiveringen af EGFR, ERK og AKT kinaser at vurdere betydningen af ​​EGFR signal blokade i de anti-tumorale effekter af AEE788 (figur 2). Behandlingen med AEE788 inhiberede EGFR-phosphorylering i både HCT-116 og Caco-2-celler. Men AEE788 effektivt inhiberede EGF signalering akse kun i Caco-2-celler, som indikeret ved inhibering af EGF-induceret phosphorylering af ERK 1/2 (figur 2). Desuden blev en inhibering af EGF-induceret phosphorylering af Akt Thr observeret i AEE788-behandlede Caco-2, men ikke i HCT-116-celler. Derfor er den observerede anti-EGFR aktivitet af AEE788 i kolon cancerceller er stærkt afhængig af vild-type K-Ras status.

påvistes De phosphorylerede og ikke-phosphorylerede former af EGFR, ERK 1/2 og Akt ved Western-blot under anvendelse af specifikke antistoffer. Celler blev dyrket i fravær eller nærvær af EGF (100 ng /ml) og behandlet med AEE788 (2,5 uM) i 5, 10 eller 15 min. Udtrykket niveau af actin blev inkluderet som lastning kontrol.

AEE788 hæmmer VEGF-drevne proliferation i Caco-2 celler

Ud over anti-EGFR aktivitet, AEE788 også mål VEGFR signalering. I denne henseende er funktionen af ​​VEGF ikke begrænset til angiogenese og vaskulær permeabilitet, og det er kendt, at både autokrin og parakrin VEGF-signalering forekomme i tumorceller [19]. Derfor vi næste undersøgt, om AEE788 forringe VEGF signalering i tyktarmen kræftceller. Som vist i S1 Fig, behandling med AEE788 inhiberede VEGF-drevne celleproliferation i Caco-2, men ikke i HCT-116-celler.

COX-2-inhibering forøger antitumormakrofagaktivatoren effekt af AEE788

det er kendt, at VEGF stimulerer COX-2-ekspression og prostaglandinsyntese, som igen inducerer VEGF-produktion [20,21]. Derfor kan kombinationen med COX-2-hæmmere være en effektiv måde at øge aktiviteten af ​​AEE788. Som vist i figur 3, at tilsætningen af ​​begge NS-398 og celecoxib, to velkendte COX-2 selektive inhibitorer, forstærkede den antitumorale virkning AEE788, som indikeret ved inhibering af celleproliferation (Fig 3A). Endvidere den kombinerede behandling med AEE788 og celecoxib steg procentdelen af ​​Caco-2 celler standset i G1 (Fig 3B). Især blev en signifikant højere procentdel af celler i G1-fasen observeret efter den kombinerede behandling end med enten lægemidler alene. Tværtimod blev ingen af ​​disse virkninger observeret i HCT-116-celler, som kan relateres til de meget lavere ekspressionsniveauer af COX-2 i disse celler sammenlignet med Caco-2 (fig 3C) og deres muterede K-Ras status. Således transfektion af Caco-2-celler med et mutant K-Ras udtrykkende plasmid bekræftede, at nedstrøms aktivering af EGFR-Ras-ERK-vejen, som vist ved EGF-uafhængige ERK1 /2 phosphorylering, afskaffede den antiproliferative aktivitet af AEE788 og /eller celecoxib (S2 fig). Endvidere celecoxib inhiberet med mere end 70% PGE2-produktion i Caco-2-celler (S3 Fig). Det blev desuden konstateret, at AEE788 behandling faldt COX-2-protein-ekspression i Caco-2-celler, der forklarer reduktionen i PGE2 produktion 40%, mens hæmning af COX-2 enzymatisk aktivitet med celecoxib ikke påvirkede COX-2 ekspression (S3 Fig ). Følgelig den kombinerede behandling af AE788 og celecoxib inhiberede EGFR, ERK 1/2, og AKT (Ser /Thr) phosphorylering i Caco-2-celler (fig 3D). Kvantitativ analyse ved anvendelse af et antistof panel mod signalkinaser viste, at den kombinerede behandling af Caco-2 celler med AEE788 og celecoxib forårsagede en signifikant højere inhibering af VEGFR, Akt (Ser /Thr) og Stat3 phosphorylering end med enten alene lægemiddel (S4 Fig).

A) EGF-drevet celleproliferation blev analyseret i celler, der vokser i nærvær af EGF (100 ng /ml) og i nærvær eller fravær af AEE788 (2,5 uM), celecoxib (10 uM) og NS- 398 (10 uM). B) Analyse af cellecyklus blev udført ved flowcytometri efter 48 timers behandling med AEE788 (2,5 uM) og /eller celecoxib (10 uM) af celler, der vokser i nærvær af EGF (100 ng /ml). C) Ekspressionsniveauer af cyclooxygenase-2 (COX-2) blev analyseret ved western-blot i helcelleekstrakter dannelse Caco-2 og HCT-116 celler. Ekspression af β-actin er inkluderet som ladningskontrol. D) Det phosphorylerede og ikke-phosphorylerede former af EGFR, ERK 1/2 og Akt blev påvist ved Western-blot under anvendelse af specifikke antistoffer. Celler blev dyrket i nærvær af EGF (100 ng /ml) og behandlet med AEE788 (2,5 uM) og /eller celecoxib (10 uM) i 6 timer. Ekspressionsniveauet af actin blev inkluderet som ladningskontrol. Den tilsvarende densitometrisk analyse er også vist. Data er middelværdier ± SEM for tre uafhængige forsøg (* p 0,05, sammenlignet med kontrollen; # p 0,05, sammenlignet med AEE788-behandlede celler).

COX-2-inhibering intensiverer anti -angiogenic aktivitet af AEE788

hæmning af COX-2 i kombination med anti-EGFR /VEGFR aktivitet af AEE788, forårsagede en signifikant reduktion i VEGF-a-mRNA-ekspression (fig 4A) og VEGF165-protein sekretionsniveauer (fig 4B) i Caco-2, men ikke i HCT-116-celler. Desuden viste endotheliale rørdannelse assays at den angiogene aktivitet af Caco-2 konditioneret medium var signifikant lavere, når celler blev behandlet med AEE788 og celecoxib end med hvert lægemiddel alene. (Fig 4C og 4D).

A) VEGF-A-mRNA-ekspressionsniveauer blev analyseret ved real time RT-PCR i kolorektale cancerceller vokser i nærvær af EGF (100 ng /ml) og udsat for den angivne behandlinger i 48 timer. B) VEGFA165 niveauer blev kvantificeret ved ELISA i de konditionerede medier opsamlet fra celler, der vokser i nærvær af EGF (100 ng /ml) og behandlet med AEE788 (2,5 uM) og /eller celecoxib (10 uM) i 48 timer. Data er middelværdier ± SEM for tre uafhængige forsøg (* p 0,05, sammenlignet med kontrolgruppen). C) Den angiogene aktivitet af medier konditioneret med Caco-2-celler eksponeret i 24 timer til de angivne behandlinger blev vurderet ved anvendelse af endotelrør assay som beskrevet under Materialer og metoder. Data er den samlede længde af dannede rør i pixels (px), der viser middel ± SEM for tre uafhængige forsøg (* p 0,05, sammenlignet med kontrolgruppen). D) Repræsentative billeder af de dannede indbyrdes forbundne netværk efter behandlingen af ​​endotelceller med de angivne Caco-2-celler konditionerede medier. Omfanget af dannelse rør blev kvantificeret som angivet i afsnittet Materialer og Fremgangsmåder. (Final forstørrelse: X40, skala bar svarer til 100 mikrometer)

Udover de funktioner VEGF i angiogenese og i endotelceller, fremme af kræftcellen migration har vist sig at være blandt de. autokrine funktioner af VEGF på tumorceller [22,23]. Derfor Derefter undersøgte vi virkningerne af AEE788 og /eller celecoxib på Caco-2 og migration HCT-116 celler under anvendelse af scratch-sårheling assay.