PLoS ONE: Aktuel polyethylenglycol som en roman kemoforebyggende middel for Oral Cancer via Målretning af epidermal vækstfaktor Svar

Abstrakt

Hoved og hals pladecellekræft (HNSCC) er en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed understreger behovet for sikre og effektive kemoforebyggende strategier. Målretning epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR) er attraktiv ved, at det er en tidlig kritisk hændelse i HNSCC patogenese. De nuværende midler uden effekt eller har uacceptabel toksicitet. Flere grupper har vist, at over-the-counter medicin, polyethylenglycol (PEG) har bemærkelsesværdig kemoforebyggende effekt mod kolon carcinogenese. Vigtigt er det, vi rapporterede, at denne virkning medieres gennem EGFR internalisering /nedbrydning. I den aktuelle undersøgelse undersøgte vi kemoforebyggende virkning af dette middel mod HNSCC, ved hjælp af både den validerede dyremodel 4-NQO (4-nitroquinolin-1-oxid) rottemodellen og cellekultur med den humane HNSCC cellelinie SCC-25. Vi viste, at daglig topisk anvendelse af 10% PEG-8000 i mundhulen (tungen og hulmur) indlæg 4NQO indvielse resulterede i en signifikant reduktion i tumor byrde (begge, tumorstørrelse og tumorer /tumorbærende rotte) uden nogen tegn på toksicitet . Immunohistokemiske undersøgelser afbildet nedsat proliferation (antal Ki67-positive celler) og reduceret ekspression af EGFR og dens nedstrømseffektorer cyclin D1 i tungen mucosa 4NQO-rotter behandlet med PEG. Vi viste, at EGFR også var markant nedreguleret i SCC-25 celler ved PEG-8000 med en ledsagende induktion af G1-S-fase-celle-cellecyklusstandsnings, som potentielt var medieret gennem opreguleret p21

CIP1 /WAF1. Afslutningsvis viser vi, for første gang, at PEG har lovende effekt og sikkerhed som en kemoforebyggende effektivitet mod oral carcinogenese

Henvisning:. Wali RK, Kunte DP, De La Cruz M, Tiwari AK, Brasky J Weber CR, et al. (2012) Aktuel polyethylenglycol som en roman kemoforebyggende middel for Oral Cancer via Målretning af epidermal vækstfaktor svar. PLoS ONE 7 (6): e38047. doi: 10,1371 /journal.pone.0038047

Redaktør: David L. McCormick, IIT Research Institute, USA

Modtaget: 26 september, 2011; Accepteret: Maj 2, 2012; Udgivet: 4 juni 2012

Copyright: © 2012 Wali et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Finansiering forudsat af National Institute of Health U01CA111257, R21CA141112, 1R21CA156944-01, RO3CA139528, RO1CA156186. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. RKW, SS og HKR er medstiftere af Pegasus Biosolutions LLC. Der er en afventende foreløbig US patent. Der er ingen varer i udvikling eller markedsførte produkter at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Planocellulært karcinom i hoved og halsregionen (HNSCC) er den sjette mest udbredte kræft på verdensplan, der tegner sig for 3% af alle kræfttilfælde [1]. I 2010, i USA alene var der anslået 49.000 nye HNSCC tilfælde og 11.500 HNSCC relateret-dødsfald [2]. Vigtigere er det, disse tal ikke hensyn til alvorlig sygelighed fra ansigtet vansiring og aerodigestive dysfunktion associeret med kirurgi /strålebehandling. Forebyggelse af denne malignitet, repræsenterer derfor en vigtig sundhedspleje nødvendighed. Ændringer af visse livsstil risikofaktorer ville være ideelt, men vanskeligt at opnå på trods af de store folkesundhedsmæssige indsats mod tobaksrygning (både røget og tygges), betelnød tygge, alkoholforbrug og HPV (infektion) status.

Derfor , renter har fokuseret på chemoprevention idet de risikogrupper er veldefinerede for forebyggende indsats primære; dem med tidlig neoplastisk transformation (oral leukoplakia), som kan identificeres ved en standard fysisk eksamen. En lige så vigtig anvendelse ville være sekundær chemoprevention (forhindrer andet primærvalg HNSCC hos patienter med en tidligere historie af kræft)

Det er blevet bemærket, at selv efter vellykket tumor resektion (Histopatologisk klare margener).; -20% Af patienterne kan stadig have en gentagelse af HNSCC på et andet sted (ca. 2% om året) [3]. Dette er stort set blevet tilskrevet “feltet cancerization” et [4]. Faktisk har klassiske undersøgelser antydet, at flere mutationsbegivenheder i mikroskopisk normal slimhinde kan være prædiktiv for tilbagevendende HNSCC og samlet overlevelse [5]. Denne “fordømte slimhinde” -konceptet er robust, ikke kun til forebyggelse af tilbagefald (sekundær forebyggelse), men også udgør en potentiel mål for primær chemoprevention (patienter uden kræft, men have præmaligne læsioner).

Således finde molekylære mål i præmaligne slimhinde har været et gennemgående tema i forebyggelse HNSCC med epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), der modtager en vis opmærksomhed. EGFR er en kritisk tidlig begivenhed i HNSCC og er overudtrykt i 80% af HNSCC. EGFR overekspression og forøget kopital i orale præmaligne er en fremragende prædiktor for risikoen for progression til HNSCC [6]. Desuden har EGFR overekspression blevet fundet i histologisk normal slimhinde fra HNSCC patienter indikerer, at ændret EGFR signalering bidrager til feltet cancerization ses i disse [7] patienter. Vigtigere, målretning EGFR er en gæv for anti-HNSCC terapier hvilket understreger betydningen af ​​denne vej. Men som med de fleste andre molekylære målrettede lægemidler, de store spørgsmål om anvendelsen af ​​anti-EGFR midler (monoklonale antistoffer, småmolekyleinhibitorer osv) for chemoprevention er deres høje omkostninger til langvarig brug og tilhørende toksicitet, især i betragtning, at de fleste af patienterne tilbudt kemoforebyggende midler ikke har cancer. At finde frem til en billig, veltolereret mekanisme til at målrette EGFR i mundslimhinden ville være et stort skridt fremad i HNSCC kemoforebyggelse indsats.

Vores gruppe har været at udforske de over-the-counter afførende polyethylenglycol (PEG) for sin bemærkelsesværdige potens ved nedregulering af EGFR og dermed give en potentiel forklaring på sin tyktarmskræft kemoforebyggende effekt (dokumenteret af flere grupper i en række prækliniske modeller) [8], [9], [10], [11], [12 ], [13]. Fra et mekanistisk synspunkt observerede vi, at PEG resulterede i hurtig internalisering af membranbundne EGFR med samtidig proteosomal nedbrydning. Dette fører til nedsat cyclin D1 og SNAIL (impliceret i både kolorektal cancer og HNSCC) således transduktion de antineoplastiske virkninger af PEG [13].

Vores hypotese derfor at topisk PEG kan være et effektivt kemoforebyggende middel imod HNSCC . Til disse undersøgelser anvendtes en velvalideret carcinogen, 4-nitroquinolin-1-oxid (4-NQO) -behandlet rottemodel med HNSCC og skællede cancercellelinie, SCC25 celler. I betragtning af den bekymring, at PEG kan forvirre effekten med en direkte kræftfremkaldende-oral slimhinde interaktion, brugte vi en post-indvielse design ved hjælp af tumor størrelse og mangfoldighed som vores primære effektmål og godt validerede mellemliggende biomarkører for spredning som et sekundært endpoint. Vi, heri for første gang, viser, at daglig topisk oral anvendelse af PEG-8000 til et kort interval nedsatte signifikant oral tumorbyrde (både tumor størrelse og antal).

Materialer og metoder

dyr Studier og Tumor Induktion

Alle dyr protokoller blev revideret og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg NorthShore University sundhedssystem (IACUC Assurance # A3444-01; protokol # 07-230). Fireogtyve mandlige Fisher-rotter (F 344; 150-200 g; Harlan, Indianapolis, IN) blev anbragt i et klima kontrolleret miljø (25 ° C temperatur, 60% fugtighed og en 12 timers lys /dag cyklus). Seksten dyr blev leveret

ad libitum

rottefoder og drikkevand suppleret med 4-nitroquinolin 1-oxid (4NQO, 20 ppm Sigma Chemicals). Frisklavet 4NQO suppleret vand blev dispenseret til rotter i lys uigennemsigtige flasker, der var genopfyldes to gange om ugen. De resterende 8 rotter blev leveret rent drikkevand (kontrolgruppe). Efter 14 uger var den 4NQO suppleret vand erstattet med almindeligt vand, og rotterne blev randomiseret i to behandlingsgrupper. Den første gruppe (8 rotter) fik en daglig topisk påføring af 10% (W /V) PEG-8000 (doseringen /formulering effektiv i coloncancer chemoforebyggelse) ved at male den bukkale gulv /tag af rotte mundhulen under anvendelse af en sable børste (# 4) i op til 3-4 minutter. For disse behandlinger blev rotterne mildt sederet i en velreguleret isofluran /oxygen bedøvelsesmiddel kammer. Den anden gruppe (8 rotter), der tjener som kontrol, blev sham malet med en pensel dyppet i kun saltvand. Dette regime blev fortsat i 14 ekstra uger. Ved obduktion blev rotte tunger udskåret og udsat for makroskopisk tumor vurdering. De tunge sektioner blev skåret, formalin fikseret, paraffin indlejret, sektioneret og udsat for histologisk og immunhistokemisk behandling.

Tumor Count og Volume

De dissekerede tunger blev undersøgt for tilstedeværelsen af ​​åbenlyse tumorer. Samlet antal tumorer ( 0,2 cm) på hver tunge blev talt, og tumorvolumen (størrelse) blev målt ifølge formlen bredde x længde x højde x π /6 [14]. Histologiske evalueringer for tilstedeværelse af epitel- atypi og dysplasi i uengagerede tungevæv blev udført efter farvning med hæmatoxylin og eosin.

immunhistokemisk (IHC) Analyse

tungen snit blev underkastet IHC-analyse til bestemme virkningen af ​​PEG på ekspressionen af ​​proliferationsmarkører Ki67, EGFR og cyclin D1. Fire mikrometer paraffinindlejrede snit blev monteret på Superfrost

+ slides (Vector Laboratories, Burlingame, CA) og afparaffineres først ved bagning ved 55-60 ° C i 1 time og derefter udsættelse til to 5 minutters vaske i xylen. Vævssnittene blev derefter hydratiseret i gradueret serie af ethanol skylninger. Den epitopgenfinding blev udført ved at udsætte væv objektglas tryk microwaving (NordicWare, Minneapolis, MN) i antigen-demaskering opløsning (Vector Laboratories). Endogen peroxid aktivitet blev standset ved behandling med 3% H

2O

2 i methanol i 10 minutter og den uspecifikke binding blev blokeret ved at inkubere vævssnit med 5% hesteserum i 1 time ved stuetemperatur. Snit blev derefter inkuberet ved 4 ° C i 4-6 timer med primære antistoffer [anti-Ki67 (1:250; ABCAM, Cambridge, MA), anti-EGFR (1:200; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) og anti-cyclin D1 (1:100; Cell Signaling Technology, Danvers, MA)], efterfulgt af passende biotinylerede sekundære antistoffer. Antigen-antistof-komplekser blev detekteret med Vectastatin Elite ABC kit (Vector Laboratories) under anvendelse af 3, 3 ‘-diaminobenzidine (DAB) som chromagen (Vector Laboratories). For negative kontroller blev snit behandlet i fravær af de primære antistoffer. Prøver blev modfarvet i Gills hematoxylin-opløsning, og den blå farve stabiliseret af en 20 anden vask i mættet lithiumcarbonat (1 g /100 ml). IHC blev scoret af patologen (CW) uden forudgående kendskab til behandlingsplan. En semi-kvantitativ skala blev anvendt til at evaluere immunoreaktiviteten af ​​basale pladeepitelceller. Omfanget af farvning blev gradueret og scorede som 0, negativ farvning; 1+, 10% reaktivitet, 2 + 10-50% reaktiv, og 3+ for . 50% positive reaktivitet [15]

Cell Culture

SCC-25 celler opnået fra American Type Tissue Culture (ATCC), Rockville, MD. Disse er ringe differentierede skællede celler opnået fra humant tunge. Identiteten og kvaliteten af ​​disse celler blev bekræftet af ATCC. Cellerne blev dyrket i DMEM /F-12 medium (indeholdende 2,5 mM L-glutamin, 15 mM HEPES, 0,5 mM natriumpyruvat, og 1200 mg /L natriumbicarbonat) suppleret med 400 ng /ml hydrocortison (Sigma /Aldrich), 10% FBS (ATCC), og 0,5% Pen /Strep (ATCC). For at vurdere virkningen af ​​PEG, blev disse celler behandlet med enten PEG-8000 eller vehikel (PBS) i 24 timer. Celler blev derefter høstet og underkastet western blot og flowcytometriske analyser.

celleproliferationsassay

Cell nummer blev vurderet ved WST-1 (4- [3- (4-iodphenyl) -2 – (4-nitrophenyl) -2H-5-tetrazolio] -1, 3-benzen disulfonat) assay ifølge producentens instruktioner (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Kort fortalt blev SCC-25-celler dyrket i plader med 96 brønde i et slutvolumen på 100 pi og derefter inkuberet med 10 pi af WST-1 reagens ved 37 ° C i 30 minutter i en befugtet 5% CO

2 incubator. Omdannelse af tetrazoliumsalt til formazan blev bestemt spektrofotometrisk ved 440 nm absorbans (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)

Cell Cycle Analysis

SCC-25-celler blev inkuberet med vehikel (phosphatbufret saltvand.; PBS) eller 10% PEG i en fugtig 5% CO

2 inkubator ved 37 ° C i 24 timer. Cellerne blev efterfølgende vasket i PBS /bovint serumalbumin (BSA), trypsinbehandlet, resuspenderet i frisk PBS /BSA og fikseret i 70% ethanol ved -20 ° C i 30 minutter. Efter 2 vaske blev cellerne inkuberet i 3 timer (ved stuetemperatur) i PBS /BSA-opløsning indeholdende propidiumiodid (PI; 40-ug /ml, Sigma) og RNase A (200 ug /ml; Sigma). Cellerne blev underkastet DNA måling indhold ved hjælp af flowcytometri (Becton Dickinson Labware). Data blev udtrykt som procentdelen af ​​celler i G

o-G

1 til G

2-M befolkninger og CellQuest 3.1 software program blev anvendt til udvikling af DNA-indholdet frekvenshistogrammer.

Western blot-analyse

Western blotting blev påført ved anvendelse af standardteknikker. Kort beskrevet blev 30 pg protein underkastet SDS-PAGE, overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ), blokeret med 5% BLOTTO og probet med specifikke antistoffer, herunder prolifererende cellekerneantigen (PCNA), P21

CIP1 /WAF1, cyklin D1, epidermal vækstfaktor receptor (EGFR). Xerograms blev udviklet med forøget kemiluminescens (Santa Cruz Biotechnology). Billeder blev erhvervet via UVP Bio-imaging Systems og analyseret ved hjælp Labworks 4.6 software. Ensartethed i protein lastning blev opnået ved normalisering efter sondering membraner med anti-β-actin (1:1000).

Statistiske Metoder

Værdier blev udtrykt som gennemsnit + SE som angivet. Kvantitative densitometridata værdier blev sammenlignet ved parrede Students test. Forskelle med p 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

PEG Forhindrer 4NQO-induceret Oral Tumor Indledning og Progression

rotte 4NQO-induceret oral carcinogenese model er et rutinemæssigt. Brugt model for HNSCC chemoprevention undersøgelser, som deler en række karakteristika med human HNSCC carcinogenese, i form af flere trin molekylære begivenheder og sekventielle ændringer i histopatologiske funktioner i mundhulen slimhinde [16], [17]. En af de andre fordele ved denne model er den relativt høje specificitet mod hoved og hals-tumorer, samt minimal svækkende virkning på den generelle sundhed af rotterne. Som vist i figur 1 (A), ved obduktion (14 uger efter afslutningen af ​​carcinogen behandling), 4NQO-behandlede rotter udviklede flere store tumorer i mundhulen, hovedsagelig stammer fra tungen og nogle fra oropharyngeale slimhinde. Administration af PEG-8000 i 14 uger efter endt 4NQO behandling demonstrerede to væsentlige ændringer: 1) PEG-8000 behandlede rotter udviklede signifikant mindre tumorer (tumor volumen) end deres alders- og 4NQO behandlingsrelaterede matchede modstykker (~58% fald; p = 0,02); 2) det samlede tumor nummer (tumorer /tumorbærende rotte) i PEG-8000 behandlede rotter var også lavere end alders- og 4NQO behandlingsrelaterede matchede rotter, som ikke modtog PEG-8000 på ethvert punkt (-25% reduktion, p = 0,05 ) (figur 1B). Disse resultater indebærer, at PEG-8000 ansøgning effektivt kan reducere dannelsen af ​​nye tumorer (hæmning af indledningen) samt standsning af progressionen af ​​eksisterende tumorer mod fremskreden HNSCC (inhibering af progression).

Den første gruppe modtog en daglig (3-4 minut) topisk påføring af 10% PEG-8000 via oral maleri og den anden gruppe blev sham malet (PEG-kontrolgruppe). Dette regime blev fortsat i 14 ekstra uger før euthanization. Rotterne blev aflivet efter 14 uger og mundhulen underkastes makroskopisk tumor vurdering af de samlede tumorer (≥0.2 cm). Som vist 4NQO-behandlede rotter udviklede flere store tumorer i mundhulen hovedsagelig stammer fra tungen og par fra væggen af ​​mundhulen. PEG reducerede den samlede tumor nummer (tumorer /tumorbærende rotte) (p = 0,05) og væksten af ​​tumorer (tumorvolumen) sammenlignet med deres aldersmatchede modstykker (p = 0,02). Tumoren volumen (størrelse) blev målt i overensstemmelse med formlen bredde x længde × højde × π /6.

PEG Undertrykker præmaligne epithelial hyperproliferation

En præcis tidsmæssig og rumlig regulering af diffus cellulær proliferation er en vigtig egenskab ved den tidlige fase HNSCC carcinogenese, og tjener som et vigtigt redskab til at vurdere kemoforebyggende effektivitet af agenter. I 4NQO-behandlede rottemodel af HNSCC carcinogenese, har generaliseret cellulær hyperproliferation i tungen epitel tidligere blevet beskrevet [18]. Mikroskopisk evaluering af slimhinden i 4NQO-behandlede rotter afslørede mange lokaliserede regioner af mild til moderat epitelial dysplasi i morfologisk normale tungen og mundslimhinden, der blev normaliseret ved PEG (figur 2A). For yderligere at undersøge virkningerne af PEG-8000 ansøgning på proliferation i tungen /mundslimhinden af ​​4NQO-behandlede rotter, undersøgte vi den immunhistokemiske ekspression af nuklear antigen Ki67, en veldefineret markør for proliferation. Til dette blev der i alt 1000 epitelceller evalueret i 6-7 felter ved 400 ganges forstørrelse og alle værdier blev anvendt til indeksene mærkning. Som vist i figur 2A og B, 4NQO-behandling signifikant forøgede proliferation i morfologisk normale tunge mucosa som afbildet (antal Ki67-mærkede epitelceller /pr optiske felt: 30 + 8 i 4NQO-behandlingsgruppe vs. 14 + 6 i matchede kontroller; p 0,01). Topisk anvendelse af PEG-8000 dramatisk normaliserede spredning indekser i 4NQO-behandlede rotter (antal Ki67-mærkede epitelceller /pr optiske felt: 30 + 8 i rotter behandlet med 4NQO-alone vs. 17 + 4 i 4NQO-behandlede rotter behandlet med PEG-8000; ~43% reduktion; p 0,01). I det mucosale epitel 4NQO-behandlede rotter, i modsætning til normale pladeepitel hvor proliferation er begrænset til det basale kammer, spredning zone udvides til supra-basal rum i den lagdelte skællede tungen epitel. Imidlertid PEG-8000 ansøgning indeholdt den proliferative zone tilbage til det basale kammer af den lagdelte pladeepitel, hvilket indikerer stærke anti-proliferative virkninger af denne topisk middel

Som vist (øverste panel, figur 2A)., 4NQO- behandlede rotte sektioner afslørede mange lokaliserede områder af mild til moderat epitelial dysplasi i morfologisk normalt udseende slimhinde, der blev normaliseret ved PEG [højere forstørrelse (63 ×, beskåret billede) mellemværker demonstrere tilstedeværelsen af ​​mitotiske tal i 4 NQO-behandlede gruppe alene]. For yderligere at undersøge virkningerne af PEG på den mucosale hyper-proliferation, udførte vi den immunhistokemiske analyse af nukleare antigen Ki67, en veldefineret markør for proliferation. I alt 1000 epitelceller blev vurderet fra 6-7 felter. Som vist (nederste panel, figur 2A-B), 4NQO-behandling forøgede proliferation i morfologisk normale tunge mucosa som vist ved forøget antal Ki67-mærkede epitelceller /pr optiske felt sammenlignet med aldersmatchede kræftfremkaldende frie kontroller. (P 0,01). Topisk anvendelse af PEG på den anden side drastisk reduceret antallet af Ki67-mærkede epitelceller /pr optiske felt (p 0,01).

PEG nedregulerer Tongue Mucosal EGFR og cyclin D1 Ekspression i 4 NQO- behandlede rotter

EGFR overekspression i præmaligne hoved og hals læsioner er korreleret med øget risiko for progression til HNSCC og dårlig overlevelse [19], [20]. Modulerende EGFR kan derfor tjene som det centrale element i en kemoforebyggende strategi. Adskillige grupper, herunder vores har tidligere vist, at anti-proliferative og kemoforebyggende virkninger af PEG mod kolorektal carcinogenese er EGFR-medieret, som administration af PEG-gavages i kræftfremkaldende behandlede rotter signifikant reduceret proliferation i colon mucosa gennem nedregulering af EGFR [13]. Vi har derfor, undersøgt, om en lignende mekanisme var impliceret i de kemoforebyggende handlinger aktuel PEG-8000 mod HNSCC. Tungen snit blev fikseret i formalin og undersøgt ved immunfarvning at vurdere ændringer i ekspressionsniveauerne af EGFR. Som vist i figur 3A og B, topisk påføring af PEG-8000 signifikant sænket intensitet samt antallet af områder, der overudtrykker EGFR i 4NQO-behandlede rotter, hvor baseline EGFR var meget højere end tungen /mundslimhinden af ​​rotter raske kontrolpersoner. Dette implicerer nedregulering af EGFR som en af ​​de potentielle mekanismer for PEG-induceret kemoforebyggelse af HNSCC. Vi demonstrerede endvidere, at PEG reducerede signifikant ekspressionen af ​​cyclin D1, en nedstrøms effektor af EGFR, der overudtrykkes i HNSCC [21] og involveret i at forårsage over for terapeutiske lægemidler, såsom cisplatin [22] og gefitinib [23].

som vist (venstre Panel – figur 3A og 3B), baseline EGFR i tungen slimhinden i 4NQO-rotter var højere end for kontrol rotter (p 0,00001). Aktuel anvendelse af PEG dog medført en betydelig nedgang i ekspressionen af ​​EGFR (p 0,005). Desuden aktuelt PEG applikation til 4-NQO rotter forårsagede lignende virkninger på ekspression af cyclin D1, en af ​​de nedstrøms effektorer af EGFR. (Højre panel – figur 3A og 3B)

PEG inhiberer celleproliferation og inducerer Cell Cycle Arrest i SCC-25 Cells

for at forstå den mekanisme af PEG virkning på celleproliferation i HNSCC; vi brugte en

in vitro

model cellekultur (pladecarcinom cellelinje, SCC-25) for at undersøge effekten af ​​PEG på spredning og cellecyklus distribution. Som vist i figur 4A, WST-1 proliferation assay viste en dosisafhængig fald i SCC-25 cellevækst ved behandling med PEG i 24 timer, med maksimale fald på 43% opnået ved 10% PEG-8000. Derfor, for efterfølgende forsøg 24 timer behandlinger af 10% PEG-8000 blev anvendt. De immunblotresultaterne viste, at PEG også forårsaget ~ 50% fald i proliferation markering, PCNA (figur 4B). Cellecyklusstop er en af ​​de vigtige mekanismer i kemoforebyggende midler. For at undersøge effekten af ​​PEG-8000 på den cellulære fordeling udførte vi flowcytometrisk analyse af PI mærkede celler. Vores resultater viser, at 24 h behandling af SCC-25 celler med 10% PEG-8000 resulterede i en markant reduktion i S-fase (proliferative) celler (62% af kontrol køretøj; p 0,002) og en signifikant stigning i G2-M fase celler (138% af kontrol køretøj; p 0,001) (Figur 4C). Disse resultater viser tydeligt, at PEG-behandling inducerer cellecyklusstop i hyperproliferative celler, og kunne derfor bidrage til at genoprette den cellulære homeostase ved at ændre de ændrede satser for kræft cellevækst og død.

Som vist (Figur 4A), var der en dosisafhængig fald i cellevækst med maksimale fald på 43% opnået ved 10% PEG-8000. Figur 4B viser et fald på ekspressionen af ​​proliferationsmarkør PCNA af PEG -50%. Figur 4C viser virkningen af ​​PEG på cellecyklusfordeling. De 24 h PEG-behandlede celler blev farvet med propidiumiodid og analyseret ved flowcytometri. PEG blokerede celler i S-fase (med 62%) og et tilsvarende stigende cellerne i G2-M-fasen (med 38%).

Behandling af SCC-25 celler med PEG Formindsker EGFR og cyclin D1 og modulerer ekspression af Cell Cycle Regulatory Protein p21

CIP1 /WAF1

fra vores

in vivo

4NQO rotte eksperimenter, EGFR og cyclin D1 var de to vigtige mål nedreguleres af PEG; vi ønskede at undersøge, om blev observeret lignende virkninger i HNSCC cellelinjer. Vi først udført immunoblot forsøg for at vurdere ekspressionen af ​​EGFR og cyclin D1 upon 24 h behandling af PEG-8000 i SCC25 celler. I overensstemmelse med de

in vivo

eksperimenter fandt vi, at behandling af SCC25 celler med PEG-8000 forårsagede et signifikant fald EGFR (~45% i forhold til kontrol køretøj; p 002) og cyclin D1 (~57% i forhold til vehikelkontrol; p 0,005) ekspression (figur 5 A). I PEG-induceret coloncancer kemoforebyggelse, har vi tidligere vist, at cellecyklusstandsning induceret af PEG-8000 implicerer en EGFR-medieret opregulering af en cyclin-afhængig kinase inhibitor, p21

CIP1 /WAF1 [24]. På en tilsvarende forsøgsprotokol, fandt vi, at PEG-8000 faktisk forårsagede en stigning i p21-ekspression (p 0,001) ~54% i SCC25 celler (figur 5B). Yderligere undersøgelser i gang for at karakterisere de opstrøms veje impliceret i modulering af disse cellecyklus regulatorer i SCC25 celler efter PEG behandling.

Som vist i figur 5A, i overensstemmelse med de

in vivo

eksperimenter PEG forårsaget et signifikant fald EGFR (~45% i forhold til kontrol køretøj; p 002) og cyclin D1 (~57% i forhold til at styre køretøjet p 0,005) udtryk. På en tilsvarende eksperimentel protokol (figur 5B), PEG-8000 forårsagede ~54% stigning i p21-ekspression (p 0,001).

Diskussion

Vi heri demonstrerer for første tid, at topisk påføring af PEG-8000 tilbudt effektiv beskyttelse mod oral udvikling af kræft. Vores cellekultur data, der viser anti-proliferative virkninger af PEG i SCC-25 celler er suppleret med nedsat tumor byrde i brønden-valideret 4-NQO-rotte HNSCC model (når det gives i den post-indledning fase). Fra et mekanistisk perspektiv, demonstrerer vi nedregulering af EGFR med samtidig hæmning af cyklin D1-spredning akse.

HNSCC bør være særdeles chemopreventable fordi udsatte grupper er let genkendelige for både primær forebyggelse (tobak tygge, alkohol, HPV osv) og sekundær forebyggelse. Dette skyldes HNSCC patienter med blot en enkelt primær tumor har en betydelig risiko for at udvikle sekundære primære tumorer i de kommende årtier. Desuden kan patienter med oral leukoplakia (prævalens på -0,5%), som frembyder malign transformation på -5% om året drage fordel af denne chemoforebyggelse [25]. Således PEG til forebyggelse HNSCC repræsenterer et potentielt klinisk levedygtig strategi.

I denne henseende talrige kemoforebyggende midler, såsom NSAID’er [26], E-vitamin [27] og retinsyre [28], er blevet testet mod HNSCC men har undladt enten skyldes manglende effekt eller toksicitet [29]. For eksempel blev en nylig randomiseret fase II studie, celecoxib på 100 eller 200 mg to gange dagligt sig at være ineffektive i at kontrollere orale præmaligne og havde signifikant systemisk toksicitet såsom kardiovaskulære bivirkninger [30]. Tilsvarende blev retinoider fundet at tilbyder kun beskeden beskyttelse mod udvikling af SCC i leukoplakia patienter, og med en uacceptabel bivirkningsprofil [31]. Den eneste anden agent, som har vist opmuntrende resultater indtil til dato har været grøn te-ekstrakt (GTE), som, mens ikke at opnå statistisk signifikans i klinisk responsrate for orale præmaligne læsioner, stadig øget median længde progression (27,5 til 46,4 måneder ) [32].

Den manglende overbevisende resultater med standard kemoforebyggende midler har ført til interesse i at udnytte et molekylært defineret kandidat agent tilgang [33]. Der har været to nylige omfattende studier, der evaluerer mutations landskab HNSCC [34], [35]. Disse undersøgelser afslørede en række gener, der er almindeligt ændret i HNSCC. Men de fleste af de formodede tidlige hændelser (fx p53 og NOTCH1) synes at være tumorsuppressorgener der generelt ikke “druggable” (hæmning mere tilbøjelige til at være til gavn for proto-onkogener). Derfor, for forebyggelse af kræft, ikke kun gøre kandidat mål skal være proto-onkogener, men disse læsioner skal være diffust til stede i mundslimhinden af ​​udsatte patienter, især i orale præmaligne læsioner (OPLs, hovedsageligt bestående af leukoplakia). EGFR har vist sig at være et mål i behandling af HNSCC med både monoklonale antistoffer og småmolekyleinhibitorer som centrale elementer i den terapeutiske armamentarium. Desuden, vores data viser klart en dybtgående opregulering i EGFR i histologisk normale oral /tunge slimhinde i 4NQO-behandlede rotter. Betydningen af ​​EGFR i tidlig carcinogenese understreges af en nylig klinisk forsøg, der viste, at i de fleste OPLs, EGFR opregulering (både kopital og ekspression) korreleret med høj risiko for progression til frank malignitet [36], [37]. Fra et kemoforebyggende perspektiv EGFR kan være et vigtigt mål, som afsløret af mekanistisk evaluering af grøn te-ekstrakt for kræft chemoprevention.

Vores data indikerer, at PEG kan forårsage en dramatisk nedregulering af EGFR både i cellekultur og i præmaligne mundslimhinden, i overensstemmelse med vores omfattende data af PEG i kolorektal carcinogenese. Faktisk PEG er en af ​​de mest potente kemoforebyggende middel mod kolorektal cancer [8], [38]. Effekten af ​​PEG i tyktarmskræft er blevet understøttet af foreløbige epidemiologiske data [39]. Fra et mekanistisk perspektiv har vores laboratorium tidligere påvist, at EGFR blev nedreguleret ved PEG i cellekultur og i colon carcinogen (azoxymethan) -behandlet rottemodel, [13]. Denne virkning syntes at være via membranen internalisering med efterfølgende proteosomal nedbrydning. De efterfølgende konsekvenser synes at følge paradigmet af EGFR → SNAIL → E-Cadherin → β-catenin → Tcf transkriptionel regulering [13]. Vigtigt er det, så er der integrerende karakter af EGFR vist ved påvisning af, at EGFR knockdown (via shRNA) sløvet den kemoforebyggende virkning af PEG i denne model for tyktarmskræft. Foretages i øjeblikket undersøgelser for at fastslå den nøjagtige mekanisme, gennem hvilken PEG internaliserer EGFR. Endvidere i overensstemmelse med vores nuværende data i HNSCC, vi har tidligere vist, i både cellekultur og dyremodeller af coloncancer, at PEG-induceret EGFR nedregulering undertrykt proliferation eventuelt gennem cyclin D1. Endvidere kan G1 → S-fase cellecyklusstandsnings observeret medieres, i det mindste delvist, ved induktion af p21

CIP1 /WAF1, en cyclin-afhængig kinase inhibitor, der kan give en anden modalitet undertrykke proliferation [24].