PLoS ONE: Evaluering af antitumor Virkninger af BPR1J-340, en potent og selektiv FLT3 Inhibitor, alene eller i kombination med en HDAC-hæmmer, Vorinostat, i AML Cancer

Abstrakt

Overekspression eller /og aktivering mutation af FLT3 kinase spiller en stor drivende rolle i patogenesen af ​​akut myeloid leukæmi (AML). Derfor farmakologiske inhibitorer af FLT3 er af terapeutisk potentiale for AML behandling. I denne undersøgelse blev BPR1J-340 identificeret som en ny potent FLT3 inhibitor af biokemisk kinaseaktivitet (IC50 ca. 25 nM

) og cellulær proliferation (GC 50 ca. 5 nM

) assays. BPR1J-340 hæmmede fosforylering af FLT3 og STAT5 og udløste apoptose i FLT3-ITD

+ AML-celler. De farmakokinetiske parametre for BPR1J-340 i rotter blev bestemt. BPR1J-340 viste også udtalt tumorvækst hæmning og regression i FLT3-ITD

+ AML murine xenograftmodeller. Kombinationen behandling af HDAC-hæmmer vorinostat (SAHA) med BPR1J-340 synergistisk induceret apoptose via Mcl-1 nedregulering i MOLM-13 AML-celler, hvilket indikerer, at kombinationen af ​​selektive FLT3 kinase inhibitorer og HDAC-hæmmere kunne udvise klinisk fordel i AML terapi. Vores resultater tyder på, at BPR1J-340 kan udvikles yderligere i de prækliniske og kliniske studier som terapi i AML behandlinger

Henvisning:. Lin WH, Yeh TK, Jiaang WT, Yen KJ, Chen CH, Huang CT, et al. (2014) Evaluering af antitumor Virkninger af BPR1J-340, en potent og selektiv FLT3 Inhibitor, alene eller i kombination med en HDAC-hæmmer, Vorinostat, i AML Cancer. PLoS ONE 9 (1): e83160. doi: 10,1371 /journal.pone.0083160

Redaktør: Zhengqi Wang, Emory University, USA

Modtaget: Juli 18, 2013; Accepteret 31. oktober, 2013; Udgivet: 8. januar 2014

Copyright: © 2014 Lin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Akut myeloid leukæmi (AML) er den mest almindelige hæmatologiske malignitet hos voksne med en høj forekomst og lav overlevelse sandsynlighed [1], [2], [3]. AML skrider hurtigt på grund af den hurtige vækst af unormale hvide blodlegemer, der ophobes i knoglemarven og forstyrrer produktionen af ​​røde blodlegemer, blodplader og normale hvide blodlegemer. Hvis venstre ubehandlet, AML er normalt dødelig inden for uger eller måneder efter diagnosen. FLT3 (fms-lignende tyrosinkinase 3), en celleoverfladereceptor tilhører klassen III receptor-tyrosinkinase-familien, spiller en central rolle i differentieringen og overlevelsen af ​​de hæmatopoietiske stamceller i knoglemarven [4], [5].

FLT3

er en af ​​de mest almindeligt muterede gener i AML [6], [7]. Aktivering FLT3 mutationer, FLT3-ITD (en intern tandemduplikation mutation i juxtamembrandomænet) og FLT3-TKD (a missense mutation i kinasedomænet), er hyppigt forekommende hos ca. 30% af voksne AML-patienter [8], [9] [10], [11]. FLT3-aktiverende mutantions kritisk regulerer leukæmisk transformation ved at fremskynde spredning og undertrykke apoptose og er signifikant associeret med dårlig prognose [12], [13]. Disse resultater fremhæver FLT3-ITD og FLT3-TKD som meget attraktive terapeutiske mål for udvikling af lægemidler i den menneskelige AML.

Der er nu flere klasser af små molekyler FLT3 inhibitorer, der har indgået kliniske forsøg. Imidlertid effektive lægemidler er endnu ikke blevet identificeret i klinikker [14], [15], [16]. Selv om disse hæmmere har vist lovende anti-cancer aktivitet i

in vitro

in vivo

prækliniske modeller, er klinisk positive svar i AML patienter, der fik en enkelt agent FLT3 hæmmere begrænset på grund af forbigående reduktion af perifere blaster men ikke knoglemarv blaster eller indtrædelsen af ​​inhibitor-resistente FLT3 mutationer hos patienter [17], [18], [19], [20]. Derfor kan kombinatoriske strategier FLT3-hæmmere og andre kemoterapeutiske stoffer være gavnlige tilgange til at forbedre FLT3-hæmmer og at overvinde behandlingssvigt [21], [22]. Den FLT3 inhibitor CEP-701 (lestaurtinib) kombineret med standard AML kemoterapeutiske stoffer har potentiale til at forbedre kliniske resultater i AML-patienter [23]. Derudover histondeacetylaseinhibitorer (HDACi), en klasse af forbindelser, der kan fremkalde kræft celle vækststandsning og celledød ved at ændre acetylering status både histon og ikke-histon-proteiner, kan øge aktiviteten af ​​FLT3-inhibitorer på AML celleapoptose [ ,,,0],24], [25], [26]. Den HDACi vorinostat (SAHA) udviser klinisk aktivitet i AML; Men dens effektivitet som et enkelt middel er kun moderat [27], [28]. I denne undersøgelse rapporterer vi data karakteriserer den farmakologiske profil af en ny FLT3 kinase inhibitor, BPR1J-340, og belyse den eventuelt molekylære mekanisme af de stærkt synergistiske virkninger i kombination med SAHA i FLT3-ITD

+ -celler.

BPR1J-340 forbindelse udviser potent FLT3 hæmmende aktivitet, med en 50% hæmmende koncentration (IC

50) på 25 ± 5 nm og væksthæmmende effekter på FLT3-ITD

+ leukæmi MOLM-13 og MV4 ; 11 celler med en GC

50 værdi på 3,4 ± 1,5 og 2,8 ± 1,2 nM. IC

50 værdier var ca. 1 nM mod FLT3-ITD og 1 nM mod STAT5 phosphorylering i MV4; 11 celler. Desuden BPR1J-340 udviser gunstige farmakokinetiske egenskaber og signifikant anti-tumor-aktivitet i FLT3-ITD murine xenograftmodeller. Kombinationen af ​​HDAC inhibitor SAHA med BPR1J-340 udviser stærkt synergistisk anti-leukæmi virkning i FLT3-ITD + -celler. Disse resultater fremhæve den terapeutiske potentiale af BPR1J-340 og SAHA i AML og støtte dens præklinisk eller klinisk udvikling.

Materialer og metoder

Kemi og reagenser

FLT3 hæmmere, BPR1J-340 og AC220, blev syntetiseret ved vores laboratorium. Histondeacetylaseinhibitoren vorinostat (SAHA) blev købt fra SelleckBio (Houston, TX, USA). Alle inhibitorer blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) ved en stamkoncentration på 10 mM. Den anti-FLT3 (sc-480, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti-pFLT3-Tyr591 (# 3461, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) anti-STAT5 (# 9363, Cell Signaling Technology ), anti-pSTAT5-Tyr694 (# 9351, Cell Signaling Technology), anti-kløvet poly ADP-ribose polymerase (PARP) (# 9542, Cell Signaling Technology), anti-Mcl-1 (# 4572, Cell Signaling Technology), anti-caspase 3 (# 9662, Cell Signaling Technology) og anti-β-actin (Gtx110546, GeneTex, Irvine, CA, USA) antistoffer blev indkøbt til Western blotting-analyse. Fremstillingen af ​​rekombinante proteiner, FLT3 (resterne Y567-S993), VEGFR1 (resterne R781-I1338) og VEGFR2 (resterne V789-V1356), til biokemisk kinaseassay blev beskrevet tidligere [29]. De VEGFR3 (resterne M800-Y1363) proteiner blev indkøbt fra Upstate (Billerica, MA, USA)

Cellekultur

RS4;. 11, MV4; 11, U937 og K562-celler blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). MOLM-13 celler blev købt fra Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ, Braunschweig, Tyskland). Alle leukæmiske cellelinier blev dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, USA) med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA). Den HEK293T og FLT3-transficerede HEK293T celler blev dyrket i DMEM (Invitrogen, USA) medium med 10% føtalt bovint serum (FBS). De øvrige 14 ikke-leukæmiske cellelinjer, HCC827, H1975, H1650, H2228, NCIH460, A431, HCT-116, MKN45, MiaPaCa-2, RT4, MCF-7, Huh7, Hep3B, og Detroit 551, blev dyrket i medium ifølge til ATCC anbefalinger.

In vitro-aktivitet assay

FLT3 og VEGFR1 /2 kinase-Glo-kinase assays blev udført som rapporteret af vores tidligere undersøgelse [30]. Den VEGFR3 aktivitet analyse blev udført ved anvendelse af den samme protokol beskrevet i VEGFR1 /2-analyse. Den kinase hæmning profilering og hæmmende aktivitet af FLT3-D835Y, CSF1R, og trkA blev bestemt ved Invitrogen SelectScreen® kinase profilering tjeneste (Carlsbad, Californien, USA).

Cell levedygtighed og celle vækst assays

Cellelevedygtighed blev vurderet med en MTS assay som udføres som fremgangsmåden beskrevet tidligere [31]. Celler blev podet i plader med 96 brønde ved en densitet på 10.000 celler per brønd i 16 timer og derefter behandlet med vehikel eller forskellige koncentrationer af forbindelse i medium. Ændringen i levedygtige celler blev kvantificeret under anvendelse af MTS-metoden (Promega, Madison, WI, USA) ifølge producentens anbefalede protokol eller ved celletælling under et mikroskop. GC

50 værdi blev defineret som den mængde forbindelse, som forårsagede en reduktion i cellelevedygtighed 50% sammenlignet med DMSO-behandlede (vehikel) kontrol og blev beregnet ved anvendelse Prism version 4 software (Graph-Pad Software, Inc., San Diego, CA, USA). Dataene er præsenteret som middelværdi ± S.D. fra tre uafhængige forsøg. Cellevækst blev målt ved trypan blå farvestof ekskluderingsmetode. Celler (1 x 10

4 ml

-1) blev dyrket i 12-brønds plader i 24 timer og derefter behandlet med forskellige mængder af testforbindelse og de samme mængder af køretøjet i 72 timer. Antallet af levedygtige celler blev talt ved trypanblåt-farvning ved anvendelse af et hæmocytometer på det angivne tidspunkt efter lægemiddelbehandling. Resultatet blev udtrykt som gennemsnittet ± S.D. fra tredobbelte bestemmelser.

Western blotting

Celler blev lyseret i lysisbuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, 1 mM natriumorthovanadat, 1 mM PMSF og 1 mM DTT). Proteinlysater blev opløst ved SDS-PAGE og overført til en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Millipore, Bedford, MA, USA). Membranerne blev immunblottet med egnede antistoffer og detekteret ved anvendelse af SuperSignal reagens (Pierce, Rockford, IL, USA) efterfulgt af eksponering for røntgenfilm. Salg

Apoptose assay

Antallet af apoptotiske celler blev bestemt ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) analyser under anvendelse Annexin V-FITC-farvning. Kort fortalt blev celler centrifugeret efter lægemiddelbehandling og resuspenderet i 1 × bindingspuffer indeholdende 2,5 mM calcium (Ca2 +). Celler blev inkuberet med Annexin V-FITC (Biolegend, San Diego, CA) og propidiumiodid (PI) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i mørke ved stuetemperatur i 20 minutter. Dernæst blev prøver rekonstitueret med 1 × bindende buffer og underkastet flowcytometri FACS Calibus (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ) for at analysere Annexin V-positive population hjælp CellQuest Pro (BD Bioscience) og FlowJo (Treestar, Inc., San Carlos, CA).

farmakokinetisk analyse af BPR1J-340

de anvendelser af dyr blev godkendt af The Institutional Care og brug Udvalg af de nationale Health Research Institutes. Kort fortalt Sprague-Dawley hanrotter, der vejede 300-400 g hver blev indhentet fra BioLASCO, Taiwan Co, Ltd, Ilan, Taiwan. En dag før dosering blev rotter kirurgisk forberedt med en jugular-vene kanyle og fastede natten over (~18-20 h). Vand var tilgængelig

ad libitum

. Fødevarer blev leveret på 4 timer efter dosering. Single 1,5 mg /kg intravenøs dosis BPR1J-340, som PEG400 /vand (80/20, vol /vol) opløsning, blev separat administreret til grupper af 3 rotter i hver via jugular vene kanyle. Ved 0 (før dosering), 2, 5, 15 og 30 min. og ved 1, 2, 4, 6, 8 og 24 timer efter dosering, blev en blodprøve opsamlet. Plasma blev separeret fra blodet ved centrifugering (14.000 g i 15 minutter ved 4 ° C i en Beckman Model AllegraTM 6R centrifuge) og opbevaret i en fryser (-20 ° C) indtil analyse. Alle plasmaprøver blev analyseret ved LC-MS /MS. Plasma-koncentration blev analyseret med ikke-kompartment metode til farmakokinetisk bestemmelse.

subkutant tumor xenograft eksperimenter

Mand nøgne mus (Nu-Fox1nu) på otte uger gammel blev købt fra BioLasco (Ilan, Taiwan ). De nøgne mus (n = 5~7 per gruppe) blev inokuleret subkutant med MOLM-13 (1 x 10

6 celler /flanke). Alle humane cancerceller blev bestemt til at være fri for Mycoplasma spp før podning. Når tumorer størrelse nåede 100~200 mm

3 og en stor størrelse af 500 mm

3 blev dyrene grupperet og behandlet med BPR1J-340 (5 og 20 mg /kg, iv) eller bærer som styre en gang dagligt i 5 dage om ugen i to eller tre uger. Tumor størrelser blev målt og beregnet med formlen for længde × bredde

2/2 efter indledningen af ​​behandlingerne. Tumorstørrelse og dyrets kropsvægt blev målt to gange om ugen efter inokulation af tumorceller. Ved afslutningen af ​​undersøgelsen blev dyrene aflivet ved carbondioxid inhalation efterfulgt af cervikal dislokation. Den store forskel mellem den behandlede og køretøjet kontrol blev analyseret ved hjælp af en-vejs

ANOVA

Student-Newman-Keuls

test. Niveauet for en statistisk signifikans blev sat til

s

. 0,05

Resultater

In vitro kinase profilering af BPR1J-340

BPR1J-340 , en urea-substituerede 3-phenyl-1

H

-5-pyrazolylamine-baserede sammensatte, er designet ved kemisk modifikation af sulfonamid række derivater (BPR1J-097-serien) ved en struktur-aktivitet relationer (SAR) undersøgelse (fig. 1) [31], [32]. For kinase hæmning specificitet screening, blev BPR1J-340 testet mod 59 proteinkinaser dækker de store onkogene kinaser af human protein kinome. Denne kinase hæmning profil afslørede, at BPR1J-340 er en meget selektiv kinaseinhibitor og de fleste af testede kinaser blev ikke signifikant inhiberet i en koncentration på 100 nM (tabel S1). Efterfølgende blev de mest potente kinaser fra 59 kinaser screening yderligere bedømt. Som vist i tabel 1, BPR1J-340 inhiberes kraftigt vildtype FLT3 (IC

50 = 29 ± 5 nM, sammenlignet med ABT869 med en IC

50 af 38 ± 3 nM,), mutant FLT3-D835Y (IC

50 = 19 nM), CSF1R (FMS) (IC

50 = 78 nM), KDR (VEGFR2) (IC

50 = 28 ± 9 nM), og FLT4 (VEGFR3) (IC

50 = 29 ± 7 nM). Desuden BPR1J-340 inhiberede trkA, der er forbundet med væksten og metastaser af brystcancer, med en IC

50 værdi på 8 nM. Givet den høje lighed mellem de ATP-binding lommer af FLT3 og Aurora kinaser blev den inhiberende aktivitet over for Aurora A og Aurora B måles. IC

50’erne i BPRJ-340 blev bestemt til at være 1040 nM og 1344 nM for Aurora A kinase og Aurora B kinase, hhv. Tilsammen BPRJ-340 er en selektiv kinase inhibitor med

in vitro

aktivitet mod FLT3, VEGFR2, VEGFR3 og trkA receptortyrosinkinaser

BPR1J-340.:

N

1-(3-4-[([(5-ethyl-3-isoxazolyl)amino]carbonylamino)methyl]phenyl-1

H

-5-pyrazolyl)-4-[(4-methylpiperazino)methyl]benzamide. BPR1J-097:

N

1-(3-3-[(phenylsulfonyl)amino]phenyl-1

H

-5-pyrazolyl)-4-(4-methylpiperazino)benzamide.

BPR1J-340 inhiberer proliferation af FLT3-ITD

+ -celler Salg

Efter de selektive og potente væksthæmmende effekter af BPR1J-340 blev påvist i FLT3-ITD-bærende leukæmiceller, celleproliferationen inhiberende aktivitet blev testet i en panel af leukæmiske og ikke-leukæmiceller. BPR1J-340 hæmmede celleproliferation af FLT3-ITD

+ celler (MOLM-13 og MV4; 11 FLT3-afhængige cellelinier) med en GC

50 på ca. 5 nM. Celler, som ikke var afhængig af FLT3 signalering for vækst, herunder RS4, 11, U937, og K562 leukæmiceller [33], [34], [35], og de ikke-leukæmiske testede cellelinjer var enten svagt hæmmet eller var ikke hæmmet ved BPR1J-340 (tabel 2). Væksten af ​​FLT3-uafhængige RS4; 11 cellelinie, som indeholder vildtype FLT3 blev kun svagt inhiberet af BPR1J-340 med et GC

50 værdi på 770 ± 360 nM. Følsomheden over for BPR1J-340 varierer mellem FLT3-afhængige celler MOLM-13 /MV4; 11 og FLT3-uafhængige celler RS4; 11, hvilket antyder, at FLT3-signalvejen i FLT3-ITD + -celler næsten fuldstændigt forstyrret af BPR1J-340. Desuden er vores resultater tyder på, at BPR1J-340 kunne hæmme FLT-ITD aktivitet ved

in vitro

biokemiske og cellulære assays. Samlet set BPR1J-340 er en potent og høj-selektiv hæmmer for spredning til FLT3-drevne celler.

BPR1J-340 hæmmer FLT3-STAT5 signalering

For at løse, om BPR1J-340 var i stand til at inhibere FLT3 signalvejen i FLT3-drevne celler, MV4; 11 celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af BPR1J-340 i 1 time, og phosphorylering status FLT3 og STAT5 (Signal Transducer og transkriptionsaktivator 5), en kritisk nedstrøms modulator, der spiller en stor rolle i FLT3-ITD signaltransduktion for celle ekspansion og overlevelse, blev undersøgt ved Western blot-analyse. Som vist i figur 2A, BPR1J-340 undertrykte phosphoryleringen af ​​FLT3 og STAT5 på en dosis-afhængig måde med et IC

50 værdi på ca. 1 nM. For at undersøge forskellen i følsomhed mellem FLT3-WT og aktiverende mutanter FLT3-ITD og FLT3-D835Y til BPR1J-340, HEK293T celler manipuleret til at udtrykke FLT3-WT eller mutanter FLT3 (FLT3-ITD, FLT3-D835Y) blev analyseret [31 ]. De HEK293T-FLT3 celler blev behandlet med BPR1J-340 i forskellige koncentrationer i 1 time, og FLT3-ligand (50 ng /ml) blev tilsat i 5 minutter til fremstilling af cellelysatet til påvisning af ændringer i FLT3 phosphorylering ved Western-analyse. Som vist i figur 2B, phosphoryleringen af ​​alle FLT3-WT, FLT3-ITD og FLT3-D835Y blev inhiberet af BPR-1J340, med IC

50 værdier på 10 til 100 nM. Taget sammen viser disse data, at BPR-1J340 inhiberer cellulær FLT3 phosphorylering og modulerer FLT3 signalvejen, især FLT3-ITD pathway

(A) MV4;. 11 celler blev behandlet med BPR1J-340 i de angivne koncentrationer i 1 time. Phosphoryleringsstatussen af ​​FLT3 og STAT5 blev evalueret ved Western blot analyse. (B) HEK 293T-celler blev transficeret med FLT3-WT, FLT3-ITD- eller FLT3-D835Y-udtrykkende plasmider i 24 timer og derefter inkuberet med forskellige koncentrationer af BPR1J-340 i 1 time. FLT3 phosphorylering status i de transficerede celler blev vurderet ved Western blot-analyse.

BPR1J-340 inducerer apoptose i FLT3-ITD udtrykkende celler Salg

Som inhibering af FLT3 signaling resulterer i en tab af potentiel vækst og en induktion af apoptose i FLT3-ITD udtrykkende celler, blev virkningerne af BPR1J-340 på celle apoptotisk respons i FLT3-ITD

+ celler undersøgt. Den MOLM-13 og MV4; 11 celler blev behandlet med BPR1J-340 ved forskellige koncentrationer i 24 timer og analyseret for induktion af apoptose ved hjælp af aktiv caspase-3 og spaltet PARP (poly-ADP-ribose-polymerase) analyse. Evnen hos BPR1J-340 til at inducere apoptose er tydelig som vist i figur 3, hvor væsentlig spaltning af caspase-3 (aktiv caspase-3) og PARP (aktiv PARP) blev observeret i MOLM-13 og MV4; 11 celler behandlet med BPR1J- 340 ved 10 nM.

Western blotting viste, at BPR1J-340 var i stand til at inducere apoptose i FLT3-ITD-drevet FLT3-ITD

+ AML-celler. MOLM-13 (A) og MV4; 11 (B) celler blev behandlet med BPR1J-340 i de angivne koncentrationer i 24 timer, og cellelysaterne blev derefter underkastet Western blot-analyse under anvendelse af antistoffer mod caspase-3 og PARP (poly- ADP-ribose-polymerase). (Fuld længde caspase-3 (FL-caspase-3), kløvning af caspase-3 (CL-caspase-3), fuld længde poly (ADP-ribose) polymerase (FL-PARP) spaltning af PARP (CL-PARP) ).

SAHA i kombination med BPR1J-340 øger cytotoksicitet mod FLT3-ITD

+ udtrykkende celler

Nogle histondeacetylaseinhibitorer (HDACi) vil øge den cytotoksiske aktivitet af FLT3 inhibitor på FLT3-ITD

+ celle via nedbrydning af FLT3-ITD og STAT5 [24], [26], [36], [37]. For at bestemme om SAHA, en HDACi, kan virke synergistisk med BPR1J-340, der kan forbedre cytotoksicitet i FLT3-ITD udtrykkende celler ved at interferere med de FLT3-ITD og Stat5 akse, de samlede virkninger af SAHA og BPR1J-340 på cytotoksicitet undersøgt. Cellen vækst på MOLM-13 og MV4; 11 med SAHA og BPR1J-340 multikombinerbare behandling blev reduceret sammenlignet med den single-medicinsk behandling (figur 4A.). Dernæst undersøgte vi SAHA behandlingseffekten på BPR1J-340-induceret apoptose i FLT3-ITD-udtrykkende celler. Eneste behandling med SAHA (ved 300 nM) i 48 timer forøgede ikke antallet af apoptotiske celler i kontrolpopulation 10%, mens SAHA /BPR1J-340 co-behandling resulterede i en større induktion af apoptose (steg 20% ​​i MOLM-13 og 12% i MV4; 11 celler, henholdsvis) sammenlignet med BPR1J-340 narkotikabehandling alene (fig 4B og figur 4C)… Disse data antydede, at SAHA forbedre BPR1J-340-induceret apoptose i FLT3-ITD

+ -celler. Vi belyst yderligere proteinniveauer af FLT3-ITD og STAT5 i denne SAHA /BPR1J-340 co-behandling forstærket cytotoksicitet. Vi behandlede MOLM-13 celler med SAHA, BPR1J-340, eller deres kombination for 20 timer. Sammenlignet med enkelt-lægemiddelbehandling, kombinationen af ​​SAHA og BPR1J-340 remarkedly reducerede proteinniveauer af FLT3-ITD og STAT5 (fig. 4D). Endvidere BPR1J-340 /SAHA behandling dybt reduceret Mcl-1 (myeloid celleleukæmi-1, et anti-apoptotisk medlem af Bcl-2-familien) proteinniveauer i FLT3-ITD

+ -celler (fig. 4D). Denne resultaterne af Mcl-1 reduktion kan forklare den forbedrede cytotoksicitet selv STAT5 fosforylering på Tyr694 blev fuldstændig blokere ved BPR1J-340 (fig. 4D) Mcl-1 spiller en væsentlig rolle i resistens mod kemoterapi i AML-celler [38]. Således kan målrette MCL-1 ved hjælp SAHA /BPR1J-340 være en lovende strategi for at overvinde lægemiddelresistens i FLT3-ITD-positive AML. Vores resultater tyder på, at reduktionen i den samlede protein niveauer af FLT3-ITD, STAT5 og Mcl-1 ved SAHA tilføjelse giver en mulig mekanisme til at forklare den forøgede cytotoksicitet med SAHA /BPR1J-340 samtidig administration.

MOLM-13 eller MV4; 11 celler blev podet ved en initial koncentration på 1 × 10

5 celle mL

-1 i 24 timer og derefter behandlet med BPR-1J340 enten alene eller i kombination med SAHA i de angivne koncentrationer. (A) levedygtige celler blev talt efter farvning med trypanblåt ved angivet tidspunkt (B) med 48 timer efter behandling blev celler farvet med FITC-mærket annexin V og propidiumiodid og procentdele af apoptotiske celler blev analyseret ved flowcytometri. (C) Den repræsentative flowcytometri histogrammer af assays af annexin positiv apoptotiske celler efter 48 timer narkotikabehandling (D) MOLM-13-celler blev behandlet med lægemidler i 20 timer, og derefter efterfulgt af Western blot-analyse for at vurdere ændringer i proteinniveauer med viste antistoffer. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af Students

t

-test. * Angiver signifikant forskel i forhold til køretøjets kontrol (* p 0,05, * * * p 0,01). De viste data er repræsentative for flere uafhængige forsøg.

Farmakokinetiske parametre for BPR1J-340

For at evaluere de farmakokinetiske egenskaber af BPR1J-340, vi målte plasmakoncentrationen af ​​BPR1J-340 i løbet af en 24-timers periode efter en enkelt intravenøs indgift (fig. 5 og tabel 3). Efter en 1,5 mg /kg intravenøs dosis administreret til Sprague-Dawley-rotter, BPR1J-340 opnået en maksimal plasmakoncentration på 7,9 uM (4.296 ng /ml) ved 2 min efter dosering. Plasmakoncentrationen oversteg 80 ng /mL i 6 timer og forblev konstant på 9,9 ng /ml (C

24 hours, 18 nM) efter 24 timer dosering. Derfor plasmakoncentrationen af ​​BPR1J-340 når tilstrækkelige niveauer til at inhibere proliferation og inducere apoptose af FLT3-ITD

+ celler baseret på cellulære eksperimenter. Den totale clearance var 20,4 ± 5,2 ml /min /kg, og fordelingsvolumen ved steady state (Vss) var 10,3 ± 2,5 l /kg for BPR1J-340 i rotter. Den tilsyneladende plasmahalveringstid var ca. 8,8 timer.

En enkelt intravenøs bolusdosis (1,5 mg /kg) BPR1J-340 blev administreret til voksne Sprague-Dawley rotter (n = 3). Data illustrerer middelværdier (n = 3) ± S.D. plasmakoncentration af BPR1J-340 på hvert tidspunkt

Tumorvækst undertrykkende aktivitet af BPR1J-340

FLT3-ITD

+ MV4;. 11 og MOLM- 13 implanteret er ofte blevet brugt til at evaluere

in vivo

effekten af ​​FLT3 inhibitorer mod AML [39], [40]. Vi og andre grupper har fundet MV4; 11 xenograftmodel er mærkbart mere følsom over for FLT3 hæmmere [30], [31], [39], [41]. For at vurdere evnen hos BPR1J-340 til at inhibere tumorvækst i en AML xenograft model, derfor valgte vi MOLM-13 tumor xenograft model. BPR1J-340 blev administreret intravenøst ​​(5 mg /kg qd) på dag 1-5 i hver uge i 3 uger; ved udgangen af ​​denne periode MOLM-13 tumorer havde nået en gennemsnitlig volumen på 200 mm

3. Behandling via dette regime resulterede i fuldstændig regression af tumoren hos alle dyr på dag 22; komplet regression (CR) forekom hos 4 af 6 behandlede dyr inden for 31 dage efter behandlingen observation (fig. 6A). I denne effektivitetsundersøgelse, mus med større tumorer (gennemsnitligt tumorvolumen 630 mm

3, n = 3) fik en enkelt intravenøs dosis på 20 mg /kg BPR1J-340 på dag 1-5 i hver uge i 2 uger, hvilket resulterede i fuldstændig og holdbar tumorregression uden tydelige tumorer fundet under 48 dages opfølgning (fig. 6B). Der blev ikke observeret noget tab af kropsvægt eller dødelighed hos dyr behandlet med enhver dosis af BPR1J-340 (data ikke vist). Disse resultater viser, at BPR1J-340 effektivt reducerer tumorstørrelse ved intravenøse doser på 5 og 20 mg /kg /dag; BPR1J-340 er veltolereret i mus ved disse effektive doser.

BPR1J-340 (iv) er aktiv mod human akut leukæmi MOLM-13-tumorer vokser subkutant og kan reducere størrelsen af ​​tumorer selv efter tumorerne var lov til at vokse til en størrelse på 630 mm

3. (A) In vivo antitumorvirkningen af ​​BPR1J-340 i MOLM-13 xenograft nøgne mus model. Væksten af ​​tumoren xenograft blev inhiberet af BPR1J-340 [5 mg /kg, i.v.]; p 0,05 sammenlignet med bærer behandling. (B) Den subkutant vækst af en MOLM-13 tumor af stor størrelse ( 630 mm

3) i nøgne mus kunne blive væsentligt vendes ved BPR1J-340 [20 mg /kg, iv]

diskussion

Da den unormale udtryk for FLT3 kinase, herunder forstærket eller afvigende aktiveret FLT3, ofte observeret i de blastceller af AML-patienter, FLT3 repræsenterer en attraktiv terapeutisk mål for valg for narkotika udvikling i AML. Til dato har flere potentielle FLT3 hæmmere blevet udviklet og undersøgt i AML-patienter, herunder lestaurtinib (CEP701) og MIDOSTAURIN (PKC412) i kliniske fase III studier og sunitinibmaleat (Sutent), sorafenib (Nexavar), quizartinib (AC220), og crenolanib (CP-868.596) i fase II forsøg. Men FLT3 kinase målretning af mono-terapi med de nuværende eksperimentelle stoffer ikke give terapeutiske fordele i AML-patienter. Det viste, at den afvigende aktivering af FLT3 og /eller resistente FLT3, herunder allerede eksisterende og erhvervede resistente mutanter, sjældent kunne være fuldt hæmmet af single-agent behandling. Således er der et behov for identifikation af mere effektive inhibitorer af FLT3 og udvikling af nye terapeutiske strategier, herunder kombinationsbehandlinger strategier, der er målrettet ikke blot FLT3 men også molekyler relevant for FLT3 overlevelse pathway at tilsidesætte aktuelle lægemiddelresistens. I dette studie viste vi effektiviteten af ​​romanen FLT3 inhibitor BPR1J-340 i forskellige

in vitro

in vivo

modeller af AML og identificere synergieffekter med HDACi SAHA på cytotoksicitet FL3 -ITD-udtrykkende celler i

in vitro

analyser.

vi har tidligere identificeret en sulfonamid række 3-phenyl-1

H Salg -5-pyrazolylamine-baserede forbindelser som potente inhibitorer af FLT3 såsom BPR1J-097 [31]. Ved at fortsætte med at vores bestræbelser på at udvikle potente FLT3 hæmmere, vi bestemt at søge andre serier af inhibitorer, der ikke kun øgede

in vitro

vækst-hæmmende effekt på AML-celler, men også forlænget virkningsvarighed

i vivo

. Gennem rationelt design, opdagede vi BPR1J-340, som er en urinstof serie af 3-phenyl-1

H

-5-pyrazolylamine-baserede FLT3 inhibitor, effektivt inhiberer FLT3-WT eller FLT3-ITD-aktivitet

in vitro

in vivo

. Fordi flere signalveje påvirke væksten og metastatiske potentiale af tumorceller, mange af inhibitorer i klinisk udvikling er udformet som multi-målrettede inhibitorer, der blokerer et begrænset antal onkogene kinaser. Således blev kinase selektivitet profilering af BPR1J-340 udført for at identificere yderligere mål i et panel af 59 testede onkogene kinaser. I yderligere biokemisk assay, BPR1J-340 demonstreret potent inhibering (20-190 nM), mod de angiogene kinaser VEGFR1, VEGFR2, og VEGFR3, som alle spiller en vigtig rolle i tumormikromiljøet (tabel 1). Desuden BPR1J-340 inhiberes kraftigt trkA-aktivitet med en IC

50 værdi på 8 nM. Tilsammen er BPRJ-340 karakteriseres som en selektiv multi-målrettet inhibitor med potent hæmning aktivitet mod FLT3-WT, FLT3-D835Y, VEGFR2, VEGFR3, og trkA. Denne inhibering profil kan tillade BPRJ-340 til at inhibere tumorvækst direkte ved at blokere den afvigende FLT3 signalvejen og indirekte ved at målrette tumorangiogenese. BPR1J-340 kan også have klinisk potentiale i tumor drevet af unormalt udtrykte TrkA-receptorer, som kan forekomme i hjernen, prostata, pancreas og brystcancer [42], [43], [44], [45].

BPR-1J340 inhiberede cellulær FLT3 phosphorylering og modulerede FLT3 signalvejen, hvilket resulterede i inhibering af proliferation og induktion af apoptose. BPR1J-340 demonstreret potent vækstinhibering, overvejende FLT3-afhængige celler (MOLM-13 og MV4; 11), men ikke i FLT3-uafhængige celler. BPR1J-340 hæmmede udbredelsen af ​​mutant FLT3-ITD

+ celler med et GC

50 af 2-6 nM og hæmmede FLT3-ITD fosforylering med en IC

50 af 10 nM; selv cellerne transficeret med FLT3-D835Y mutant blev også inhiberet af BPR1J-340 med en IC

50 på ca. 100 nM. I overensstemmelse med disse resultater, BPR1J-340 effektivt induceret apoptose i FLT3-ITD

+ celler.

HDAC-hæmmere kan udvise væksthæmning aktivitet mod AML-celler og markant forbedre den terapeutiske effekt af FLT3 hæmmere [24], [46]. En nylig undersøgelse rapporterede, at HDACi LBH589 plus en FLT3 inhibitor (PPKC412, AC220) kombinationsbehandling synergistisk kunne inducere apoptose gennem FLT3-ITD og STAT5 nedbrydning [26]. Det viste også, at aktiveret caspase-3 (CL-caspase 3) bidrager til degrdation af FLT3-ITD og STAT5 [26]. FLT3-ITD nedbrydning blev også rapporteret sekundært til HDACi-induceret opregulering af UbcH8 og nedregulering af HSP90 [36], [47]. MCL-1, et anti-apoptotisk protein, der fremmer overlevelsen af ​​FLT3-ITD

+ -celler via STAT5 aktivering, nedreguleres af FLT3 inhibering [25]. Den HDACi SAHA også induceret nedregulering af Mcl-1 [48]. Endvidere Mcl-1-protein er en direkte spaltning substrat af aktiveret caspase-3 [49].