PLoS ONE: Computational Modeling of PI3K /AKT og MAPK signalveje i Melanom Cancer

Abstrakt

Baggrund

Malignt melanom er en aggressiv svulst i huden og synes at være resistente over for de nuværende behandlingsmetoder. Melanocytisk transformation menes at opstå ved sekventiel akkumulering af genetiske og molekylære ændringer stand til at aktivere Ras /Raf /MEK /ERK (MAPK) og /eller PI3K /AKT (AKT) signalveje. Specifikt mutationer af B-RAF aktivere MAPK-vejen resulterer i cellecyklusprogression og forebyggelse apoptose. Ifølge disse resultater, kan MAPK og AKT veje repræsenterer lovende terapeutiske mål for en ellers ødelæggende sygdom.

Resultat

Her viser vi et beregningsmæssige model i stand til at simulere de vigtigste biokemiske og metaboliske interaktioner i PI3K /AKT og MAPK veje potentielt involveret i melanom udvikling. Det kan alt beregningsmæssige tilgang accelerere lægemiddelopdagelsesprocessen og tilskynder identifikation af nye pathway aktivatorer med deraf følgende udvikling af hidtil ukendte antioncogenic forbindelser at overvinde tumorcelleresistens imod konventionelle terapeutiske midler. Kildekoden af ​​de forskellige versioner af modellen er tilgængelige som S1 Archive

Henvisning:. Pappalardo F, Russo G, Candido S, Pennisi M, Cavalieri S, Motta S, et al. (2016) Computational Modeling of PI3K /AKT og MAPK signalveje i Melanom Cancer. PLoS ONE 11 (3): e0152104. doi: 10,1371 /journal.pone.0152104

Redaktør: Suzie Chen, Rutgers University, UNITED STATES

Modtaget 22. januar 2016 Accepteret: 8 marts 2016; Udgivet: 25 Mar 2016

Copyright: © 2016 Pappalardo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og som en understøttende information arkiv

Finansiering:. Dette arbejde er delvist støttet af FIR 2014 universitetet i Catania, Italien tilskud. Der var ingen andre finansieringskilder understøtter dette arbejde. FIR 2014 delvist støttet arbejdet. Den resterende indsats kommer fra interne personale arbejder

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

RAS /RAF /MEK /ERK og PI3K /AKT /mTOR veje repræsenterer grundlæggende signalering transduktion og regulerende net for størstedelen af ​​cellulære fysiologiske processer, såsom proliferation, differentiering og celleoverlevelse.

Disse veje er for det meste aktiveres af ændringer i Ras, B-RAF, PI3K og PTEN gener [1]. Aktivering af sådanne veje er ansvarlig for ukontrolleret celleproliferation og kan bidrage til medikamentresistens. Kombinationsterapier med farmakologiske hæmmere af disse pathways kan have potentielle anvendelser til undertrykkelse af cancercelleproliferation og til gengæld kan være virkningsfuldhed at vende tilbage modstand. Malignt melanom er en god tumormodel at undersøge aktiveringen af ​​RAS /RAF /MEK /ERK og PI3K /AKT /mTOR veje, som det ofte er påvirket af B-RAF

V600E mutation, der forårsager aktivering af MAPK-vejen [2 ]. Det er en aggressiv tumor i huden med en dårlig prognose for patienter med fremskreden sygdom, og det synes at være resistent over for de nuværende behandlingsmetoder.

melanocytisk transformation menes at opstå ved sekventiel akkumulering af genetiske og molekylære forandringer [3 , 4]. Selvom de patogene mekanismer bag melanom udvikling er stadig ukendte, har flere gener og metaboliske veje er vist at bære molekylære ændringer i melanom. Melanomer udviser mutationer i RAS /RAF /mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) pathway. Det er blevet vist, at 50% kutan melanomer udviser B-RAF

V600E mutationer, hvilket resulterer i en aminosyresubstitution i position 600 i B-RAF, fra en valin (V) til en glutaminsyre (E). Denne mutation er kendt for at spille en central rolle i proliferation og overlevelse af melanomceller, gennem aktivering af MAPK-vejen [5]. Især den sker inden aktiveringen segment af kinasedomænet og det resulterer i en forøget aktivitet af selve kinase. Konstitutiv aktivering af kinaseaktiviteten fører til unresponsitivity af negative feedback-mekanismer i MAPK-vejen [6].

Derudover en interaktion mellem MAPK og phosphatidylinositide 3-kinase (PI3K) /AKT pathways er blevet fundet i kutant melanom [7]. Interessant nok antyder disse undersøgelser, at MAPK og AKT pathways aktiveres parallelt og bevis for, at PI3K /AKT og MAPK /ERK1 /2 kaskader er indbyrdes forbundet er i vid udstrækning beskrevet [8, 9, 10]. Der er flere cross-talk punkter mellem disse to veje, hvis koordineret indsats bestemmer celleskæbne [11]. Det er ikke overraskende, at de PI3K /AKT og MAPK veje påvirker hinanden på forskellige stadier af signal formering, både negativt og positivt, hvilket resulterer i en dynamisk og kompleks krydstale. Ifølge disse resultater, kunne MAPK og AKT veje repræsenterer lovende terapeutiske mål for en ellers ødelæggende sygdom.

Computer simuleringer og datamodellering er nyttige til at analysere og øge kendskabet til metaboliske veje og deres komplekse samspil med det formål at forstå mekanismerne i modstandsdygtighed over for konventionel medicinsk behandling i melanom [12, 13, 14].

i dette arbejde udvikler vi en beregningsmæssige model, der simulerer både PI3K /AKT og MAPK veje og deres samspil, for at analysere Cascade reaktioner er ansvarlige for melanom udvikling. Desuden har vi modelleret adfærd malignt melanom A375-cellelinje, der huser B-RAF

V600E mutation, under behandlingen af ​​Dabrafenib, en kommerciel selektiv B-RAF-hæmmer, for nylig godkendt til behandling af patienter med BRAF V600E mutation- positiv fremskreden modermærkekræft [15].

Samlet set denne model kan anvendes til en i silico lab at studere virkningerne af potentielle inhibitorer, der kan forbedre respons på standardbehandlinger.

Metoder

Computational model af MAPK og PI3K /AKT veje

for at forstå virkningerne af B-RAF ændringer på begge RAF-ERK og PI3K-AKT veje vi startede fra modellen udviklet af Brown og samarbejdspartnere [16]. I deres arbejde, forfatterne præsenteret en beregningsmæssige model af epidermal vækstfaktor (EGF) og Nerve Growth Factor (NGF) aktiveret ERK vej hos PC12 celler, som indeholder 13 forskellige protein arter og 16 biokemiske reaktioner. Vores model er udviklet ved hjælp COPASI (kompleks Pathway simulator), en software til simulering og analyse af biokemiske netværk og deres dynamik [17]. Vores model har betydeligt udvidet Brown model. Den består af 48 arter og 48 biokemiske reaktioner.

For at inkludere alle de enheder og deres respektive interaktioner nyttige til målet med denne undersøgelse, vi hentet alle de nødvendige oplysninger fra Kegg (Kyoto Encyclopedia of Gener og genomer) PATHWAY database [18]. Især vi fokuseret på samspillet mellem to specifikke veje: MAPK signalvej (Kegg reference: ko04010) og PI3K-AKT signalvej (Kegg reference: hsa04151). Vi studerede komplekse opførsel af de vigtigste protein kinase kaskader, der involverer den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR), phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat 3-kinase (PIK3CA), RAC serin /threonin-proteinkinase (AKT) og RAF proto -oncogene serin /threonin-proteinkinase (RAF1). Dette uundgåeligt føre os til at overveje de andre signalveje, der viste en korrelation med dem, der kan fremkalde Dabrafenib modstand fænomener. Til dette formål har vi også medtaget i modellen Ras signalvejen (Kegg reference: ko04014) og mTOR-signalvejen (Kegg reference: ko041150). For at undersøge eventuelle mekanismer ikke observeret før

Relative oprindelige koncentration af enheder, der indgår i vores model blev indsamlet fra GSE22301 tilgængelig på GEO (Gene Expression Omnibus) datasæt (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), herunder ekspression profilering af flere melanomacellelinie samt A375 anvendt i denne undersøgelse. Microarray matrix data blev normaliseret ved log transformation hjælp MeV dataanalyse værktøjet [19]. Opsummering, brugte vi Kegg database til at forstå og modellere vejen flow og GEO datasættet at få A375-cellelinje udtryk profilering; Desuden sætter vi værdierne af koncentrationerne af de proteiner, som findes ved Brown et al.

De love, der er omfattet af aktiveringer /deaktiveringer i Brown model var baseret på Henri-Michaelis-konstanten. Denne kinetiske lov er en af ​​de mest almindelige model enzym kinetisk. Dens matematiske form følgende:

Den beskriver hastigheden af ​​enzymatiske reaktioner, hvor “V” repræsenterer den maksimale sats nås af systemet, mens Henri-Michaelis-Menten konstant (km) er den substratkoncentration på som reaktionshastigheden er halvdelen af ​​V [20].

vi ændret lidt den klassiske Henri-Michaelis-Menten lov til at tage hensyn til både underlaget og modifier, der spiller en særlig rolle, når vi overvejet reaktioner, der aktiverede (og /eller deaktiveret) specifikke proteiner. Ligningen for den modificerede Henri-Michaelis-Menten er:

Kcat repræsenterer antallet af enzymatiske reaktioner katalyseret per sekund og ligningen omfatter to typer af substrater. Substrate1 står for modificeringsmidlet af reaktionen mens Substrate2 er det generiske substrat. Det resulterer mere egnet til vores formål, fordi den analyserer forholdet mellem reaktionerne af systemet og deres affinitet for substratet tager i betragtning effektiviteten af ​​involverede modifier.

Alle de biokemiske reaktioner, der anvendes i vores model kan være derfor opdelt i fire hovedklasser:

i)

aktivering /deaktivering reaktioner modelleret med en modificeret Henri-Michaelis-Menten lov (f.eks Raf1Inactive bliver aktiveret (Raf1Active) gennem RasActive);

ii)

reaktioner, der fysiologisk inaktiverer arter, modelleret med masse action lov (f.eks C3G deaktivering);

iii)

proteiner nedbrydning modelleret med masse action lov (f.eks Dabrafenib nedbrydning);

iv)

proteiner produktion modelleret med irreversibel konstant flux lov (f.eks, produktion af fri RTK).

En af målene i modellen var at analysere dynamikken i kritiske knudepunkter i A375 melanomacellelinie huser B-RAF

V600E mutation. Vi derfor modelleret denne cellelinje som følger:

i)

vi introducerede nye arter bRafMutated med samme oprindelige koncentration af bRafInactive på 120000 mmol /ml;

ii)

vi slettet B-RAF aktivering ved Rap1 som de nye arter bRafMutated ikke berørt af denne signalering (det samme gælder for Ras);

iii)

vi hæmmede deaktivering af B-RAF ved Raf1PPtase (som Raf1PPtase ikke længere indflydelse på B-RAF);

iv)

bRafMutated erstatter bRafActive arter i udløser Mek aktivering. Det andet mål ved modellen er at bruge det som et in silico lab at analysere adfærden af ​​specifikke terapeutiske behandlinger mod melanom, især i sine resistensmekanismer, med det formål at foreslå nye strategier, der kan anvendes under disse omstændigheder. Vi har derfor indsat i modellen funktionerne til at reproducere virkningen af ​​Dabrafenib inhibitor i de komplekse dynamik PI3K /AKT-vejen. For at udføre denne opgave, vi tilføjet Dabrafenib arter (i forskellige koncentrationer, se afsnittet Resultater). Derefter modelleret vi to specifikke reaktioner dvs. den normale lægemiddelnedbrydning og den vigtigste virkning af Dabrafenib til inhibering af bRafMutated arter. Fra den specifikke litteratur, er det rapporteret, at halveringstiden af ​​Dabrafenib er 10 timer (Det Europæiske Lægemiddelagenturs hjemmeside: https://www.ema.europa.eu). Vi brugte denne parameter til at indstille den tilhørende masse action lov til at reproducere sin forfald.

Et andet vigtigt aspekt betragtes ikke i Browns model er, at alle receptorer er meget hurtigt udløst af EGF og dermed de forbliver konstitutivt aktiveret, fordi deres model ikke tage hensyn til nogen reaktion af nedbrydning af receptorer. Vi modelleret dette aspekt indsætte en nedbrydningsproces baseret på en irreversibel masse action lov påvirker både de frie og bundne RTK-receptorer. Desuden har den oprindelige model Brown EGF omfatter ikke C3G /Rap1 vej, et grundlæggende centralt punkt for aktivering af B-RAF og dermed på ERK dynamik. Til dette formål modelleret vi aktiveringen af ​​C3G arter gennem bundet RTK-receptoren, og Rap1 aktivering via den aktiverede C3G protein.

Derudover analyserede vi dybt den grundlæggende rolle, AKT proteinkinase i krydstale mellem de to vigtigste veje involveret. Især fokuserede vi på den rolle, AKT om aktivering af mTORC1 vej og på aktivering /deaktivering maskiner af flere proteiner på AKT signalering. Den resulterende implementering af veje model, sammen med den relative sæt af ODE’er kan findes se på figurerne 1 og 2.

aktivering /deaktivering reaktioner (modelleret med en modificeret Henri-Michaelis-Menten ret) er vist på følgende måde: det modificerende dvs. katalysatoren, der udløser reaktionen er vist ved en tynd lys grøn linje slutter med en rombe; de involverede arter er forbundet med pile, der starter med en blå farve (input arter) og slutter med en brun farve (deraf arter). For eksempel bliver Raf1Inactive aktiveret (Raf1Active) gennem RasActive. Reaktioner, fysiologisk inaktiverer arter (modelleret med masseaktion ret) er vist med en pil starter med en blå farve og slutter med en brun farve, for eksempel C3G deaktivering. Proteiner nedbrydning (modelleret med masse action lov) er afbildet med de betragtede arter forbundet med en pil slutning med en tom sæt symbol, for eksempel Dabrafenib nedbrydning. Proteiner produktion (modelleret med irreversibel konstant flux lov) er afbildet med de betragtede arter forbundet med en pil (for eksempel produktion af frie RTK). Arcadia software (https://arcadiapathways.sourceforge.net) er blevet anvendt til at producere den grafiske gengivelse af modellen.

De tilgængelige versioner af Copasi modeller kan tilgås som S1 Arkiv.

Cell line kultur og behandling

A375-cellelinje blev opnået fra ATCC (LGC standarder, Italien). Denne cellelinie afledt fra en 54-årig kvinde med malignt melanom og udgør en god model til undersøgelser af betydningen af ​​MAPK og AKT pathways, fordi den er påvirket af den samme ændring vises i B-RAF-genet (V600E) (Se Cosmic hjemmeside , https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic). Faktisk kan tilstedeværelsen af ​​andre genetiske ændringer, såsom mutationer i KRAS eller NTM gener, bestemme aktiveringen af ​​MAPK-vejen.

A375 melanom cellelinie, opnået fra ATCC (LGC Standards, Italien), blev dyrket i en befugtet 5% CO2 inkubator ved 37 ° C med RPMI-1640 suppleret med 2 mmol /l L-glutamin, 100 IU penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS), købt fra LONZA ( Walkersville, USA). Den A375 blev udpladet i 70 mm celle-dyrkningsskåle ved densitet på 500.000 celler og efter 24h blev behandlet i 48 timer med Dabrafenib (Selleck Chemical, USA) til en slutkoncentration på 2, 1, 0,5, 0,25 og 0,125 nM. Dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma-Aldrich, USA) blev anvendt som kontrol.

Western blot-analyse

Protein profilering af behandlede A375-cellelinier blev analyseret ved western blot under anvendelse af anti-MAP-kinase ERK1 /ERK2 (pThr202 /pThr204) kanin Ab (kat. n. 442.685) og Anti-MAP kinase ERK1 /ERK2 kanin Ab (kat. n. 442.704), som leveres fra Merck Millipore (Darmstadt, Tyskland) for at detektere phosphoryleret og total ERK 1 /2 proteiner. Anti-beta tubulin Ab (ab 15568- Abcam, Cambridge, UK) blev anvendt som housekeeping-gen. Kromogent påvisning af proteiner blev udført med Novex HRP kromogent (Invitrogen, USA). Western blot billeder blev analyseret med billede J software. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt. T-test blev anvendt til statistisk analyse.

Resultater

Vi simulerede vores model under normale generiske vækstfaktor (GF) stimulering betingelser for at kontrollere, at det gav en stærk forbigående aktivering af ERK. Derefter simuleret vi A375-cellelinien med B-RAF mutation. I dette tilfælde, vi forventede forhøjede ERK aktivitet, som er karakteristisk for B-RAF

V600E muterede melanomer. Figur 3 viser dynamikken i både aktiverede ERK (pERK) og B-RAF. Venstre panel fremhæver den normale tilstand tilfældet; medens, højre panel viser B-RAF muteret A375 cellelinie scenario. Endelig simuleringen forudsiger korrekt den forventede adfærd dvs. arten ErkActive har en konstant forhøjet aktivitet. På grund af de ulineariteter i den præsenterede model og til det store antal knuder og interaktioner inde vejen, selv om der er en klar sammenhæng mellem bRafActive og ErkActive, kan vi ikke sige, at der er en lineær sammenhæng mellem de to.

Venstre panel viser opførsel under normale GF stimulation, mens højre panel viser dynamikken med B-RAF (bRafMutated) mutation i A375-cellelinjer.

i særdeleshed højere ErkActive ikke overholdes sandsynligvis på grund af det faktum, at ErkActive er allerede tæt på de tærskelværdier og /eller på grund af bidraget fra andre knudepunkter i vejen, der kan påvirke det endelige resultat.

Desuden har vi simulerede adfærd A375 cellelinier under forskellige koncentrationer af Dabrafenib inhibitor. B-RAF hæmning resulterer i begrænsning af pERK aktivitet. Følgelig i tabel 1 den procentdel af inhibering af pERK er vist som følge af pERK og ERK-forhold. Overensstemmende resultater blev opnået analyse in vitro og in silico-data.

Dynamikken i både pERK og B-RAF muterede blev modelleret (Fig 4). ERK in silico-koncentrationen blev indstillet til 600000 mmol /ml. Fem paneler er vist. Hvert panel afbilder pERK, B-RAF muteret og Dabrafenib dynamik i 48 timer af simulering ved forskellige Dabrafenib dosering dvs. 0,125 nM (A), 0,250 nM (B), 0,500 nM (C), 1,0 nM (D) og 2,0 nM (E). Når ingen behandling administreres (DMSO) pERK koncentration opnået 571950 mmol /ml på tidspunktet 48 timer. Med forskellige doser af Dabrafenib, Perk koncentrationer nåede 529602 mmol /ml (A), 368352 mmol /ml (B), 207518 mmol /ml (C), 106758 mmol /ml (D) og 53385 mmol /ml (E), der viser henholdsvis den procentvise inhibering rapporteret i tabel 1.

perk koncentrationer falde i Dabrafenib behandling i A375 melanoma cellelinie. Adfærd pERK er direkte korreleret til Dabrafenib koncentration. Forskellige doseringer af Dabrafenib er vist (1 nM = 1e-9 mmol /ml): 1.25e-10 mmol /ml (A), 2.5e-10 mmol /ml (B), 5e-10 mmol /ml (C), 1e -9 mmol /ml (D) og 2e-9 mmol /ml (E). I alle panelerne de rigtige y-akse stiplede linier repræsenterer bRafMutated koncentrationer mens optrukne linjer repræsenterer Dabrafenib koncentrationer.

Reduktionen af ​​Perk-koncentrationer er i overensstemmelse med den observeret in vitro.

fig 5 fremhæver western blotting plots. Også i dette tilfælde, opnåede vi en god aftale med de i silico resultater. Afslutningsvis både fra modelresultater og fra in vivo forsøg, kan vi konstatere, at p-ERK niveauet falder ned på grund af inhibitor aktivitet Dabrafenib løbet B-RAFV600E protein. Vi analyserede p-ERK, da det er en af ​​de vigtigste proteinkinase involveret i celleproliferation signalering. Et vigtigt aspekt i forbindelse med inhiberingen af ​​B-RAFV600E protein er, at en lille del af behandlede melanompatienter udvikler resistensmekanismer, der gør terapien ikke mere effektive. Modellen kan være nyttigt at analysere de komplekse PI3K /AKT og MAPK veje for at opdage proteiner, der kan forårsage disse modstand fænomener.

Western blot analyse af p-Erk og total ERK i A375 melanom cellelinie efter behandling med forskellige doser af Dabrafenib i 48 timer (A). p-ERK signal blev normaliseret med total ERK signal (B), SD og hjælp af de normaliserede p-ERK værdier blev rapporteret.

Konklusioner

Vi præsenteret en beregningsmæssige model, der simulerer både PI3K /AKT og MAPK veje og deres interaktion med henblik på at analysere de kaskade reaktioner er ansvarlige for melanom udvikling. Vi simulerede en terapi indgriben dvs. administrationen af ​​en kendt B-RAF-hæmmer, Dabrafenib. Denne undersøgelse har vist, hvordan beregningsmodeller kan være nyttige redskaber til at undersøge og sammenligne den biologiske opførsel af signal transduktion path- måder, som de kan foreslå nye hypoteser til at forklare de observerede biologiske data og hjælpe forstå dynamikken i hvordan pathway funktioner. Desuden kan beregningsmodeller let anvendes til at undersøge forskellige sygdomstilstande og foreslå, hvordan medicinsk behandling kunne forbedres for bedre at bekæmpe virkningerne af sygdommen. Vi mener, at vores model er en god repræsentation af PI3K /AKT og MAPK med aktiveret ERK vej, som kan udvides og anvendes i fremtiden for yderligere at undersøge dynamikken i resistente mekanismer for at foreslå nye indgreb for at foreslå nye terapeutiske interventioner.

Støtte Information

S1 Arkiv. I zip arkiv, er der tre forskellige tilgængelige versioner af modellen: File PI3K_AKT_Final_V2.1.cps, fysiologisk model dvs. ingen B-RAF-mutation; Fil PI3K_AKT_Final_V2.1_A375.cps, A375 cellelinie model dvs. med B-RAF-mutation; Fil PI3K_AKT_Final_V2.1_A375_Dabrafenib.cps, komplet model med både B-RAF mutation og Dabrafenib inhibitor indstillet til den laveste dosis

doi:. 10,1371 /journal.pone.0152104.s001

(ZIP)