PLoS ONE: Hæmning af murine blærekræft Cell Growth in vitro ved Photocontrollable siRNA Baseret på opkonvertering Fluorescent Nanoparticles

Abstrakt

Denne undersøgelse giver en unik tilgang til at aktivere bur små interfererende RNA (siRNA’er) ved hjælp af indirekte UV lys, der udsendes af nær-infrarødt (NIR) -til-UV opkonvertering proces at opnå høje rumlige og tidsmæssige gen interferensmønstre. siRNA-molekyler mod den anti-apoptotiske gen

survivin

blev anbragt i bur af lysfølsomme molekyler (4,5-dimethoxy-2-nitroacetophenon, DMNPE), som gjorde dem midlertidigt ikke-funktionel. NIR-til-UV NaYF

4: Yb, Tm opkonvertering nanopartikler (UCPs) tjente som fremføringsmidler og aktivatorer af de bur siRNA molekyler i murine blære kræftceller (MB49 cellelinie). Upconverted UV-lys ved 355 nm blev udsendt fra NIR-bestrålede UCPs, som meget vel faldt sammen med den bølgelængde, er nødvendig for at uncage DMNPE. Derfor UV-lys fungerede som et skifte til uncage den leverede siRNA-molekylet, hvorved fuldt funktionel for at udøve sin terapeutiske effekt i blæren kræftceller. For at opnå den højeste RNA-interferens effektivitet, blev tilstande såsom tid efter cellulær optagelse, excitation tid, UCPs koncentration og lasereffekt optimeres. Resultaterne viste, at 200 pg /mL nanopartikel koncentration kombineret med 12 timers inkubering med MB49-celler og excitation med NIR-laser ved 100 mW effekt for 15 min gav den ideelle interferens effektivitet og stærkeste induktion af MB49 celledød. Vores resultater viser den potentielle biologiske anvendelse af UCPs i behandling af blærekræft ved en ny behandlingsmetode

Henvisning:. Guo H, Yan D, Wei Y, Han S, Qian H, Yang Y, et al. (2014) Hæmning af murin blærekræft Cell Growth

In Vitro

af Photocontrollable siRNA Baseret på opkonvertering Fluorescent Nanopartikler. PLoS ONE 9 (11): e112713. doi: 10,1371 /journal.pone.0112713

Redaktør: Yuan-Soon Ho, Taipei Medical University, Taiwan

Modtaget: August 8, 2014 Accepteret: 14 oktober 2014; Udgivet: November 25, 2014

Copyright: © 2014 Guo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne forskning blev delvist understøttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr 31.100.688, No. 21.471.043), International Science Teknologi Program Samarbejde Kina (nr 2014DFA31890), Den Videnskabelige Research Foundation for det returnerede Overseas Chinese Scholars, Statens Uddannelsesstøtte Ministeriet, og staten Key Laboratory of Veterinary ætiologisk Biologi, Lanzhou Veterinære Forskningsinstitut, kinesiske Academy of Agricultural Sciences (SKLVEB2013KFKT010). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Blærekræft er den mest almindelige malignitet i urogenitale system verdensplan. Betydelig forskningsindsats har været afsat til at udvikle nye og effektive behandlinger for blærekræft. Udover traditionelle behandlingsmetoder, såsom kirurgi, kemoterapi og strålebehandling, er genterapi betragtes som et effektivt alternativ til behandling af tumors.Hence, RNA-interferens (RNAi), et naturligt forekommende mekanisme i celler til gendæmpning, viser stort potentiale for behandling af blærecancer [1], [2], [3]. RNAi involverer bindingen af ​​små interfererende RNA (siRNA) til RNA-inducerede silencing kompleks (RISC), som derefter dirigerer ødelæggelse af messenger-RNA (mRNA), som er komplementær til antisense-strengen af ​​siRNA. Target-specifikke RNAi kan vælte et gen med høj specificitet og selektivitet, hvilket giver et vigtigt redskab for personlig kræftbehandling.

RNAi maskiner er normalt påbegyndes så hurtigt som siRNA kommer ind i cellen, og virkningerne på gen lyddæmpning kan observeres hurtigt bagefter. Men hurtig og ukontrolleret RNAi begrænser, anvendeligheden af ​​genterapi. Derfor er der gjort en indsats for at udvikle spatiotemporally inducerbare RNAi. En lovende fremgangsmåde er “bur” RNAi, som udnytter siRNA modificeret med en fotolabil beskyttelse gruppe, der blokerer dens aktivitet. Da aktiviteten af ​​”bur” siRNA bygger på en lys-baserede udløser (såsom UV-lys), denne tilgang muliggør afstand, timing, og kontrol over graden af ​​genekspression, First beskrevet af Kaplan i 1978, har været anvendt denne metode i en række anvendelser [4]. I denne undersøgelse valgte vi 4,5-dimethoxy-2-nitroacetophenon (DMNPE), en 2-NB (2-nitrobenzyl) klasse for beskyttelse fotolabile gruppe, bur siRNAs for minimal utæthed og maksimal uncaging effektivitet.

I de seneste år, upconversion fluorescerende nanopartikler (UCPs) er blevet mere og mere anvendes som fluorescerende markører og til gen-levering. UCPs udviser god biokompatibilitet og ingen immunogenicitet som et gen leveringssystem, og kan sikkert udskilles uden at efterlade rester i kroppen. UCPs effektivt kan levere siRNA eller DNA til at målrette celler eller væv og samtidig beskytte dem mod nedbrydning af nukleaser i blodet serum. Desuden sammenlignet med traditionelle fluorescerende markører, såsom organiske farvestoffer og quantum dots, UCPs udviser lav toksicitet, god kemisk stabilitet, høj fluorescens intensitet, høj stabilitet, og store Stokes skift når det anvendes som fluorescerende markører. UCPs er begejstrede for nær-infrarødt (NIR) lys, som påvirkes minimalt af interferens og scatter af auto-fluorescens fra væv og celler, og dermed tilbyde lav baggrund og høj signal-til-støj-forhold [5].

NIR lys kan trænge væv dybere end synligt lys, og som sådan, kan UCPs anvendes som fluorescerende markører eller i optisk behandling af dybe væv. Derfor UCPs udviser god udsigt som fluorescerende markører og gen-levering vektorer i klinisk påvisning, behandling og analyse af biologiske molekyler [6], [7], [8], [9]. NaYF4: Yb, Er /Tm udviser den højeste effektivitet fra NIR til synlig /opkonvertering fluorescens og kan give bølgelængder fra ultraviolet lys til infrarødt lys. Derfor NaYF4: Yb, Tm blev anvendt som en photocaged siRNA bærer i denne undersøgelse

Survivin

er en af ​​de stærkeste inhibitorer af proteiner involveret i apoptose.. I betragtning af den store forskel i dets ekspression mellem normale og maligne væv og dets kausale rolle i cancer progression, er survivin blevet undersøgt som et mål for anti-cancer terapi og som en tumormarkør [10], [11], [12], [ ,,,0],13]. Her, survivin blev valgt som målgenet for at undersøge effektiviteten af ​​RNAi-baseret genterapi til behandling af blærecancer. Specifikt survivin siRNA bur med DMNPE blev kombineret med UCPs som bærer. Aktivering af siRNA blev opnået ved bestråling med 980 nm NIR laser og inhibering af blærekræft cellevækst blev vurderet. Vores resultater giver ny indsigt i brugen af ​​UCPs i genterapi.

Materialer og metoder

1. Cell

MB49-PSA celler, som blev leveret af Dr. Ratha Mahendran fra Faculty of Medicine (NUS, Singapore) [7], [9], blev dyrket ved 37 ° C under en CO 5%

2 atmosfære i modificeret Eagles medium (MEM, Gibco) tilsat 10% føtalt bovint serum (Gibco) indeholdende 100 enheder /ml penicillin G-natrium (BBI) og 100 ug /ml streptomycinsulfat (BBI).

2 . Amino gruppe-modificerede UCPs og UCPs /siRNA-DMNPE kompleksdannelse

NaYF

4: Yb, Tm nanokrystaller og monodisperse silica-coatede NaYF

4: Yb, Tm (NaYF4: Yb, Tm @ silica, UCPs) blev syntetiseret og karakteriseret ifølge metoden beskrevet af Guo et al. (2010) [7] og Qian et al. (2009) [9]. Den UCPs blev modificeret ved anvendelse af en aminogruppe ved metoden beskrevet af Guo et al. (2011). DMNPE (Invitrogen) blev anvendt til bure siRNA’er efter fabrikantens protokol, og UCPs /siRNA-DMNPE komplekser blev fremstillet som tidligere beskrevet af Guo et al. (2011) [14]. Forholdet mellem UCPs til siRNA blev bestemt ved måling af zeta-potentialet med nano-ZS ZEN 3600 (Malvern Instruments Ltd., UK) ved 25 ° C. UV-spektrum blev indsamlet ved hjælp BIOMATE 3S UV-synlige spektrofotometer (Thermo Scientific) ved 25 ° C.

3. Cellulære optagelse af UCPs til forskellige tidspunkter

MB49-celler blev podet på plader med 6 brønde og dyrket i 24 timer. Cellerne blev straks behandlet med nanopartikler ved 100 ug /ml og opsamlet på forskellige tidspunkter (15 min, 1 h, 6 h, og 24 h). Celler forsynet med nanopartikler blev fikseret i 4% paraformaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur (RT) og derefter vasket to gange med 1 × PBS i 5 min. Kernerne blev modfarvet med 0,1 ug /ml DAPI (Sigma) i 5 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af to vaske med 1 × PBS i 5 minutter hver. Nanopartikler indlæst på de faste celler blev derefter visualiseret under en konfokal laser scanning mikroskop (Nikon C1 Konfokal) monteret med en kontinuerlig bølge 980 nm laser excitation kilde.

4. Kvantificering af UCPs optagelse Salg

Celler blev podet i 75 cm

2 kolber på 1 × 10

6 /ml efter dyrkning i 24 timer. Cellerne blev straks behandlet med nanopartikler ved 100 ug /ml og opsamlet på forskellige tidspunkter peger på 0, 15 min, 1 time, 3 timer, 6 timer, 24 timer, 48 timer og 72 timer. Intracellulære optagelse af nanopartiklerne blev vurderet ved at måle totale mængde af nanopartikler i celler under anvendelse af induktivt koblet plasma Optisk Emission Spectrometer (ICP-AES).

5. Transfektion af dyrkede celler

MB49-PSA-celler blev transficeret med UCPs /siRNA-DMNPE komplekset efter fremgangsmåden beskrevet af Guo et al. (2011) [14]. Kort fortalt blev UCPs /siRNA-DMNPE kompleks inkuberes med celler til forskellige tidspunkt som angivet. ved 37 ° C under 5% CO

2 atmosfære. Ved slutningen af ​​inkubationsperioden blev cellerne ophidset med eller uden 980 nm laser under anvendelse af en 980 nm VA-II diodepumpe solid state (DPSS) laserkilde.

6.

In vitro

levedygtighed /cytotoksicitetstests

Cell levedygtighed blev vurderet ved hjælp af Cell Titer 96 vandig én løsning assay (Promega, Madison, WI). MB49-celler podedes på en plade med 96 brønde med en tæthed på 5 x 10

3 celler pr. Efter en dag i kultur, blev UCPs /siRNA-DMNPE kompleks tilsat til brøndene. Cellerne blev inkuberet i forskellige tidsrum punkt som angivet og derefter exciteres ved hjælp 980 nm laser eller ej. Efter inkubering i yderligere 24 timer ved 37 ° C blev 20 pi af reagenset direkte tilsat til brøndene og inkuberet i yderligere 24 timer. Mængde af formazanprodukt dannet som indikeret ved 490 nm absorbans er direkte proportional med antallet af levende celler i kulturen. Hvert eksperiment blev udført tre gange. Cellelevedygtighed (%) i forhold til kontrol- brønde, der indeholder cellekulturmedium uden nanokrystaller blev beregnet som [

A

]

Eksp /[

A

]

kontrol × 100%, hvor [

A

]

Eksp er absorbansen af ​​prøven og [i]

kontrol er absorbansen af ​​kontrolprøven.

7. Påvisning af survivin ekspression ved immunoblotanalyse

MB49-celler podedes på en seks-brønds plade og dyrket indtil konfluens var 80% til 90% (som forekom efter ca. 24 timer). På det tidspunkt blev UCPs /siRNA-DMNPE kompleks tilsat, og cellerne blev inkuberet i forskellige tidsrum punktet, som angivet. Derefter blev cellerne bestrålet med eller uden 980 nm laser og inkuberet ved 37 ° C i yderligere 24 timer. Cellerne blev opsamlet ved hjælp af kolde celle lysis reagens (Pierce) ifølge producentens protokol. Proteiner i cellelysater blev adskilt ved SDS-PAGE på 12% acrylamidgeler ved anvendelse af et diskontinuert puffersystem. De blev derefter overført til en nitrocellulosemembran (Pierce) i transfer-buffer (20 mM Tris-HCI, 190 mM glycin, 20% methanol, pH 8,3) ved anvendelse af en Mini Trans-blot-transfersystemet (Bio-Rad) ved 100 V i 1 h. Membranerne blev blokeret med 5% fedtfri tørmælk i Tris-bufret saltvand indeholdende 0,05% Tween-20 (TBST) ved stuetemperatur i 1 time og derefter inkuberet med anti-survivin antistof (Santa Cruz, 1:200 fortynding) ved stuetemperatur i 1 time. Efter tre vaske i TBST blev membranerne inkuberet med peroxidase-konjugeret anti-muse-sekundært antistof (Sigma, 1:8000 fortynding) ved stuetemperatur i yderligere 1 time. Tre yderligere vaske i TBST blev udført før NC membranen blev visualiseret med ECL opløsning (Pierce).

8. Statistisk analyse

Filmene blev scannet som grå skala 8-bit billeder og tætheden af ​​bånd blev bestemt af ImageJ software til billedtelefoni.Sættet data for relativ mængde Western blot præsenteres og den statistiske analyse af varians mellem grupperne var udført af SPSS Statistics 19.0 software. Signifikant forskel på alle statistiske tests blev fastsat til 0,05 (p 0,05)

Resultater

I denne undersøgelse NaYF

4:. 25% Yb, 0,3% Tm NIR-til- UV UCPs blev anvendt som bærer af bur siRNA’er, som blev aktiveret ved hjælp af NIR-til-UV upconverted lys (fig. 1). Som vist i figur 2B, de syntetiserede nanopartikler besad en kerne-skal-struktur bestående af en NaYF

4 nanocrystal kerne og en silica shell. At fastgøre bur siRNA’er blev UCPs modificeret med en aminogruppe, der gør dens overflade er positiv ladning. De modificerede nanopartikler vist i figur 2C er mere spredt end i figur 2B, som kan være på grund af elektrostatisk frastødning forårsaget af positive ladninger på nanopartikel overflade. Samlet set blev fundet nanopartiklerne at være godt dispergeret i vand under dannelse af en klar kolloid opløsning og udviser stærk opkonvertering fluorescens (figur 2A.)

Fluorescens spektre af umodificerede nanopartikler (A).; morfologi umodificerede nanopartikler (B) og amino-funktionaliserede nanopartikler (C) observeret af TEM.

Kompleksdannelse af amino-modificerede UCPs med siRNA blev undersøgt ved måling af nanozeta potentiale. UCPs og siRNA blev blandet i 1 time ved 4 ° C. De UCPs /siRNA komplekser blev vasket adskillige gange med PBS og derefter resuspenderet i PBS-buffer. Måling af Zeta-potentiale viste, at den positive ladning på UCPs gradvist blev neutraliseret ved den negative ladning af siRNA med stigning i nanopartikel /siRNA-forhold (fig. 3A). Imidlertid er overfladerne af cellerne negativt ladet i neutral tilstand (pH 7,0). Derfor, for at maksimere kapaciteten af ​​UCPs til at levere så meget siRNA som muligt og for at opnå optimal cellulær optagelse effektiviteten af ​​UCPs /siRNA-kompleks, brugte vi en nanoparticle:siRNA forhold på 10:02 (mol:mol) i alle

in vitro Salg forsøg. For at vurdere effektiviteten af ​​siRNA uncaging ved UCPs, blev deres absorbans målt. Som vist i figur 3B, DMNPE-bur siRNA afslørede et karakteristisk topmøde på 355 nm som DMNPE og som toppen ved 260 nm som siRNA, der påviste binding af DMNPE grupper siRNA-molekyler. For DMNPE-bur siRNA-molekyler, uden bestråling med en 980 nm NIR laser, viste en forvirret spektre. Det anslås, at der er interferens mellem udledningen af ​​UCPs og af DMNPE. Imidlertid blev UCPs /siRNA-DMNPE, et betydeligt fald i peak på 355 nm observeret ved bestråling med NIR light.Hence, det er troværdigt, at NIR-til-UV UCNs kan uncage siRNA molekyler under excitation af NIR lys.

(A) Konfokal afbildning af opkonvertering fluorescens udsendt af MB49-celler fyldt med 100 ug /ml af nanopartiklerne. Excitation med 980 nm NIR laser udsendte grøn og rød synlig fluorescens. Kerner blev modfarvet med DAPI (blå fluorescens). Alle billeder blev opnået under de samme indstillinger, som tillod beregning af relativ fluorescens intensitet af forskelligt belastede celler. (B) intracellulære optagelse af nanopartikler i belastede celler ved ICP-AES for yttrium indhold.

For at bestemme niveauet af cellulære optagelse af UCPs, UCPs /siRNA eller UCPs blev passivt indlæst i MB49 celler ved at inkubere dem med 100 pg /ml nanopartikler for forskellige varigheder. Som vist i figur 4A, blev to filtre anvendes til at indfange grønne og blå fluorescens-emissioner. Kernerne blev modfarvet med DAPI for at påvise, at næsten alle cellerne er blevet lastet. En progressiv stigning blev observeret i upconversion fluorescens udsendt af nanopartikler ladet celler med tiden. Men den fluorescerende intensitet UCPs /siRNA kompleks i MB49-celler var stærkere end UCPs alene efter 6 timers inkubation. Dette indikerede, at MB49-celler havde taget op UCPs /siRNA-komplekser kraftigere end UCPs med tiden stigning, hvilket kan skyldes overfladeladningen af ​​nanopartiklerne. Endvidere har vi målt den intracellulære optagelse af nanopartikler i lastede celler ved ICP-AES for yttrium koncentration og observeret en lignende tendens af stigning i nanopartikel optagelse i celler over tid (fig. 4B). Men mængden af ​​UCPs i celler nået toppen og derefter forblev balancen.

(A) Zeta potentiale UCPs /siRNA-DMNPE kompleks ved mol /mol forhold på 10:01, 10:02, 10 :3, 10:04, og 10:05; (B) Absorbans spektrofotometri af siRNA, DMNPE-bur siRNA uden bestråling, og UCPs /siRNA-DMNPE aktiveret med eller uden NIR bestråling.

For at bestemme de optimale betingelser for siRNA interferens efter NIR-laser excitation blev sat eksperimenter med forskellige betingelser for tidspunkter efter transfektion, magnetisering gange, koncentration af komplekser og lasereffekt. Som vist i figur 5, indgrebet effektivitet øges med varigheden af ​​inkubation af nanopartikler med cellerne. Cellen levedygtighed faldt betydeligt i UCPs /siRNA-DMNPE behandling efter excitation med NIR ligh. Imidlertid var der næsten ingen ændring i cellelevedygtighed uden NIR excitation (fig. 5A) .Similarly, ved 12 timer efter behandling med eller uden NIR excitation, ekspressionsniveauet af suvivin protein faldt betydeligt og næsten forblev på samme niveau ved 24 timer , som foreslået stigning i interferens effektivitet (fig. 5B) .Dette kan skyldes stigning i cellulær optagelse af nanopartikler med tiden, og er i overensstemmelse med resultaterne vist i figur 4. som vist i figur 6, indgrebet effektivitet forøges med tiden excitation. Især survivin udtryk faldt betydeligt, når cellerne blev ophidset af NIR lys i mere end 15 min. Figur 7 viser, at indgrebet effektivitet øges med stigende koncentration af nanopartikler, og dermed interferens effektivitet steg også med mængden af ​​siRNA mod survivin. For at bestemme indflydelsen af ​​lasereffekten på interferens effektivitet blev cellerne inkuberet med UCPs eller UCPs /siRNA-DMNPE, som adskiller sig fra dem, der anvendes i det foregående eksperiment. Som vist i figur 8, interferensen effektivitet steg også med øget lasereffekt, især ved 500 mW. Men survivin udtryk faldt også i UCPs kontrolgruppen ved 500 mW, hvilket antydede, at UCPs kan fremkalde celleskader engang ophidset af NIR lys ved høj effekt. Således på grundlag af de ovennævnte resultater, de optimale betingelser (12 timers inkubering, 15 min excitation, 200 ug /ml nanopartikel koncentration, og 100 mW lasereffekt) blev anvendt til at verificere den maksimale interferens effektivitet.

UCPs /siRNA-DMNPE sattes til MB49 celler ved UCPs koncentration på 100 ug /ml. Cellerne blev ophidset ved anvendelse NIR laserlys (100 mW) i 15 minutter ved forskellige tidspunkter. Cellerne blev opsamlet 24 timer efter lysbehandling. RNAi interferens effektivitet blev bestemt ved immunoblot (A) og MTT-assay (B). Eksperimentet blev gentaget tre gange med lignende resultater, og resultatet af en repræsentativt forsøg er vist. Stjerner angiver signifikante forskelle mellem prøverne med forskellig behandling på samme tidspunkt. (* P 0,05, ** P 0,01).

UCPs /siRNA-DMNPE blev sat til MB49 celler ved UCPs koncentration på 100 mikrogram /ml. Cellerne blev ophidset ved hjælp NIR laserlys (100 mW) med forskellige excitation tidspunkter. Cellerne blev opsamlet 24 timer efter lysbehandling. RNAi effektivitet blev bestemt ved immunoblot (A) og MTT-assay (B). Eksperimentet blev gentaget tre gange med lignende resultater, og resultatet af en repræsentativt forsøg er vist. Stjerner angiver signifikante forskelle mellem prøverne med lignende excitation gange (* P 0,05, ** P 0,01)

Forskellige koncentrationer af UCPs /siRNA-DMNPE blev sat til MB49 celler i 12 timer.. Cellerne blev ophidset af NIR laserlys (100 MW) i 15 min. Cellerne blev opsamlet 24 timer efter lysbehandling. RNAi effektivitet blev bestemt ved immunoblot (A) og MTT-assay (B). Eksperimentet blev gentaget tre gange med lignende resultater, og resultatet af en repræsentativt forsøg er vist. Stjerner angiver signifikante forskelle mellem prøverne med lignende koncentration (* P 0,05, ** P 0,01).

UCPs /siRNA-DMNPE blev sat til MB49 celler ved UCPs koncentration på 100 mikrogram /ml . Cellerne blev ophidset ved anvendelse NIR laserlys med forskellig styrke i 15 minutter. Cellerne blev opsamlet 24 timer efter lysbehandling. RNAi effektivitet blev bestemt ved immunoblot (A) og MTT-assay (B). Eksperimentet blev gentaget tre gange med lignende resultater, og resultatet af en repræsentativt forsøg er vist. Stjerner angiver signifikante forskelle mellem prøverne med lignende laser effekt (* P 0,05, ** P 0,01).

For at bekræfte, om alle betingelserne er optimale, blev siRNA interferens eksperiment udført ved hjælp af UCPs og UCPs /siRNA-DMNPE kompleks. Som vist i figur 9, blev næsten ingen formindskelse i survivin protein fundet i den tomme kontrolgruppen efter excitation med eller uden NIR light.Howeve, interferensen effektivitet UCPs /siRNA-DMNPE var høj efter excitation med NIR lys. Derudover UCPs også påvirket ekspression af survivin til en vis grad, hvilket kan skyldes flere faktorer relateret til lasere og nanopartikler.

UCPs /siRNA-DMNPE sattes til MB49 celler ved UCPs koncentration på 100 ug /uL. Cellerne blev spændt ved anvendelse af NIR laserlys (100 mW) i 15 minutter ved 12 timer efter inkubation. Cellerne blev opsamlet 24 timer efter lysbehandling. RNAi effektivitet blev bestemt ved immunoblot (A). Niveauer af survivin protein i forhold til de af actin med eller uden NIR-induceret excitation er vist. Eksperimentet blev gentaget tre gange med lignende resultater, og resultatet af en repræsentativt forsøg er vist. Stjerner angiver signifikante forskelle mellem de angivne prøver (* P 0,05, ** P 0,01)

Diskussion

Gene regulering er vigtig i levende systemer, fordi genekspressionsniveauer spille vigtige. roller i genfunktioner. Fremgangsmåder til bekæmpelse af genekspression (op- eller nedregulering) revolutioneret området for udviklingsbiologi og genterapi. Den seneste udvikling i photocontrollable genekspression lover godt for øget Spatiotemporal kontrol over modulering af genekspression. I denne teknik er transskriptionelle aktivatorer /plasmid til genekspression eller siRNA’er for RNAi bur med lysfølsomme molekyler, der gør dem midlertidigt ikke-funktionel. Denne proces, kendt som photocaging, kan gøres på mange forskellige måder, hvoraf den mest almindelige er modificerende vælge basepar eller kemiske bindinger i bure molekylet. Ved bestråling med UV-lys, er modifikationen ødelagt, derved re-aktivere nukleinsyrer at genvinde deres funktion [15], [16], [17]. På denne måde kan der opnås meget høj rumlig og tidsmæssig kontrol over gen-ekspressionsmønstre. Men de fleste af de nuværende fotoaktive systemer er kun egnet til

in vitro Salg anvendelser, fordi UV-lys, som er meget skadelig, er nødvendig for uncaging proces. UV-lys også udstiller dårlig væv indtrængningsdybde, så det er uacceptabelt,

in vivo

og klinisk brug. Endvidere selv om anvendelsen af ​​siRNA for RNAi viser stort potentiale for terapi, siRNA let nedbrydes af RNase i blodserum og er derfor uegnede til

in vivo

brug. siRNA nukleotider er relativt små og korte, selv efter kemisk modifikation for at forbedre siRNA stabilitet. Disse nukleotider kan udskilles via urinvejene efter absorbans i blodet. siRNA skal også overvinde endoteliale barrierer for at nå målet celler i forskellige organismer. Derfor er meget vigtigt at udvikle et system til effektiv og sikker levering af siRNA til celler. Til dato har leveringssystemer for siRNA inkluderet nonvirus- og virus-baserede administrationssystemer; førstnævnte omfatter liposomer, nanopartikler, kationiske polymerer, miceller og andre systemer baseret på disse formularer. Da virus-baserede afgivelsessystemer udviser nogle bivirkninger, herunder potentielle immunogenicitet og tumorigenicitet i genterapi, er de uegnede til siRNA levering. Derfor, på nuværende tidspunkt, nonvirus-baserede afgivelsessystemer for siRNA udforskes. I denne undersøgelse NaYF

4: 25% Yb, 0,3% Tm NIR-til-UV UCPs blev anvendt som bærere af bur siRNA. NIR lys, som blev anvendt til at excitere UCPs, kan trænge biologisk væv mere end synlige eller UV-lys, hvorved anvendelsen af ​​UCPs som bærere i dybe væv

fotolabile beskyttelsesgrupper kan inddeles i to typer:. Den uspecifik bure gruppe involverer tilfældig bure af siRNA phosphatskelettet [18], mens den anden gruppe omfatter specifik blokering af 5′-phosphat af siRNA’er [19]. De ikke-specifikke grupper er mere stabile end de specifikke grupper. Desuden er de ikke-specifikke grupper er lette at syntetisere ved kemiske eller biokemiske metoder, og derved reducere omkostningerne til fremstilling bur siRNA. I denne undersøgelse blev siRNA bur ved hjælp DMNPE. DMNPE tilhører den 2-NB bure gruppen og dens derivater er de mest anvendte og godt karakteriserede anbringelse i bur molekyler [20]. NIR-til-UV UCPs spektret viser en peak emission ved 350 nm, hvilket falder sammen godt med bølgelængden er nødvendig for at uncage DMNPE. Desuden er NIR lys kun svagt absorberes af biologisk væv, hvilket sikrer maksimal NIR lys absorbans UCPs og øger følsomheden af ​​metoden.

For at verificere det optimale tidspunkt for NIR excitation i celler, den cellulære optagelse af UCPs blev detekteret ved fluorescerende mikroskopi og ICP-AES. Mængden af ​​UCPs i cellerne steg i første omgang med tiden, men faldt efter 24 timer efter podning. Dette indikerer, at den tidlige fase af inkubation med UCPs er kritisk. Overvejer cellelevedygtighed, valgte vi 12 timer efter inkubation af UCPs for NIR-induceret excitation. Resultater af vores efterfølgende eksperimenter bekræftet, at dette tidspunkt er ideel til at opnå høj RNA-interferens. Selvom NIR lys er mindre cytotoksisk end UV-lys, kan brug af høj lasereffekt og lang excitation tid inducere signifikant cytotoksicitet og lavere RNAi effektivitet. Derfor blev kun 15 min af excitation tidsforbrug og lasereffekten var fastsat til 100 mW. Eftersom UCPs inducerer beskadigelse celler ved høje koncentrationer, blev koncentrationen af ​​UCPs fastsat til 200 ug /ml. Den høje RNAi effektivitet observeret i undersøgelsen valideret egnetheden af ​​disse parametre for vores eksperimenter.

Konklusioner

Som konklusion viser denne undersøgelse, at NIR-til-UV UCPs kan tjene som levering køretøjer og aktivatorer af bur nukleinsyrer. Bestråling af UCPs i celler ved opkonverteret UV lys udsendt fra NIR førte til uncaging af de indlæste molekyler, hvorved de bliver fuldt funktionel i værtsceller. Udover at udstille godt lys gennemtrængning i væv for dybdegående fotoaktivering, NIR lys-induceret excitation nødvendig for upconversion proces NIR-til-UV forårsagede minimal solskader til biologiske prøver. De iboende fluorescens egenskaber af disse nanopartikler aktiveret emission, der førte til frigivelse af bur siRNA og facilitering af gen indblanding. Således kan UCPs skabe en platform for applikationer, der involverer fjernbetjening af RNAi og genterapi af kræft. Desuden er vores resultater viser nytten af ​​flerfarvet upconversion luminescens UCPs som en alsidig og effektivt værktøj til avancerede applikationer i billedbehandling, Biodetection, og genterapi.