PLoS ONE: En optimeret Pentaplex PCR til påvisning af DNA mismatch repair-deficient kolorektal kræft

Abstrakt

Formål

mikrosatelitter ustabilitet (MSI) bruges til at screene tarmkræft (CRC) for Lynch syndrom, og til at forudsige udfaldet og respons på behandlingen. Den nuværende teknik til måling MSI kræver DNA fra normale og neoplastiske væv, og undlader at identificere tumorer med specifik DNA mismatch reparation (MMR) defekter. Vi testede et panel af fem kvasi-monomorfiske mononukleotidbyggeblokken gentagne markører forstærkede i en enkelt multiplex PCR-reaktion (pentaplex PCR) til at detektere MSI.

Eksperimentel Design

Vi undersøgte en kohorte af 213 CRC patienter, består af 114 MFR-deficiente og 99 MMR-dygtige tumorer. Immunhistokemisk (IHC) analyse vurderet udtryk for MLH1, MSH2, PMS2 og MSH6. MSI status blev defineret af forskelle i kvasi-monomorf variation interval (QMVR) fra en pulje af normale DNA-prøver og måle forskelle i allel længder i tumor-DNA.

Resultater

Forstærkning af 426 normale alleler tilladt optimering af QMVR ved hver markering, og elimineres kravet om matchede reference-dna at definere MSI i hver prøve. Brug ≥2 /5 ustabile markører som kriterierne for MSI resulterede i en følsomhed på 95,6% (95% CI = 90,1-98,1%) og en positiv prædiktiv værdi på 100% (95% CI = 96,6% -100%). Påvisning af MSH6-manglen er begrænset ved hjælp af alle teknikker. Dataanalyse med en tre-markør panel (BAT26, NR21 og NR27) var sammenlignelig i følsomhed (97,4%) og positive prædiktive værdi (96,5%) til fem markørpanel. Begge tilgange var overlegen i forhold til den standard tilgang til måling MSI.

Konklusioner

En optimeret pentaplex (eller triplex) PCR tilbyder en letkøbt, robust, meget billig, meget følsom, og specifik analyse for identifikation af MSI i CRC

Henvisning:. Goel A, Nagasaka T, Hameln R, Boland CR (2010) en optimeret Pentaplex PCR til påvisning af DNA mismatch repair-mangelfuld tarmkræft. PLoS ONE 5 (2): e9393. doi: 10,1371 /journal.pone.0009393

Redaktør: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center, USA

Modtaget: November 3, 2009; Accepteret: 3 februar 2010; Publiceret: 24 feb 2010

Copyright: © 2010 Goel et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Den nuværende arbejde blev støttet af tilskud RO1 CA 72.851 (til CRB) og RO1 CA 129.286 (til AG og CRB) fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, og midler fra Baylor Research Institute. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mikrosatelitter ustabilitet (MSI), der er defineret som akkumuleringen af ​​insertion-deletionsmutationer med korte repetitive DNA-sekvenser (eller “mikrosatellitter«) er et karakteristisk træk ved cancer celler med DNA mismatch repair (MMR) deficiency [ ,,,0],1]. Inaktivering af en af ​​flere MMR gener, herunder

MLH1

,

MSH2

,

MSH6

PMS2

, kan resultere i MSI. Oprindeligt MSI blev vist at korrelere med germlinie defekter i MMR-gener i patienter med Lynch syndrom (LS), hvor 90% af colorektal cancer (CRC) patienter udviser MSI [2], [3]. Det blev senere erkendt, at MSI også forekommer i ~12% af sporadiske CRCs forekommende hos patienter, der mangler kimlinie MFR mutationer, og MSI hos disse patienter skyldes promotor methylering-induceret nedregulering af

MLH1

genekspression [4 ]. Bestemmelse af MSI status i CRC har klinisk brug til at identificere patienter med germlinie defekter disponerer for MMR-mangel. Derudover MSI status har prognostiske og terapeutiske implikationer, fordi MSI CRC’er typisk har en bedre prognose, og disse kræftformer er mindre lydhøre over for 5FU adjuverende kemoterapi [5].

Siden sin oprindelige opdagelse mere end et årti siden , de metoder og kriterier til at bestemme MSI i CRC har konstant udviklet sig. Men der er stadig en mangel på enighed om brugen af ​​forskellige MSI analyser, der er mere robust, billig og ville resultere i MSI-analyser, der bedst repræsenterer MMR-mangel i laboratorier verden over [6]. I et forsøg på at forene MSI analyse CRC, i 1997 en National Cancer Institute (NCI) værksted anbefales at bruge en reference panel af fem MSI markører, der bestod af 2 mononukleotidbyggeblokken gentagne markører (BAT26 og BAT25) og 3 dinukleotid gentage markører (D2S123, D5S346 og D17S250) [7]. I en opfølgende NCI værksted, panelet erkendte nogle af de begrænsninger af de oprindelige markører, primært som følge af inddragelse af de 3 dinukleotid markører [8]. Først blev det anerkendt, at de dinukleotid gentagne markører var mere egnede til identifikation MSI-L tumorer, mens mononukleotid gentagne markører var mere specifik og sensitiv til bestemmelse af MSI (eller MSI-H) CRCs [9]. For det andet, på grund af den polymorfe beskaffenhed af dinukleotid markører, disse krævede tilgængeligheden af ​​ikke bare tumor men matchende normalt DNA fra hver enkelt at fortolke MSI resultater. Det er blevet vist, at et panel af fem kvasi-monomorfe mononukleotid gentagne markører i en pentaplex PCR fjerne behovet for normalt DNA fra hver CRC patient, og kan tilbyde bedre specificitet og følsomhed end NCI-panelet markører de [10].

desværre, på trods af sine åbenlyse styrker, den pentaplex MSI tilgang har vundet begrænset accept til MSI-baserede screening af CRCs. Der kan være flere grunde til dette, herunder en mangel på klar forståelse af de tekniske aspekter og uafhængig validering af denne analyse. Denne undersøgelse omhandler denne bekymring ved at validere nøjagtigheden af ​​de pentaplex-panel markører i en stor serie af MMR-dygtige og mangelfulde CRC’er ved at analysere PCR-forstærkede profiler af hver markør i både tumor og matchende normal DNA. Heri demonstrerer vi en meget følsom og specifik pentaplex PCR assay, der kræver engangs-optimering af kvasi-monomorf variation interval (QMVR) for hver markør i normal DNA. Vi dokumenterer, at en optimeret pentaplex PCR-assay bør være den foretrukne metode til MSI evaluering i kliniske og forskningslaboratorier, da det er hurtigt, økonomisk, meget følsom og specifik til påvisning MMR-deficiente CRCs og forebygger behovet for reference normalt DNA.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle patienter forudsat skriftligt informeret samtykke og undersøgelsen blev godkendt af institutionelle anmeldelse bestyrelser Baylor University Medical center, Dallas, USA; Universitetet i Heidelberg, Heidelberg, Tyskland; og Okayama University Hospital, Okayama, Japan

vævsprøver

Tumor og matchende germlinie DNA blev indsamlet fra 213 patienter diagnosticeret med CRC på tre forskellige institutioner:. 1) Baylor University Medical Center, Dallas , TX, USA 2) universitetet i Heidelberg, Heidelberg, Tyskland og 3) Okayama University Hospital, Okayama, Japan. Blandt denne kohorte, 114 tumorer var MMR-mangel, og omfattede 50 CRC’er med tab af MLH1, 48 med tab af MSH2 og 8 sager hver med den eksklusive tab af PMS2 eller MSH6 proteiner. De resterende 99 sager var MMR-dygtige.

MMR Protein Immunhistokemi

Vi undersøgte proteinekspression for MLH1, MSH2, PMS2, og MSH6 i 213 tumorvæv ved immunhistokemisk (IHC) farvning hjælp DAKO EnVision System-HRP polymersystem kit (Dako Cytomation Inc., Carpinteria, CA). Vævssnit blev probet med passende fortyndinger af monoklonale muse-antistoffer mod MLH1 (klon 13271A, BD Pharmingen, San Diego, CA), MSH2 (klon FE11, Oncogene Research Products, Boston, MA), PMS2 (klon A37, BD Pharmingen San Diego, CA), og MSH6 protein (klon 44, BD Transduction Laboratories, Lexington, KY). Tumorceller blev bedømt negative for MMR protein ekspression, hvis epitelcellerne inden tumorvævet manglede nuklear farvning, medens de omgivende stromaceller stadig viste positiv farvning.

mikrodissektion og DNA-amplifikation

Serielle sektioner (5 um) fra formalin-fikserede paraffin-indlejrede matchede normale og tumorvæv blev rutinemæssigt farvet, og som er repræsentative normale og tumor-regioner blev identificeret ved mikroskopisk undersøgelse. Genomisk DNA blev isoleret fra paraffinindlejrede væv ved hjælp af QIAamp DNA mini (Qiagen, Valencia, CA) efter separation af tumor og normalt væv ved manuel mikrodissektion.

Pentaplex PCR og Quasi-monomorfisk Variation Range (QMVR ) Definition af

MSI-analyse blev udført ved hjælp af fem mononukleotidbyggeblokken gentage mikrosatellit mål (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 og NR-27) i et pentaplex PCR-system [10]. Primer sekvenser er blevet beskrevet tidligere, og hvert sense primer blev endemærket med en af ​​de fluorescerende markører: FAM, HEX eller NED [11]. Pentaplex PCR blev udført i en MJ Research DNA 200 multicycler (Biorad, Hercules, CA). PCR-betingelserne bestod af en indledende 15 min denatureringstrin ved 95 ° C, efterfulgt af 35 cykler ved 95 ° C i 30 s, 55 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s, med en endelig forlængelse ved 72 ° C i 10 min. Amplificerede PCR-produkter blev fortyndet med formamid, og kørt på et Applied Biosystems 3100 Avant automatiseret kapillarelektroforese DNA-sekventeringsapparat. Alleliske størrelser for hver af markørerne blev estimeret ved hjælp GeneMapper 3.1 software (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Til bestemmelse og validering af kvasi-monomorf variation interval (QMVR) for hver af de fem MSI markører, blev PCR-amplifikation profiler scoret individuelt, og størrelsen af ​​begge alleler blev bestemt for hver markør og for hver tumor individuelt som tidligere [11] beskrevne. Til beregningen, på grund af den monomorfe karakter af disse markører, vi beregnede hver allel størrelse to gange i homozygote prøver.

Bestemmelse af allelvariationer i Tumor DNA sammenlignet med normale DNA

Dernæst undersøgte vi hvorvidt tilgængeligheden af ​​matchende normalt DNA fra en CRC patient ville øge screening ydeevne pentaplex PCR i MMR-deficiente CRCs. Vi beregnede forskellene i allele længder mellem tumor og normalt DNA for hver patient og hver MSI markør. I hvert tilfælde, vi anset den korteste allel til stede i tumor eller normal DNA til beregningen ved hjælp af følgende formel:

(Forskel i allel længde) =