PLoS ONE: terapeutiske potentiale for Human adipøst afledte stamceller (ADSCs) fra kræftpatienter: En Pilot Study

Abstrakt

Mesenchymstamceller fra fedtvæv (ADSCs) er en vigtig kilde til celler til regenerativ medicin . Den terapeutiske virkning af kulturekspanderede adipøst afledte stamceller er blevet vist; dog optimale xeno-fri dyrkningsbetingelser endnu ikke fastlagt. Kræftpatienter, specielt dem, der gennemgår invasiv kirurgi, udgør en undergruppe af patienter, som kunne drage fordel af autolog stamcelletransplantation. Selv regenerativ potentialet i deres ADSCs kunne blive påvirket af sygdommen og /eller behandling, er vi ikke bekendt med nogen undersøgelse, der har vurderet det terapeutiske potentiale af ADSCs isoleret fra kræftpatienter i forhold til den af ​​ADSCs stammer fra raske forsøgspersoner. Her rapporterer vi, at ADSCs isoleret fra subabdominal fedtvæv af patienter med urologiske neoplasmer gav tilsvarende vækst kinetik, præsenterede tilsvarende mesenkymale overflademarkører og viste lignende differentiering potentiale i forskellige mesodermal cellelinier: adipocytter, chondroblaster og osteoblaster end ADSCs isoleret fra fedtvæv af alders- matchede ikke-onkogene deltagere, alle under xeno-fri vækst dyrkningsbetingelser. Molekylær karyotypebestemmelse af patient udvidet ADSCs genomer viste ingen sygdomsrelaterede forandringer angiver deres sikkerhed. Desuden, blærer 100 nm identificeret som exosomer (Exos), der kan være i det mindste delvist ansvarlige for de tilskrives terapeutiske parakrine virkninger af ADSCs blev effektivt isoleret fra ADSCs og viste tilsvarende miRNA indhold, uanset de stammede fra kræftpatienter eller ikke- onkogene deltagere angiver, at reparation kapaciteter xeno-fri udvidede ADSCs ikke kompromitteres af patientens tilstand og dermed deres xeno-fri kultur udvidede ADSCs bør være egnet til autolog stamcelletransplantation i en klinisk

Henvisning:. García -Contreras M, Vera-Donoso CD, Hernández-Andreu JM, García-Verdugo JM, Oltra E (2014) terapeutiske potentiale for human adipøst afledte stamceller (ADSCs) fra kræftpatienter: en pilotundersøgelse. PLoS ONE 9 (11): e113288. doi: 10,1371 /journal.pone.0113288

Redaktør: Carlos Eduardo Ambrósio, Det Heste og Food Engineering, University of São Paulo, Pirassununga, SP, Brasilien, Brasilien

Modtaget: April 11, 2014; Accepteret: 21 oktober, 2014; Udgivet: 20. november 2014

Copyright: © 2014 García-Contreras et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Generalitat Valenciana (giver AP-014-10 og AP-222-11 til JMHA), Universidad Católica de Valencia ” San Vicente Mártir “(tilskud 2012-006-010 til JMHA) (tilskud 2011-011-02, 2011-011-04 og 2012-011-008 til EO), og AITEX Institute of Technology (tilskud 2011-011-015 at EO). MGC modtog et stipendium fra Universidad Católica de Valencia “San Vicente Mártir”. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Alle forfattere har erklæret der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Humant adipøst væv er en rigelig og tilgængelig kilde til multipotente mesenchymale stamceller (MSC’er), som holder et stort potentiale til terapeutiske anvendelser i regenerativ medicin og vævsmanipulering [1] – [3]. MSC’er er blevet vist at være i stand til at differentiere til flere celletyper fra mesodermal afstamning (osteoblaster, chondrocytter og adipocytter), men også i ikke-mesodermale afstamningsceller (neuroner, cardiomyocytter og ektodermal huden) [4] – [7], reducere inflammation i beskadigede væv, stimulerer angiogenese og reducere apoptose [8] – [11]. MSC’er rolle i modulering af vævsreparation og immunmodulation er blevet tilskrevet deres parakrin faktor sekretion potentiale, mitokondriel overførsel og exosom (exo) sekretion kapacitet [12] – [14]. Exos udskilles bilipid membranvesikler af ~50-100 nm med en kompleks last, der er let internaliseres af target-celler inducerer varierede fysiologiske virkninger [15] – [17]

Op til dato forskellige metoder til isolering og ekspansion. af MSC’er er blevet anvendt. Mest omfatter animalske afledte produkter som føtalt bovint serum, som er en kilde til kontaminerende vira, bakterier, mycoplasma, prioner og andre patogene eller toksiske midler, og xenogene antigener, der kan tippelad uønskede immunreaktioner [18], [19]. Xeno-fri kultur kunne øge sikkerheden og kvaliteten af ​​transplanterede

in vitro

-expanded stamceller [20], [21], og give mulighed for etablering af standard ekspansion metoder, undgå batch-til-batch variationer. Men deres nyhed og den store forskel i pris begrænse antallet af undersøgelser, der har brugt xeno-frit medium indtil nu.

Selvom allogen infusion af

in vitro

udvidede MSC virker som en lovende mulighed til visse formål [22] – [25] de fleste af de igangværende eller afsluttede kliniske studier op til dato er baseret på autologe behandlinger [26]. I den forstand kunne fremskreden alder og sygdomstilstand begrænse enkeltpersoner muligheder, især da antallet og regenerativ potentiale MSC synes negativt korrelere med alderen [27], [28] og befolkningens aldring er på stigningen.

Urologiske cancerpatienter er gode kandidater til stamcelle-baserede terapeutika. Stamceller rettet mod fremme heling efter invasive kirurgi procedurer de ofte gennemgår eller beregnet til at mindske urininkontinens, kan et fælles sekundært problem forbundet til prostatektomi resultere til gavn for dem. Også,

in vitro

udvidede autologe MSC kunne bruges til programmerede orgel remodeling operationer eller endda fuldstændigt organ teknik til transplantation. Men vi er ikke bekendt med nogen undersøgelse med fokus på evalueringen af ​​den terapeutiske potentiale og sikkerhed urologiske cancer MSC til autolog transplantation.

Her har vi foretaget en sammenlignende analyse af MSC’er opnået fra abdominal fedt af urologiske kræftpatienter og ikke-onkogene deltagere udvidet

in vitro

under xeno-fri forhold i et forsøg på at bestemme deres egnethed til autologe cellebaserede behandlingsformer hjælp optimale betingelser for klinikken. Karakterisering inkluderet klynge af differentiering (CD) ekspressionsmønstre og morfologi, vækst kinetik, plasticitet, Exos udgivelse som et mål for MSC parakrine terapeutisk potentiale og sikkerhed.

Materialer og metoder

Sample indsamling og etik erklæring

Denne undersøgelse blev indledt efter godkendelse af den lokale etiske komité af Hospital Universitario y Politécnico La Fe (Valencia, Spanien). Frisk udskåret abdominalt fedtvæv blev indsamlet fra patienter, der gennemgår neoplasiske urologiske kirurgisk behandling eller fra ikke-onkogene deltagere efter den tilsvarende informeret samtykke blev underskrevet.

Emner

Alle prøver blev affaldsmaterialer indsamles som en side produkt ifølge kirurgi, fra kræftpatienter (n = 5) undergår elektiv kirurgiske maveplastik procedurer i afdelingen for urologi, Sygehus Universitario y Politécnico La Fe, (Valencia, Spanien) eller ikke-onkogene aldersmatchede (± 5 y) deltagere ( n = 2) med en lignende etnisk baggrund (tabel 1). Ikke-onkogene deltagere svarede til Multiorgan donorer. For alle de beskrevne procedurer ADSCs fra både onkologiske og ikke-onkologiske patienter, som henholdsvis test- og kontrolprøver blev opnået og analyseret, medmindre andet er angivet.

Isolering af ADSCs

Isolering af ADSCs blev udført under anvendelse af en mekanisk og enzymatisk metode. Fedtvæv blev transporteret og vasket med saltvandsopløsning 0,9% NaCl (B. Braun, kat. 12.606.097), fragmenteret med en kirurgisk kniv og fordøjet med 1 mg /ml type I collagenase (Life technologies, kat. 17.100-017), i 2 timer ved 37 ° C med omrystning. Det fordøjede væv blev filtreret gennem gaze for at adskille den fra ufordøjet væv og centrifugeret ved 500 g i 7 minutter ved stuetemperatur (RT). Supernatanten (flydende adipocytter) blev kasseret. Pelleten (ADSC fraktion) blev resuspenderet i Hanks balancerede saltopløsning (HBSS + Ca + Mg) (Gibco, kat. 14.025.092) + 1% BSA (Sigma, kat. A2153), filtreret gennem et 140 um nylonnet og centrifugeret ved 500 g i 7 minutter ved stuetemperatur. Celler blev derefter resuspenderet i erythrocyt lysepuffer på is under 10 minutter og centrifugeret igen ved 500 g i 7 minutter ved 4 ° C. De isolerede celler blev derefter udpladet og udvidet i dyrkningsmediet. Dyrkningsmediet var MesenCult-XF Medium (StemCell teknologier, kat. 05.420) suppleret med 1% (v /v) penicillin /streptomycin (10.000 U /ml penicillin, 10000 ug /ml streptomycin, Gibco cat.15140-122), og 2 mM L-glutamin (Gibco, kat. 25.030-081).

In vitro

ekspansion og prøvetagning af ADSCs

ADSCs blev dyrket ved 37 ° C i en 5 % CO

2 luft atmosfære med medium skifter hver 3. dag. Når cellerne nåede ca. 80% konfluens, subkultur (passage) blev udført ved disaggregering hjælp MesenCult-ACF Dissociation Kit (StemCell teknologier, kat. 05.426) (6 ml /kolbe) i 5 minutter, efter en vask i phosphatbuffer saltvand (PBS ). Celler blev talt og re-udpladet i en kultur T-75 kolbe ved en densitet på 250.000 celler. Den dissociation opløsning blev neutraliseret ved hjælp af den samme mængde MesenCult-ACF Enzyme Inhibition Solution (StemCell teknologier, kat. 05.428). Cellesuspensioner blev centrifugeret (500 g, 7 minutter), og supernatanterne kasseres. Pellets blev resuspenderet i komplet medium ved angivne densitet. Tælles blev gjort i en Neubauer Kammer hjælp trypanblåt udelukkelse test for levende celler (Sigma Aldrich, kat. T8154). Før hver passage, kulturer var foto-dokumenteret. Befolkning fordoblinger (PD) blev beregnet ved anvendelse af formlen

x

= [log

10 (NH) – log

10 (NI)] /log

10 (2), hvor NH er cellehøst nummer og NI inokuleret antal som tidligere beskrevet [29]. For at opnå den kumulative befolkning fordobling blev populationen fordobling for hver passage beregnet og derefter tilsat til den foregående passage befolkning fordobling nummer. Celler blev derefter underkastet yderligere analyser, herunder ultra-morfologi, differentiering potentiale, senescens og epitop-analyse. Nogle portioner blev pelleteret og opbevaret i -80 ° C for RNA isolation.

Flowcytometri

Om 0,5-1 × 10

6 celler blev mærket med følgende fluorescensmærket anti -Menneskelige antistoffer: CD73, CD90, CD105, CD34, CD11b, HLA ABC og HLA-DR (tabel 2) og analyseret i forskellige kombinationer. Sammenfattende celler blev inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur og beskyttet mod lys, vasket (3X) med PBS centrifugering ved 500 g ved 4 ° C i 7 min. Vaskede celler blev resuspenderet i 1 ml PBS. Mærkede prøver blev analyseret ved flow-fluorescensaktiveret cellesortering analyse (FACS) (Beckman Coulter Cytomics, FC 500) til specifik fluorescens kanaler for hver fluorokrom. Parceller blev dannet ved anvendelse af CXP analyse software (Beckman Coulter).

adipogenisk differentiering

I adipogenisk differentiering blev celler dyrket i 6-brønds plader indeholdende 2 ml Mesencult-XF basal medium suppleret med adipogeniske stimulerende kosttilskud (MesenCult adipogeniske stimulerende Supplements (menneskelig), kat. 05403) i 15 dage, under standard dyrkningsbetingelser (37 ° C, 5% CO

2). Dyrkningsmedier blev ikke ændret medmindre medium blev gul /orange farve, i hvilket tilfælde en halv-medium ændring blev udført. Efter 15 dages inkubation blev mediet fjernet, og cellerne blev vasket i PBS. Fiksering med 4% paraformaldehyd (PFA) i 30 minutter blev efterfulgt af to vaske i destilleret vand og en af ​​60% isopropanol, hver i 5 minutter ved stuetemperatur. Adipogenisk differentiering blev bekræftet ved Oil Red O-farvning (Sigma, kat. O0625) efter producentens instruktioner. Kort fortalt blev celler inkuberet med Oil Red O dye ved stuetemperatur i 10 minutter i 2 ml. Farvestof blev omhyggeligt fjernet, og pladen blev vasket fire gange med destilleret vand. Derefter blev celler observeret ved anvendelse af et optisk mikroskop (Nikon Eclipse TE2000-U lys omvendt mikroskop, Nikon Inc., Melville, NY, USA) og fotograferet. Adipocytter blev identificeret som celler med rød-farvede lipidvesikler [4], [20], [30].

Osteogen differentiering

Celler blev dyrket i seks brønde indeholdende 2 ml MesenCult MSC basal Medium (human) (StemCell teknologier, kat. 05401) suppleret med osteogent stimulerende Supplement (StemCell teknologier, kat. 05405), p-glycerophosphat 1M (StemCell teknologier, kat. 05.406), dexamethason (StemCell teknologier, kat. 05.407) og ascorbinsyre (StemCell teknologier, kat. 07157) i 15 dage (osteogent medium). Pladerne blev holdt i en befugtet inkubator ved 37 ° C og 5% CO

2 og dyrkningsmediet blev udskiftet hver tredje dag. Efter perioden på 15 dage blev mediet fjernet, og cellerne blev vasket med PBS. Efter fiksering af cellerne med PFA 4%, i 30 minutter blev cellerne vasket tre gange med destilleret vand. Alizarinrødt S-farvning (Sigma, kat. A5533) blev anvendt til at bekræfte osteogen differentiering ved hjælp producentens protokol. Kort fortalt blev cellerne inkuberet i 2 ml opløsning af natrium alizarin ved stuetemperatur i 30 min. Farvestoffet blev forsigtigt fjernet og omfattende vask med destilleret vand efterfulgt. De faste og indfarvede celler blev observeret ved hjælp af optisk mikroskop (Nikon Eclipse TE2000-U omvendt mikroskop, Nikon Inc, Melville, NY, USA) og fotograferet [20], [30].

chondrogensupplering differentiering

i chondrogen differentiering, blev cellerne dyrket i seks-brønds plader indeholdende 2 ml komplet medium suppleret med StemPro Chondroqenese differentiation Kit (Gibco, kat. A10071-01) i 15 dage. Plader blev holdt i en fugtig inkubator ved 37 ° C og 5% CO

2 og dyrkningsmediet blev udskiftet hver tredje dag. Efter perioden på 15 dage, blev differentieringen mediet fjernet, og cellerne blev vasket med PBS. Derefter, fikseret med 2% glutaraldehyd i 20 minutter og vasket tre gange med PBS. Cellerne blev derefter inkuberet i Alcian Blue 8GX opløsning (Acros Organics, kat. 400.460.100) natten over ved stuetemperatur. Farvestoffet blev forsigtigt fjernet, og pladen blev vasket tre gange med 0,1 M HCI og to gange med PBS. Efter fiksering og farvning blev celler observeret med et optisk mikroskop (Nikon Eclipse TE2000-U omvendt mikroskop, Nikon Inc, Melville, NY, USA) og fotograferet [4], [20], [30].

senescens associeret β-galactosidase-farvning

pH-afhængig senescens forbundet med β-galactosidase-aktivitet blev analyseret under anvendelse af SA-β-gal-farvning kit (Cell Signaling Technology, kat. 9860) ifølge producentens protokol. Kort fortalt blev celler inkuberet i frisk fremstillet senescens-associerede β-galactosidase blåsplint opløsning (X-gal) natten over ved 37 ° C. På blev følgende morgen celler observeret og billeder taget under et omvendt lysmikroskop Nikon Eclipse TE2000-U (Nikon Inc, Melville, NY, USA).

RT-PCR

Total RNA blev ekstraheret fra dyrkede celler med Mirvana miRNA isolation Kit (Ambion, kat. AM1560) ifølge producentens protokol. RNA udbytter og renhed blev bestemt af de 260/280 og 260/230 nm nøgletal med en Thermo Scientific NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific, Wilmington, USA). cDNA blev fremstillet under anvendelse af 100-200 ng af total RNA og M-MuLV revers transcriptase (New England Biolabs, katalognr. EP0352) ved oligo-dT-priming. CDNA’et blev amplificeret ved PCR under anvendelse af ABI GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer, Applied Biosystems, Boston, MA) og de følgende cykliseringsbetingelser: 94 ° C i 30 s, 54-60 ° C (afhængig af primer Tm) 30 s og 72 ° C i 30 s (35 cyklusser), efter en enkelt indledende denaturering cyklus ved 94 ° C i 5 minutter. PCR primer sæt er vist i tabel 3. PCR-produkter blev separeret på en 2% agarosegel og visualiseret med realsafe plet.

QRT-PCR

Totalt RNA blev isoleret fra ADSCs og exosomer med Mirvana miRNA isolation Kit (Ambion, kat. AM1560) under anvendelse fabrikantens protokol. Revers-transkription blev udført under anvendelse miScript II RT Kit (Qiagen, kat. 218.161) ifølge producentens vejledning. cDNA’er blev anvendt til Real time PCR ved hjælp miScript SYBR Green PCR (Qiagen, kat. 218.073). Sekvenserne for de fremadrettede primere anvendte er vist i tabel 4.

exosome isolation

exos blev oprenset fra xeno-fri cellekultursupernatanter af adipøst afledte stamceller ved ultracentrifugering. Supernatantfraktioner opsamlet fra ADSC kulturer blev centrifugeret ved 300 g i 10 min, 2.000 g i 20 minutter og 10.000 g i 20 min for at eliminere store døde celler og nedbrudt materiale. Efter filtrering gennem 0,22 um filtre til at fjerne urenheder, blev den endelige supernatant ultracentrifugeret ved 110.000 g i 70 minutter for at pelletere exos. Nyttiggjorte exos blev vasket med PBS og centrifugeret igen ved 110.000 g i 70 min. Pelleten blev resuspenderet i 50 pi PBS til opnåelse af en koncentreret EXO fraktion.

Western blot-analyse

ADSCs og exos blev lyseret i vævsprotein Extraction Reagent (T-PER) (Thermo Scientific, kat. 78.510) efter producentens anbefalinger. Proteinkoncentrationer blev målt ved Bradford-metoden (Thermo Scientific Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay, kat. PI-23200). Prøverne blev blandet med ikke-reducerende Tris-glycin SDS-prøvebuffer, derefter opvarmet 95 ° C i 5 min og fyldt på en 10% SDS-polyacrylamidgel. Gelen blev kørt under denatureringsbetingelser ved 80 V i 2 timer og derefter overført til en PVDF-membran (GE Healthcare Life Sciences, kat. 0.485.288). Efter overførsel blev membraner blokeret i 3% fedtfri mælk PBS i 2 timer og inkuberet ved stuetemperatur i 2 timer med kanin-anti CD63 (Abgent, kat. AP5333b). Efter vask i PBS-T, blev membranerne inkuberet i 1 time med gede-anti-kanin-HRP-bundet sekundært antistof (Santacruz, kat. Sc-2004) og fremkaldt med Luminata Forte Western HRP substrat (Millipore, kat. WBLUF0500) under anvendelse en ImageQuant LAS 4000 kemiluminescere detektorsystemet.

Elektronmikroskopi

i ultrastrukturelle analyse blev celler dyrket på permanox dækglas (8 såvel chamber dias) ved en densitet på 3,5 x 10

3 celler /kammer. Kamre blev holdt i en fugtig inkubator (37 ° C, 5% CO

2) blev og dyrkningsmediet skiftes hver tredje dag, indtil sub konfluens. Celler blev derefter vasket tre gange med frisk fremstillet medium, en gang med PBS og derefter fikseret med 3,5% glutaraldehyd i 30 minutter ved 37 ° C. Den fiksativ opløsning blev fjernet, og cellerne blev vasket to gange med PBS. Celler blev efterfikseret i 2% OSO

4 i 30 minutter ved stuetemperatur og farves i 2% uranylacetat i mørke i 1 time ved 4 ° C. Endelig blev cellerne dehydratiseret i ethanol, skyllet med propylenoxid (Lab Baker, Deventry, Holland) og indlejret natten over i Araldite (Durcupan, Fluka, Buchs SG, Schweiz). Ved polymerisering blev indlejrede kulturer løsrevet fra kammeret slide og limet (Super lim, Loctite) til Araldite blokke. Semi-tynde sektioner (1,5 um) blev skåret med en ultramikrotom (Ultracut UC-6, Leica, Heidelberg, Tyskland) monteret på objektglas og farves med 1% toloudine blå. Ultratynde snit (70 nm) blev fremstillet med ultramikrotom og farvet med blycitrat. Billeder blev opnået med en transmission elektron mikroskop (FEI Tecnai Spirit G2, Eindhoven, Holland), ved hjælp af et digitalt kamera (Morada, Soft Imaging System, Olympus).

Rensede Exos blev fikseret med 1% glutaraldehyd i PBS . Efter skylning blev en 20 pi dråbe af suspensionen påført en Formvar /kulovertrukket gitter, negativt farvet med 3% (w /v) vandig phosphowolframsyre i 1 min, og observeres ved transmissionselektronmikroskopi (TEM) i en Tecnai Spirit G-2 apparat; (FEI, Eindhoven, Holland).

Molekylær karyotype

Affymetrix CytoScan750 arrays blev brugt til at evaluere kopital gevinster og tab på heterozygositet (LOH) i ADSCs prøver af patienter og ikke-onkogene deltagere . Disse arrays indeholder mere end 2,6 millioner kopital markører, hvoraf 750.000 er “genotype-stand” SNPs og 1,9 millioner er ikke-polymorfe prober. DNA blev ekstraheret fra ADSCs for hver af de to onkologiske patientprøver analyseres, ved anvendelse af en QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, kat. 51.306) efter producentens instruktioner. DNA mængde og kvalitet blev målt med spektrofotometer NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific) ved absorbans nøgletal ved 260/280 nm. Integriteten af ​​totalt DNA blev målt ved 0,8% agarosegelelektroforese. Kopiér nummer og genotypebestemmelse blev udført ved hjælp af Affymetrix kromosomanalyse Suite (Chas) software på Array service, Genomisk Unit IIS La Fe.

Statistisk analyse

Data blev analyseret af uparrede 2-tailed studerendes

t

test eller Multiple t-test, som angivet. Fremgangsmåde korrektionen for Holm-Sidak blev anvendt til bestemmelse af betydningen af ​​forskelle i multiple sammenligninger. Data svarede til middelværdier ± SD af mindst tre uafhængige gentagelser. Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse af GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, USA); værdier med

s

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Befolkning og celle udbytter

Patientens gennemsnitsalder var 60, interval mellem 38 og 72 år, (n = 5), og ikke-onkogene deltagere gennemsnitsalder var 59, 41 to 77 (n = 2) (tabel 1). Patienterne led af nyre, blære eller prostatakræft og sundt væv kom fra donorer, der har lidt et uheld traumatiske død.

Gennemsnitlig fedt-afledte stamceller udbytte efter indledende ekspansion var (2,28 ± 4,62) × 10

5 og (3,10 ± 5,4) × 10

5 celler pr gram væv fra enten patient eller ikke-onkogene deltagere hhv. Udbytter var meget variable med en tendens til at opnå lavere renter fra større stykker af væv (tabel 1).

vækstpotentiale og ældning

For at undersøge cellevækst potentiale celler fra enten gruppe af deltagere, populationsfordoblinger (PD) af hver prøve blev bestemt ved hver passage op til passage 6, svarende til dag 58 i kultur i gennemsnit (figur 1). Forskellen mellem patienter (6,292 ± 1,394) og donor (4,869 ± 1,801) PD var ikke signifikant (p 0,5), som bestemt af uparret t-test analyse af dataene. Semi-sammenløbet ved passage en varieret ca. 3,6 ± 1,2 PD for patienter og 2,02 ± 1,7 PD for ikke-onkogene deltagere (figur 1), hvilket faldt sammen med tidligere rapporter [31] -. [33]

Resultater præsenteres som kumulative udfyldelse fordoblinger af ADSCs afledt fra fem forskellige cancerpatienter og to ikke-tumorigene deltagere (donorer) under xeno-fri dyrkningsbetingelser. Cell-numre blev bestemt ved afslutningen af ​​hver passage og kumulative populationsfordoblinger blev beregnet som beskrevet i materialer og metoder.

Selvom der ikke blev observeret nogen unormal vækst adfærd kræftpatienter ADSCs, var det vigtigt at afgøre, om disse celler kunne præsentere nogen vækst fordele på længere kultur perioder. For at vurdere ekspansion-tid-relateret celleældning, to af de analyserede prøver, svarende til patient 1 og 2 blev yderligere dyrket til sen passager, specielt op til passagen 10 og 8. Vækst efter passage 10 i kultur ikke længere var eksponentiel (figur 1), hvilket indikerer en begrænset udvidelse potentiale under de anvendte vækstbetingelser. Senescens blev bestemt ved ændringer i β-galactosidase aktivitet af tidlige

vs Salg sene passager. Som vist i figur S1, β-galactosidase-aktivitet steg med passagen. De fleste af cellerne i tidlige passager ikke foreliggende evidens for behandlingen af ​​det kromogene X-gal-substrat som celler fra senere passager gjorde. Denne stigning i β-gal-farvning mellem tidlige og sene passager (0,0390 ± 0,0046 vs 0,1717 ± 0.0181) var signifikant (p 0,005). Dette antyder, at replikative senescens af MSC’er er en kontinuerlig tidsafhængig proces som tidligere foreslået [31], også for ADSCs opnået fra cancerpatienter.

Desuden har vi vurderet senescens-associerede proces med autofagi ved RT -PCR-analyse af autofagi-relaterede gener. På sene passager (passager 8-10) mRNA ekspressionsniveauer af Atg5 optrådte opreguleret (1,61 ± 0,04 gange), mens Atg7 lidt blev inhiberet (-1,10 ± 0,03 gange) og Beclin1 niveauer viste en markant nedregulering (-10,80 ± 0,03) (fig S1 C). Den observerede store ophobning af autophagosomes på disse sene passager, fremgår af ultraestructural analyse af deres cytoplasmaer (figur S1 D, E) faldt sammen med en reduktion i væksten tyder på, at stigningen i autophagy på sent passager forbinder med replikativ ældning, som tidligere rapporteret [34] – [36]. Det faktum, at ADSCs fra patienter ældes på kultur angiver, at de ikke er tumorigent.

Morfologi

For at undersøge eventuelle morfologiske ændringer mellem ikke-onkogene deltagere og neoplasiske patient ADSCs på forskellige passager, vi evalueret deres morfologiske og ultra-strukturelle træk ved fase-kontrast mikroskopi og transmission elektron mikroskopi (TEM) ved hver passage op til passage 4, som er den anbefalede passage for terapi [37]. Billeder afslørede alle celler havde spindel og multipolær form morfologi. Ingen morfologiske forskel mellem celler af begge gruppe af deltagere blev observeret (figur 2 A, B).

Repræsentative fase-kontrast billeder af

in vitro

udvidede ADSCs fra kræftpatienter (A) og ikke -tumorigenic deltagere (donorer) (B) ved passage 4 og toluidinblåt farvning af semithin sektioner af de samme celler (C og D, henholdsvis) (forstørrelse 20X).

Semi-tynde sektioner gjorde ikke viser nævneværdige morfologiske forskelle enten, med de fleste celler, der udgør en enkelt kerne (Figur 2 C, D). Kernerne indeholdt én eller to nukleoler og rigelig nukleoplasma. Celler havde intakte membraner med pseudopodia strukturer på overfladen og intakte organel strukturer. Ru endoplasmatiske reticulum (RE) og mitokondrier blev påvist i både den indre og perifere endoplasmiske zoner. Perifere zoner udstillet fravær af organeller, men indeholdt vakuoler og blærer.

For at øge beslutning, vi opnåede transmission elektron mikroskopiske billeder af nogen af ​​grupperne af ADSCs. Celler ved passage 2 viste rigelige og udvidede ru RE, talrige Golgi cisterner og et stort antal dictyosomes fordelt langs cytoplasmaet der også indeholdt mitochondrier, lipid dråber og rigelige bundter af filamenter (Figur 3 A, B). Electrodense organer blev også fundet ved siden af ​​dictyosomes.

ADSCs fra kræftpatienter på passage to (A) og passage 4 (C) viser cytoplasmaer beriget med organeller og store kerne (N) med løst pakket kromatin. En detalje af ADSC fra kanalen 2 (B) viser organel berigelse, ru endoplasmatisk reticulum (pile) og stort Golgi cistemae (asterisk) med nogle lipid dråber (Li). ADSCs på passagen 4 (C) viser fremtrædende nukleare invaginationer (pile) og forstørret nucleoli (Nu). Ved lav forstørrelse viser også rigelige elektro-tætte organeller. Ved en højere forstørrelse rigelige ru endoplasmatiske reticulum cisterner, er lipid dråber (Li) og rigelige hindeagtige strukturer eller autophagosomes værdsat (D). Scale bar 10 pm (A-C); 1 um (B-D).

De kerner indeholdt en eller to nucleoli og præsenteres løst pakket kromatin, nogle gange viser dybe invaginationer og rigelige nukleoplasma. Ved passagen 4, celler viste nogle mindre forskelle med hensyn til passage 2 herunder en højere tendens til at sammentrækningsorgan kerner, større kernelegeme og en stigning i antallet af bundter af filamenter og i antallet af electrodense hindeagtige body-lignende strukturer eller autofagosomes (figur 3 C, D). Imidlertid kunne ingen kvalitative forskelle blive værdsat mellem grupperne, tillader os at konkludere, at ADSCs fra kræftpatienter er identiske med dem for ikke-onkogene deltagere på den morfologiske niveau.

immunofænotype

For at bekræfte, at vores udvidede ADSCs overholdt de minimale mesenkymale kriterier, som International Society for Cellulær Therapy [38] vi udførte flowcytometrisk analyse af ADSCs fra patienter og ikke-onkogene deltagere ved passage 4 (figur 4 A-G og figur S4 A- F).

repræsentant flow fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) og RT-PCR-analyse af

in vitro

ekspanderede ADSCs fra kræftpatienter ved passage 4. Celler var positive for CD105 (A), CD73 (B), CD90 (C), CD29 (H-6), CD44 (H-7) og HLA ABC (F), men udtrykker ikke CD11b (D), NODAL (H-3), UTF1 (H-4 ), ABCG2 (H-5), eller HLA DR (G); mens CD34 var delvis positive (E), som tidligere beskrevet. Bane H-1 og H-2 show RT-PCR-amplifikation af hus holder gener GAPDH og β-actin henholdsvis.

Som forventet celler var positive for mesenchymale CD73, CD90 og CD105 markører og negativ for den hæmatopoietiske markør CD11. Desuden var de positive for histocompability antigen klasse I HLA-ABC, men gav ikke udtryk HLA-DR overflademolekyler under en ikke-stimuleret tilstand, som tidligere beskrevet [38]. Uventet, CD34, en markør for hæmatopoietiske og endotele stamceller [39], var positiv i 3-12% af cellerne.

Vi udførte også RT-PCR-analyse for yderligere mesenchymale og pluripotens markører. De mesenkymale CD44 og CD29 markører var klart positiv, mens der blev opnået nogen forstærkning af pluripotens NODAL og UTF 1 markører. Vi vil også kunne forstærke multidrug-resistens transportprotein ABCG2 som er en pluripotency markør tidligere var forbundet med en subpopulation af MSC’er med neurogen potentiale [40], hvilket tyder på en mulig begrænsning af disse celler til behandling af nervevæv. De antigen overflade profiler beskrevet var ens for MSC fra patienter og ikke-onkogene deltagere (data ikke vist).

Cell plasticitet

plasticitet af de udvidede ADSCs blev bestemt ved deres differentiering potentiale. Celler ved passage 4 fra enten patienter eller kontroller blev dyrket i specifik differentiering medier, som beskrevet i Materialer og Metoder. Celler i adipogeniske medier indeholdt rigelige vakuoler fordelt langs deres cytoplasmaer som vist ved Oil Red O-farvning (figur 5 A, D), hvilket viser, at differentiering til adipocyter var sket. Osteogenese blev påvist ved tilstedeværelsen af ​​aggregater med nodule-lignende strukturer, der blev farvet med alizarinrødt detektering mineralaflejring (fig 5 C, F). Chondrogen differentiering blev vurderet ved anvendelse Alcian Blue-farvning, der afslørede højt indhold af brusk specifikke proteoglycaner i kulturerne (figur 5 B, E). ADSCs fra både patienter (figur 5 A-C), og ikke-onkogene deltagere (figur 5 D-F), var lige i stand til effektivt at differentiere i adipogenisk, chondrogen og osteogene afstamninger der angiver, at ADSCs stammer fra vores kræftpatienter besidder tilsvarende celle plasticitet