Abstrakt
Vores tidligere undersøgelse har vist, at mesothelin (MSLN) er en potentiel immunterapeutisk mål for kræft i bugspytkirtlen. Her, vi yderligere undersøgt immunogeniciteten af kimærisk murine MSLN-viruslignende partikler (mMSLN-VLP’er), deres evne til at bryde tolerance over mMSLN, et selv-antigen, og tydes mekanismen for immunreaktioner ved mMSLN-VLP immunisering under anvendelse af en pancreascancer (PC) musemodel. Ud over det, vi har fundet med xenogene menneskelig MSLN-VLP (hMSLN-VLP), mMSLN-VLP immunisering var i stand til at bryde tolerance over for iboende MSLN og montere mMSLN-specifikke, cytotoksiske CD8
+ T-celler, der førte til en signifikant reduktion i tumorvolumen og forlænget overlevelse i en ortotopisk PC musemodel. Desuden, CD4
+ Foxp3
+ regulatoriske T-celler (tregs) var progressivt faldt i både milt og tumorvæv efter mMSLN-VLP immunisering og dette var i det mindste delvis skyldes forhøjede niveauer af IL-6 produktion fra aktiveret plasmocytoid dendritiske celle (pDC) -lignende celler efter mMSLN-VLP immunisering. Desuden mMSLN-VLP behandling primært reducerede hyppigheden af CD4
+ foxp3
+ ICOS
– treg delmængde. Men mMSLN-VLP induceret IL-6 produktionen også steget ICOSL udtryk på pDC-lignende celler, som støttede udbredelsen af immunosuppressive CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ Treg celler. Denne undersøgelse viser, at mMSLN-VLP immunisering kan kontrollere PC progression ved effektivt at montere et immunrespons mod mMSLN, en tumor selv-antigen, og ændring af den immunsuppressive tumormikromiljøet via aktivering af pdCs-lignende celler og reduktion i hyppigheden af CD4
+ foxp3
+ ICOS
– Treg celler. Men kombinationsbehandlinger vil sandsynligvis brug for, skal anvendes for at målrette resterende CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ Treg celler
Henvisning:. Zhang S, Yong LK, Li D, Cubas R, Chen C, Yao Q (2013) Mesothelin viruslignende partikel Vaccination Controls kræft i bugspytkirtlen vækst gennem CD8
+ T-celle Induktion og reduktion i hyppigheden af CD4
+ foxp3
+ ICOS
– Regulatory T Cells. PLoS ONE 8 (7): e68303. doi: 10,1371 /journal.pone.0068303
Redaktør: Hiroshi Shiku, Mie University Graduate School of Medicine, Japan
Modtaget: 11. juli, 2012; Accepteret: 4 juni 2013; Udgivet: 9 jul 2013
Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af Dan L Duncan Cancer center pilot tilskud fra BCM og National Institutes of Health tilskud CA140828 for Q. Yao og AI053831 for S. Zhang. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere eksterne midler modtaget for denne undersøgelse
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Kræft i bugspytkirtlen er stadig en ødelæggende, meget dødelig sygdom. selv med de nuværende videnskabelige fremskridt. Denne sygdom udgør en enorm udfordring for klinikere og forskere, fordi det er naturligt resistente over for forskellige former for behandlinger [1]. Derfor er der et presserende behov for at udvikle nye behandlingsformer for kræft i bugspytkirtlen. Blandt de seneste terapeutiske tilgange, har cancervacciner vist nogle lovende resultater for sygdomsbekæmpelse [2]. Mange er blevet rapporteret at være lovende til at inducere
in vivo
tumorregression [XPATH FEJL:. Ukendt variabel “START2”], [4]. Men den mekanisme for, hvordan tumorvacciner held kan styre tumorprogression er stadig uklar.
tumorspecifik cytotoksisk T-lymfocyt (CTL) induktion er blevet vist at være afgørende for udryddelse af cancerceller ved effektiv anti-tumor vacciner 5,6 siden CTL’er kan være specifikke for et bestemt antigen udtrykkes af tumorceller. Desuden har den rolle, regulatoriske T-celler (tregs) i anti-tumor immunitet blevet stærkt undersøgt og belyst [7]. Treg celler identificeret som CD4
+ CD25
+ foxp3
+ repræsenterer den primære hæmmende lymfocyt befolkning [8], [9]. Fjernelse af Treg celler ved
in vivo
administration af et anti-CD25-antistof er blevet vist at ophæve immunsuppression, begrænse tumorvækst, og fremme tumorafstødning i mus [10]. Den co-stimulerende molekyle ICOS er en af de regulatoriske proteiner udtrykt på CD4
+ CD25
+ foxp3
+ tregs [11]. Udvidelsen af tregs kan knyttes til ICOS signalering, som også deltager i udviklingen af antigenspecifikke tregs [12]. En nylig rapport har vist, at foxp3
+ tregs har to adskilte delmængder med forskellige biologiske funktioner baseret på ICOS udtryk. En af disse delmængder, CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ tregs, udskiller IL-10 og TGF-β, som undertrykker dendritiske celler (DC’er) og CD4
+ hjælper T-celler. Den anden delmængde, CD4
+ foxp3
+ ICOS
– tregs, kun producerer TGF-β [13]. En undersøgelse har også vist, at murine tregs indeholder hyperproliferative og død-tilbøjelige delmængder med forskellen ICOS udtryk [14]. Imidlertid har svaret af disse to Treg undergrupper til tumor immunoterapeutiske vaccination ikke blevet undersøgt.
induktion og generering af foxp3
+ tregs er forbundet med DC-funktion [15]. Selvom både konventionelle DCs (CDCS, myeloid DC) og plasmacytoide DCs (pdCs) kan interagere med foxp3
+ Treg celler, kun pdCs er rapporteret at have en evne til at prime CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ tregs [13]. pdCs er kendt som en primær DC delmængde i anti-virale immunresponser [16]. Efter aktivering og modning, de udskiller store niveauer af type I-interferoner, som aktiverer andre medfødte immunceller som CDC og NK-celler og bro adaptive immunceller såsom T-celler og B-celler [17]. pdCs ikke blot have kapacitet til at præsentere MHC-II epitoper for at aktivere CD4
+ T-celler, men kan også cross-tilstedeværende MHC-I-epitoper at udvide CD8
+ T-celler [18]. Induktionen af CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ tregs af pdCs, men ikke CDC, er koblet til ICOS-ligand udtryk på pdCs [13].
Effektiviteten af kræft immunterapeutiske tilgange stærkt afhængig immunogeniciteten af det målrettede tumor-associeret antigen. Mesothelin (MSLN), er en membran glycoprotein normalt udtrykkes på mesotelceller, men er overudtrykt i de fleste pancreascancer [19] – [21]. Den begrænsede grad af MSLN ekspression i normale celler gør det til en ordentlig terapeutisk mål for cancervacciner [22]. Blandt de forskellige vaccineteknologier der bærer og præsentere tumorantigener til værten, kan viruslignende partikler (VLP’er) være den mest egnede til at inducere både humorale og cellulære immunresponser. Som en analog af virus kan kimæriske VLP’er betragtes inkompetente virus, som har den komplette virus struktur og virale proteinbestanddele at stimulere stærke cellulære reaktioner uden virale nukleinsyrer. VLP’er kan inducere forebyggende eller terapeutisk immunitet, ikke kun mod tumor-relaterede virus infektion, som kan føre til tumorigenese [23], [24], men de kan også inhibere tumorvækst ved specifikt rettet mod tumorassocierede antigener [25]. Vi har tidligere vist, at kimære hMSLN-VLP effektivt kan mindske tumor vækst gennem en reduktion i hyppigheden af CD4
+ foxp3
+ tregs i en ortotopisk bugspytkirtelkræft musemodel [21]. I denne undersøgelse, vi yderligere vurderet, om selv-antigen mMSLN indarbejdet på VLP kan bryde tolerancen til mMSLN, montere adaptive immunrespons og kontrollere tumor progression. For yderligere at forstå virkningsmekanismen, hvorved VLP immunisering kan opnå tumorregression, vi også udforsket egenskaber DC induktion ved mMSLN-VLP og cytokiner involveret i undertrykkelse af CD4
+ foxp3
+ Treg celler.
Resultater
mMSLN-VLP vaccination Forhindrer kræft i bugspytkirtlen vækst og Fremmer overlevelse i tumor-bærende mus
i vores tidligere rapport, viste vi, at immunisering med humant MSLN-VLP effektivt kunne styre tumor vækst i en musemodel, som førte til en styrkelse af cytotoksiske immunreaktioner mod bugspytkirtelkræftceller gennem en reduktion i hyppigheden af Treg celler [21]. Eftersom human og muse MSLN har kun omkring 60% homologi, kan den stærke immunreaktion skyldes en xenogen reaktion på menneskelig MSLN. Men om immunisering med mMSLN-VLP kan bryde tolerance og inducere immunresponser på mMSLN, et selv-antigen, i forbindelse med en VLP præsentation, og hvorvidt mMSLN-VLP har en lignende effekt i fremkaldelse af et anti-tumor respons ved at modulere tregs er ikke blevet undersøgt. At evaluere det immunterapeutiske effekt af mMSLN-VLP immunisering blev dyrene immuniseret med enten mMSLN-VLP eller SIV VLP som en kontrol for VLP “backbone” eller PBS i tumorbærende mus. Som vist i fig. 1A, mMSLN-VLP immunisering betydeligt reduceret tumor volumen (0,92 ± 0,39) sammenlignet med de to kontrolgrupper (2,49 ± 0,43 i SIV-VLP og 3,18 ± 0,38 i PBS kontrolgruppen) (
s
0,05) . Der var ingen statistisk forskel i tumor byrde mellem PBS og SIV-VLP immunisering grupper. Endvidere fandt vi, at alle mus behandlet med PBS eller SIV-VLP fik en 1 ml til 4 ml ascites eller blodige ascites i bughulen. Der var mindre væske ( 1 ml) i mMSLN-VLP vaccinerede gruppe. Derudover som vist i fig. 1B, med SIV-VLP immunisering var der en let forlængede overlevelse endnu ikke statistisk signifikant sammenlignet med PBS-kontrol gruppen (
s
= 0,1947). Tværtimod mMSLN-VLP immunisering signifikant forlænget overlevelse tumorbærende mus sammenlignet med PBS og SIV-VLP grupper (
s
= 0,0012 og
s
= 0,0198, henholdsvis) . Desuden mere end 50% af de mMSLN-VLP-immuniserede mus var stadig i live på dag 30.
Panc02 celler (7 × 10
5) blev orthotopisk implanteret i pancreas fra 8 uger gamle C57BL /6 mus på dag 0. Tre immuniseringer på dag 3, 13 og 21 blev påført ved ip rute med forskellige VLP’er. Musene blev inddelt i tre grupper, der var immuniseret med enten 100 pi PBS eller 100 ug /100 pi af SIV-VLP eller 100 ug /100 pi MSLN-VLP. EN). Reduceret tumor byrde i mMSLN-VLP immuniserede grupper. Tumorstørrelse mellem hver gruppe blev statistisk sammenlignet ved student t-test. *
s
0,05. B). Forlænget overlevelse af mMSLN-VLP’er immuniserede mus grupper Kaplan-Meier Survival Analysis.
P
værdier blev beregnet og noteret på figuren. Disse var repræsentative data udvalgt fra fire uafhængige forsøg med A) fem eller B) mindst 9 mus per gruppe.
mMSLN-VLP Vaccination Aktiverer CD8
+ T-celler og Genererer MSLN-Specific Functional CD8
+ T-celler
Vores tidligere rapporter har vist, at VLP’er har en høj kapacitet til at aktivere Th1-orienterede cellulære immunresponser og generere specifikke cytotoksiske T-lymfocytter i vaccinerede mus [26], [27]. Som vist i fig. 2A, var der en stigning i hyppigheden af CD8
+ CD62L
– T-celler efter mMSLN-VLP behandling (46,5% vs. 19,6% i PBS), tyder på, at mMSLN-VLP kan stimulere generelle CD8
+ T-celle-aktivering.
17
th dag efter tumorimplantation og efter én gang VLP vaccination på dag 3 blev musene aflivet for immunrespons analyse. FACSCalibur blev anvendt til at erhverve og FlowJo software blev brugt til at analysere data. EN). General CD8
+ T-celle aktivering i PBS kontrolgruppen og VLP’erne immuniserede mus grupper. Celler blev gated på CD8
+ T-celler, T-celleaktivering markør CD62L-ekspression blev vist i histogrammet. B). MSLN-specifikke tetramer
+ CD8
+ T celler induktion. Splenocytter blev farvet med PE-mærket MSLN-specifik tetramer. C). MSLN-specifik IFN-γ producerende CD8
+ T-celle-induktion. Splenocytter blev re-stimuleret med MSLN peptid i 6 timer i nærværelse af Golgi blokering forbindelsen
in vitro
. Efter fiksering og permeabilisering, de forbehandlede splenocytter blev farvet med PE-mærket anti IFN-γ antistof. D). MSLN-specifik CTL-induktion mod Panc02 celler. Splenocytterne blev re-stimuleret
in vitro
i 6 dage i nærvær af IL-2. De forbehandlede splenocytter blev talt og anvendt som effecter celler. Panc 02 celler blev anvendt som målceller. Effecter celler og målceller blev blandet med forskellige E: T-forhold og inkuberet i 4 timer. Procentdelen af lyse blev beregnet som:% cytotoksicitet = [(Eksperimentel – Effecter Spontan – Target Spontan) /(Target Maximum – Target Spontan)] × 100. Vist var repræsentative data udvalgt fra to uafhængige forsøg med fem mus per gruppe. (Statistisk betydninger vises, angiver *
s
0,05.)
For at vurdere generation af mMSLN-specifikke CD8
+ T-celler i murine splenocytter efter immunisering. , et MHC-i: MSLN peptid tetramer blev anvendt til at bestemme procentdelen af mMSLN CD8
+ T-celler. Som vist i fig. 2B, procentdelen af tetramer + CD8
+ T-celler i mMSLN-VLP immuniserede grupper var ca. 3-folder højere end i PBS kontrolgruppen (3,21% versus 1,18%). SIV-VLP immunisering ikke især øge hyppigheden af mMSLN-specifikke CD8
+ T-celler (1,35%). Derfor kan mMSLN-VLP immunisering inducere mMSLN-specifikke CD8
+ T-celler
Aktiveret effektor CD8
+ T-celler kan opdeles i to forskellige grupper:. Cytokin-secernerende CD8
+ T celler og cytotoksiske T-lymfocytter [28]. Efter MSLN-specifikt peptid stimulering blev MSLN CD8
+ T-celler, der secernerer IFN-γ detekteret ved intracellulær cytokin-farvning. Som afbildet i fig. 2C, procentdelen af MSLN-specifik IFN-γ-udskillende effecter CD8
+ T celler i mMSLN-VLP immuniserede gruppe var ca. 2-folds højere end i PBS-gruppen (2,55% versus 1,42%). Der var imidlertid ingen forøgelse i frekvensen af disse celler efter SIV-VLP immunisering (1,77%). At vurdere kapaciteten i VLP-inducerede CTL’er til direkte dræbe tumorceller, en
in vitro
tumordrab assay blev udført under anvendelse Panc02 celler som målceller, som blev vist at overudtrykke MSLN [21]. Som vist i fig. 2D, den cytolytiske effektivitet CTL’er til Panc02 celler viste sig også at være den højeste i mMSLN-VLP vaccineret grupper i forholdet 120:1. Disse resultater tyder på, at den specifikke effektor CD8
+ T celler induceret af mMSLN-VLP immunisering kan spille en vigtig rolle i direkte kontrollerende tumorregression.
mMSLN-VLP Vaccination Undertrykker Både Systemisk og Tumor infiltrerer CD3e
+ CD4
+ foxp3
+ tregs
Selv om vi har vist, at VLP immunisering kan reducere antallet af CD4
+ foxp3
+ tregs celler i murine milt og i tumor væv, fænotype og biologi af disse celler stadig remainslargely ukendte [21]. Som vist i fig. 3, næsten alle af foxp3
+ celler i tumor-bærende mus var til stede i CD3e
+ CD4
+ T-celle population siden CD3e
+ CD8a
+ foxp3
+ og CD3e
+ CD4
-CD8a
-foxp3
+ delmængder var under 0,5%. Andelen af CD3e
+ CD4
+ foxp3
+ tregs efter mMSLN-VLP immunisering (12,9 ± 1,83%) var lavere end i PBS kontrolgruppen (17,81 ± 1,26%) (p 0,05). SIV-VLP immunisering medførte også et fald i populationen af tregs, omend i mindre grad (14,4 ± 2,19%) (p 0,05). Derfor faldt Foxp3
+ celler i tumor-bærende mus tilhørte den konventionelle CD3e
+ CD4
+ foxp3
+ treg cellegruppe, da VLP’er ikke inducerede eller påvirke CD4
– foxp3
+ Treg celler i murine milt. Derfor kan VLP immunisering reducere den systemiske befolkning CD3e
+ CD4
+ foxp3
+ tregs i tumor-bærende mus.
A). Ved 12
th dag efter tumorimplantation og efter én gang VLP vaccination på dag 3 blev musene aflivet for immunrespons analyse. Omkring 10
6 splenocytter blev inkuberet med de passende fortyndede fluorescerende-konjugerede antistoffer, herunder CD3e, CD4, CD8, og foxp3. Foxp3
+ celler blev analyseret i tre T-celle delmængder: CD4
+ CD8
-, CD4
-CD8
+, og CD4
-CD8
-. Disse var repræsentative data fra tre uafhængige forsøg med mindst tre mus per gruppe. B). CD4
+ Foxp3
+ T celler isoleret fra tumor-bærende splenocytter undertrykte Tresp celler spredning. Co-dyrkning CD4
+ CD25
+ tregs og CD4
+ CD25
– Tresps (CFSE farvet) ved forskellige nøgletal 1:8, 1:4, og 1:2. CFSE mærket Tresps proliferation blev analyseret ved FACS. Numre på CFSE
høj peak angiver procent af udelte celler. C). Den undertrykkende aktivitet af CD4
+ CD25
+ tregs på CD4
+ CD25
– Tresp celledeling på forskellige treg: Tresps forhold (x-akse). Y-aksen angiver procent af undertrykkelse på Tresp celler spredning aktivitet.
For at vise, at CD4
+ foxp3
+ T-celler isoleret fra splenocytter af tumor-bærende mus besidder undertrykkende aktivitet, vi udført en CFSE-baserede treg suppression assay. For at opnå levende celler for dette fem dage co-kultur assay, vi brugte CD4 og CD25 overflademarkører at isolere CD4
+ CD25
+ tregs. Vi udførte intracellulær farvning af Foxp3 markør for at bekræfte, at størstedelen af isolerede CD4
+ CD25
+ tregs var også CD4
+ foxp3
+ T-celler. Som vist i fig. S1, gated på CD4
+ CD25
+ celler, omkring 87% af de celler farvet positive for Foxp3
+. Den CFSE-baserede Treg suppression assay blev udført ved co-dyrkning af CD4
+ CD25
+ tregs og CD4
+ CD25
– responder T-celler (Tresps) (CFSE farves) isoleret fra milten fra PC tumorbærende mus. Som vist i fig. 3B, når der ikke Treg celler blev tilsat, det meste af Tresp celler undergik proliferation og kun 36,5% forblev udelt. Som forholdet mellem Treg celler til Tresp celler steg i co-kultur, blev observeret suppression af Tresp celleproliferation. Procentdelen af udelte Tresp celler steg fra 36,5% (ingen treg tilføjet) til 50,7%, 62,2%, og 84,5% ved treg: Tresp forhold på 1:08, 1:04, og 1:02 hhv. Som afbildet i fig. 3C, den undertrykkende aktivitet af CD4
+ CD25
+ tregs på CD4
+ CD25
– Tresp celleproliferation var 22%, når 12,5% tregs var til stede i co-kultur, og det øges til 40% og 76%, når 25% og 50% af tregs var til stede, henholdsvis. Disse data støtter kraftigt den opfattelse, at CD4
+ Foxp3
+ T-celler i tumor-bærende splenocytter besidder undertrykkende aktivitet.
For at bestemme fænotype af foxp3
+ tregs i tumorvæv, immunofluorescens farvning blev udført. I tumorvæv fra mus, der ikke modtog mMSLN-VLP immunisering fandt vi, at de fleste Foxp3
+ tregs var infiltreret i tumorvæv fra blodkarrene og placeret nær tumorvaskulaturen (fig. S2A). Derudover foxp3
+ tregs i tumorvævet var af fænotypen CD4
+ CD8a
– (. Fig S2B), og en stor del af CD8a
+ T-celler (grønne farvede celler) blev placeret siden foxp3
+ T-celler (røde farvede celler) (fig. S2C). Sammenligne antallet af foxp3
+ celleantal mellem immuniserede og ikke-immuniserede grupper, der Foxp3
+ -celler reduceret i VLP-immuniserede mus tumorvæv (fig. S2D). Denne observation indebærer, at foxp3
+ tregs kan påberåbe sig direkte interaktion med CD8a
+ T-celler til at udøve sin undertrykkende effekt på CD8
+ T-celle anti-tumor-funktion i den ikke-immuniserede mus gruppe, hvorimod, VLP immunisering reducerer foxp3
+ treg befolkning og derved undertrykkelse udøves af foxp3
+ tregs i tumorvævet kan afhjælpes.
høje niveauer af IL-6-induktion efter mMSLN-VLP er delvist ansvarlig for treg Nedregulering
IL-6 blev rapporteret til at hæmme naturlige forekommende foxp3
+ tregs. For at vurdere, om mMSLN-VLP immunisering kunne fremkalde IL-6 produktion blev begge splenocytter og JAWSII celler bruges til stimulation
in vitro
med mMSLN-VLP. Som vist i fig. 4A, var der en betydelig stigning i IL-6-secernerende DC’er i mMSLN-VLP behandlede gruppe sammenlignet med den PBS-kontrolgruppen (22,8% versus 3,21%). Endvidere blev forbedret IL-6-sekretion fra murine splenocytter også detekteres ved den mMSLN-VLP stimulation. Der var 100 gange forøgelse i niveauerne af IL-6 secerneret fra splenocytter i mMSLN-VLP behandlede gruppe sammenlignet med PBS-kontrol gruppen. Dette antyder, at mMSLN-VLP har kapacitet til at stimulere lymfocytter, specielt DC’er, og inducerer deres sekretion af høje niveauer af IL-6.
A). Øget IL-6 producerende JAWSII celler og forhøjet IL-6 niveauer i lymfocytter kulturmedier på mMSLN-VLP behandling. JAWSII celler blev stimuleret med MSLN-VLP (5 ug /ml) i 12 timer og intracellulær IL-6-farvning blev udført. Lymfocytter blev fremstillet ud fra milten fra naive B6 mus. Efter inkubation med MSLN-VLP i 24 timer blev supernatanten opsamlet til bestemmelse af IL-6 koncentrationer af Bio-Plex. B). Delvis redning af undertrykkende effekt af mMSLN-VLP stimulation på foxp3
+ Treg celler ved IL-6 neutralisering. MSLN-VLP med eller uden IL-6 neutraliserende Ab eller isotypekontrol-Ab blev tilsat til lymfocytter kultur i 3 dage. Den foxp3
+ -celler blev farvet ved anvendelse af foxp3 intracellulær farvning kit. Dataene blev erhvervet for flowcytometri analyse gated på CD3
+ og CD4
+ T-celler. Vist var repræsentative data fra tre til fem uafhængige forsøg. (Statistisk betydninger vises, ** angiver
s
. 0,01).
For at løse, om reduktionen i foxp3
+ tregs af mMSLN-VLP behandling blev medieret af IL-6, blev IL-6 neutraliserende antistof påføres under VLP stimulering og en isotype kontrol-antistof blev anvendt som kontrol. Som vist i fig. 4B, procentdelen af foxp3
+ tregs var 12,7% i CD3
+ CD4
+ gated celler fra friske naive B6 mus efter 3 dages inkubation. Men andelen af foxp3
+ tregs blev reduceret med mMSLN-VLP behandling med eller uden isotypekontrolantistof (6,51% og 6,18%). Følgelig IL-6 neutraliserende antistof var i stand til delvist at redde reduktion i hyppigheden af foxp3
+ Treg celler ved ca. 32% (8,16% i forhold til 6,18% i mMSLN-VLP eneste behandling). Disse data indikerer, at IL-6 kan spille en rolle i reduktionen af foxp3
+ tregs af mMSLN-VLP immunisering.
mMSLN-VLP Vaccination kan Selektivt Undertryk en delmængde af CD4
+ Foxp3
+ ICOS
– tregs
Funktionelle molekyler såsom CTLA-4, CD25 og CD44 udtrykt på overfladen af foxp3
+ tregs er afgørende dikterer målsøgende, funktion og overlevelse kapacitet af disse celler. For yderligere at løse, hvordan VLP påvirker foxp3
+ treg biologi, blev flere vigtige funktionelle molekyler farves. I forhold til PBS-gruppen, var der ingen tydelige forskelle i hyppigheden af CD4
+ foxp3
+ CTLA-4
+ tregs (fig. 5A), CD4
+ foxp3
+ CD25
+ tregs (fig. 5B), CD4
+ foxp3
+ CD44
hi tregs (fig. 5C) efter VLP immunisering. Den inhiberende molekyle PD-1 og co-stimulerende molekyle CD40L havde en lav ekspressionsniveau i foxp3
+ tregs (fig. 5D). Procentdelen og MFI’er til CD4
+ foxp3
+ PD-1
+ og CD4
+ foxp3
+ CD40L
+ tregs i VLP grupper var meget lig disse værdier i PBS kontrolgruppen. Men sammenlignet med PBS behandlinger (35,7%), den procent af CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ tregs i VLP behandlede grupper blev øget. Den højeste procentdel af CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ treg delmængde blev observeret efter mMSLN-VLP immunisering (59,8%). Procentdelen i SIV-VLP-behandlede mus var 54,0% (fig. 5F). Ved at korrelere ovennævnte data til faldet i absolutte antal foxp3
+ celler og stigningen i andelen af ICOS
+ celler i foxp3
+ treg gruppe disse data tyder på, at reduktionen i foxp3
+ tregs svarer til befolkningen i CD4
+ foxp3
+ ICOS
– tregs men ikke til CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ tregs. ICOS kan derfor spille en kritisk rolle i tumoren undertrykkende funktion udøves af tregs i tumorbærende mus. Disse resultater antyder, at selv om mMSLN-VLP immunisering kan reducere den samlede hyppighed af Treg celler disse er hovedsagelig fra CD4
+ foxp3
+ ICOS
– Treg celledelmængde, men disse tregs tilhører CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ delmængde synes at være fastholdt.
12
th dag efter tumorimplantation og efter én gang VLP vaccination på dag 3, blev musene aflivet for immun respons analyse. Omkring 10
6 splenocytter blev inkuberet med de passende fortyndede fluorescerende-konjugerede antistoffer, herunder CD4, foxp3, CTLA-4, CD25, CD44, PD-1, CD40L, og ICOS. FACSCalibur blev anvendt til at erhverve og FlowJo software blev brugt til at analysere data. Cellerne blev gated på CD4
+ foxp3
+ befolkning og histogram af forskellig molekyle udtryk i forskellige forsøgsgrupper blev præsenteret i A). CTLA-4; B). CD25; C). CD44; D). PD-1; E). CD40L; F). ICOS. Vist var repræsentative data fra tre forsøg med mindst tre mus per gruppe. (Statistisk betydninger vises, ** angiver
s
. 0,01).
For at bestemme tilstedeværelsen af både Treg celle-undergrupper i bugspytkirtlen kræftpatienter, vævsprøver blev analyseret af immunfluorescensfarvning. Som vist i fig. S3A, der var en høj tæthed af CD3
+ foxp3
+ tregs i pancreas tumorvæv og mere end halvdelen af disse foxp3
+ tregs var ICOS
+ (fig. S3B). Disse data antyder, at foxp3
+ tregs spiller en vigtig rolle i patogenesen af kræft i bugspytkirtlen, og begge foxp3
+ ICOS
+ og foxp3
+ ICOS
– tregs subpopulationer er involveret i immun undertrykkelse i tumorvæv.
mMSLN-VLP Behandling Aktiverer pdCs og opregulerer ICOSL på pdCs gennem IL-6 til Vedligehold CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ Treg Celler, men ikke CD4
+ foxp3
+ ICOS
– Treg Celler
Tidligere rapporter har vist, at pdCs udtrykker høje ICOSL, og samspillet mellem ICOS og ICOSL er vigtigt for homøostase af CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ Treg celler [13], [29]. Siden mMSLN-VLP immunisering påvirker hyppigheden af CD4
+ foxp3
+ ICOS
– Treg celler, men ikke CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ Treg-celler, en af de mulige forklaringer på dette fortrinsret vedligeholdelse af CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ Treg celler kan skyldes mMSLN-VLP medieret opregulering af ICOSL på pdCs. For at undersøge, om mMSLN-VLP kunne aktivere pdCs, en mus DC cellelinie, JAWSII, blev anvendt. LPS blev anvendt som en kontrol for stimulering DC’er. Som vist i fig. 6A, LPS stimulering øget CD11b udtryk betydeligt i forhold til PBS behandling (84,6% versus 28,0%). Alligevel mMSLN-VLP vid udstrækning faldt ekspressionen af CD11b (9,14%). I modsætning hertil ekspressionen af B220 og Gr-1 var dramatisk opreguleret efter mMSLN-VLP behandling (95,5% og 86,4%). B220 og Gr-1 er blevet identificeret som primære markører for pdCs. Der var kun lave niveauer af B220 og Gr-1-ekspression efter PBS og LPS behandlinger (10,3% og 10,4% i PBS, 19,7% og 17,5% i LPS-behandling). Disse data tyder på, at mMSLN-VLP kan fremme pdCs-lignende celler, mens LPS har en præference for at aktivere CDC-lignende celler.
Om 10
7 JAWSII celler blev stimuleret med enten PBS, LPS (1 pg /ml), eller MSLN-VLP (5 ug /ml) i komplet alfa-medier med 5 ng /ml rmGM-CSF. Efter 24 timers inkubation blev celleoverflademarkører farves og erhvervet af FACSCalibur. EN). Angivelse af CD11b, B220, og Gr-1 ved forskellig behandling af PBS, LPS, eller mMSLN-VLP i JAWSII celler. B). Ekspression af ICOSL i PBS, mMSLN-VLP eller IL-6 inducerede pdCs. C). Ekspression af ICOS på CD4
+ foxp3
+ tregs. D). Procentdel af Ki-67 farvning celler i både CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ tregs og CD4
+ foxp3
+ ICOS
– tregs. Flere celleoverflademarkører var pletter og analyse af subpopulation fænotyper blev gjort ved hjælp af FACSCalibur og FlowJo software. Vist var repræsentative data fra tre til seks uafhængige forsøg. (Statistisk betydninger vises, ** angiver
s
. 0,01).
For at bestemme om mMSLN-VLP aktiverede pdCs-lignende celler udtrykker forhøjet ICOSL, eller om mMSLN- VLP induceret IL-6 kan opregulere ICOSL på pdCs blev PBS, mMSLN-VLP (10 ug /ml) eller IL-6 (20 ng /ml) anvendt til at stimulere splenocytter og farves for overfladen ICOSL på gated pdCs. Som vist i fig. 6B, procentdelen af ICOSL-udtrykkende celler i mMSLN-VLP aktiverede pdCs eller IL-6 aktiverede pdCs var 12,4% og 12,3%, henholdsvis, som i væsentlig grad blev forøget sammenlignet med PBS aktiveret DC’er (4,95%). Disse data antyder, at mMSLN-VLP eller IL-6 aktiverede pdCs-lignende celler har udtrykke høje niveauer af ICOSL.
Vi har vist, at mMSLN-VLP vaccination inducerede høje niveauer af IL-6-produktion, som er delvist ansvarlig for reduktionen i treg celle frekvens, men effekten IL-6 har i CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ tregs delpopulation stadig skal bestemmes. Vi vurderede derfor, om mMSLN-VLP eller IL-6 også kunne reducere det samlede CD4
+ foxp3
+ tregs samtidig opretholde en høj procentdel af CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ tregs
in vitro
. Musesplenocytter blev stimuleret med enten PBS, mMSLN-VLP (10 ug /ml) eller IL-6 (20 ng /ml). Mens vi gjorde observere betydelige CD4
+ foxp3
+ treg nedregulering i både mMSLN-VLP og IL-6 behandlingsgrupper, interessant, bemærkede vi, at IL-6 havde en lignende effekt som mMSLN-VLP behandling, som også førte til en stigning i hyppigheden af CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ tregs celler (fig. 6C). For yderligere at undersøge ejendom af denne delpopulation af Treg celler og til at afgøre, om ICOS udtryk er relateret til spredning af CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ treg delpopulation, Ki-67-ekspression blev brugt til at bestemme cykling af cellerne. Som vist i fig. 6D, fandt vi en væsentlig del af Ki-67 positive celler i ICOS
+ tregs vs. ICOS- tregs (47,8 ± 8,4% vs. 12,3 ± 3,8%, p 0,001). Dette indikerer, at selvom mMSLN-VLP induceret IL-6 reducerer den samlede hyppighed af Treg celler, det kan også være ansvarlig for den øgede andel af resterende CD4
+ foxp3
+ ICOS
+ treg delmængde gennem øget spredning af ICOS
+ celler præsenterer en tveægget sværd.
diskussion
Den hurtige udvikling af cancervacciner giver meget lovende for forebyggelse og terapi tumor [4]. I modsætning til andre tumor-terapier, vacciner har mange fordele, såsom udvikling af en hukommelse respons, specifik målretning af kræftceller og færre bivirkninger blandt andre. I denne undersøgelse har vi vist, at mMSLN-VLP immunisering kunne bryde tolerancen over for self mMSLN og montere et stærkt immunrespons mod mMSLN, og derfor effektivt at reducere tumorstørrelse og navnlig forlænge overlevelsen af tumorbærende mus i en orthotopisk bugspytkirtelkræft model . MSLN CD8
+ T-celler effektivt kan induceres af mMSLN-VLP behandling og har vist sig at bidrage til undertrykkelsen af tumorvækst. rute.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.