PLoS ONE: Co-Targeting prostatakræft epitel og Bone Stroma fra Human osteonectin-Promotor-medieret Selvmord Gene Therapy effektivt Hæmmer androgen-uafhængige Prostata Cancer Vækst

​​

Abstrakt

Stromal-epitelial interaktion har vist sig at fremme den lokale tumorvækst og fjernmetastaser. Vi søgte at skabe en lovende genterapi tilgang, co-fokuserer på cancer og dens støtte stromale celler til bekæmpelse af kastrationsresistent prostata tumorer. Heri, vi demonstreret, at human osteonectin overudtrykkes i prostatacancer epitel og tumorstroma i sammenligning med deres normale modstykke. Vi har designet et hidtil ukendt humant osteonectin promotor (Hon-522E) indeholdende positive transkriptionelle regulatoriske elementer identificeret i både promotoren og exon 1 område af det humane osteonectin gen.

In vitro

reporter analyser viste, at Hon-522E promotor er meget aktiv i androgen receptor negative og metastatisk prostatacancer og knogler stromale celler i forhold til androgen receptor-positive prostata kræftceller. Desuden

in vivo

prostata-tumor-fremmende aktivitet af Hon-522E promotoren blev bekræftet ved intravenøs administration af en adenovirusvektor indeholdende Hon-522E-promotor-drevet luciferase genet (Ad-522E-Luc) i mus bærende ortotopisk humane prostata tumorxenotransplantater. Desuden er en adenovirusvektor med Hon-522E-promotordreven herpes simplex virus thymidinkinase genet (Ad-522E-TK) blev meget effektiv mod vækst af androgen-uafhængig human prostatacancer PC3M og knogle stromacellelinje

in vitro

i på forhånd fastlagte PC3M tumorer

in vivo

ved tilsætning af prodrug ganciclovir. På grund af den heterogenitet af humane prostata tumorer, Hon-522E promotor-medieret genterapi har potentiale til behandling af hormon refraktær og knogle metastatisk prostatakræft

Henvisning:. Sung SY, Chang JL, Chen KC, Yeh SD, Liu YR, Su YH et al. (2016) Co-Målretning prostatakræft epitel og Bone Stroma fra Human osteonectin-Promotor-medieret Selvmord Gene Therapy effektivt Hæmmer androgen-uafhængige Prostata Cancer Growth. PLoS ONE 11 (4): e0153350. doi: 10,1371 /journal.pone.0153350

Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTRIG

Modtaget: Februar 3, 2016 Accepteret: 28 marts 2016; Udgivet: April 7, 2016

Copyright: © 2016 Sung et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af Grant mEST 103-2320-B-038-040-MY3 (CLH) og 103-2320-B-038 -039-MY3 (SYS) fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi, MOHW105-TDU-B-212 til 134.001 (SYS) fra Ministeriet for Sundhed og Velfærd, og TMUTOP103003-6 (CLH), TMUTOP103003-3 (SYS) og 104TMU-SHH-01-3 (YHS) fra Taipei Medical University, Taiwan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i både Europa og USA [1]. Androgen afsavn terapi (ADT) betragtes som en central behandling som monoterapi eller i kombination med andre regimer. De fleste patienter i begyndelsen reagere på ADT; Men den iboende karakter af heterogenitet af tumorceller resulterer i modstand til behandling og progression i meget morbid sygdom betegnes kastrationsresistent prostatacancer (CRPC) inden 18-24 måneder [2]. End-stage CRPC er ofte forbundet med ossøse metastaser, der forårsager betydelig sygelighed og dødelighed med udviklingen af ​​alvorlige skelet komplikationer i de ramte patienter. Nylige kliniske metoder, der anvender midler, der er målrettet forskellige virkningsmekanismer, herunder tubulin-bindende kemoterapi (cabazitaxel); immunterapi (sipuleucel-T); CYP-17-inhibering (abiraterone); androgen receptor (AR) blokade (enzalutamide); og radioisotop terapi (radium-223), selv om har vist lovende resultater i forsinke skeletkomplikationerne og også forbedre den samlede overlevelse [3], behandling af patienter med metastatisk CRPC fortsat en udfordring, med en gennemsnitlig overlevelsestid på mindre end 19 måneder [4] . , Udvikling af nye midler med mere effektiv antitumoraktivitet er derfor afgørende til behandling metastatisk CRPC. Især er lægemidler nødvendigt med target hormonresistent prostatacancerceller uanset differentieringsniveau, med forskellige niveauer af androgen receptor (AR) og prostata-specifikt antigen (PSA) ekspression.

Tidligere genetiske og molekylære undersøgelser besiddes at tumorceller er heterogene og deres efterfølgende metastaser er resultatet af ikke-tilfældige, sekventielle og flere trin selektive processer blandt allerede eksisterende cellepopulationer. Imidlertid har nyere undersøgelser fremgår det indviklede intercellulære kommunikation mellem stromale og kræft epitelceller fører til permanente genetiske og adfærdsmæssige ændringer, ikke blot i de epitelceller, men også i cancer-associerede stromale celler, der driver yderligere genetiske og genekspression ændringer i prostata cancer celler [ ,,,0],5, 6]. Gennem en række komplekse, intime tovejskommunikation mellem prostatakræft og værten stroma, kræftceller vinde yderligere vækst og overlevelse fordele og i sidste ende udbrede til fjerne organer med dødelig effekt [7-9]. Således kan co-målretning af både tumor og dens støtte stromaceller forbedre terapeutiske respons og samlet overlevelse af patienter med prostatakræft [10-13]. Eftersom genterapi er blevet identificeret som den foretrukne behandling for metastatiske cancere [14], udvikling af en effektiv strategi til afgivelse og ekspression af terapeutiske gener i tumoren epitel og tilstødende stroma er afgørende for at gøre en sådan behandling til rådighed.

osteonectin (også kendt som basalmembran-40 [BM-40] og udskilte protein sure rigt på cystein [SPARC]) er vidt udbredt i flere væv under udvikling og cellulær skade [15] og spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​celleadhæsion spredning, migration og væv remodellering [16]. I knoglen mikromiljø, osteonectin er den mest rigelige ikke-collage matrixprotein, som er overudtrykt tidligt i osteoblastisk differentiering og er kritisk for opretholdelse af knoglemasse [17]. Rolle osteonectin i prostatakræft er blevet identificeret som en kemoattraktant for knogle-invasiv prostatacancerceller [18-20]. Høje niveauer af osteonectin ekspression er blevet observeret i prostata cancer cellelinjer afledt fra metastaser og i prostatacancer metastatiske foci [21]. Derudover blev forhøjede osteonectin niveauer i primær prostatacancer forbundet med den senere udvikling af metastase [22], hvilket indikerer, at prostatacancercelle metastase til knoglen medieres delvist af osteonectin-medieret fremme af kræft cellemigration, proteaseaktivitet, og invasion. Fordi osteonectin ekspression forekommer i begge tumor epitelceller og knogleceller, kunne osteonectin promotoren anvendes til at drive et terapeutisk gen co-targeting knoglen metastatisk prostatacancer og støttematerialet mikromiljø, uanset det basale niveau af AR og PSA-ekspression.

I denne undersøgelse har vi søgt at skabe en promotor-medieret terapeutisk middel, co-mål prostatakræft og dens omgivende stromale celler. Vi fandt, at osteonectin blev opreguleret i prostatakræft epitelceller og cancerassocierede stromaceller i forhold til deres normale modstykker. Vi har designet en ny HON promotor (Hon-522E), der indeholder positive transkriptionelle regulerende elementer er identificeret i både promotoren og exon 1 region i Hon-genet. Konstruerede vi også en replikationsdefekt adenoviral vektor, som bærer en herpes simplex virus thymidinkinase (HSV-TK) genet drevet af et højaktivt 580 bp HON promotoren (Hon-522E). Behandling med denne konstruktion, Ad-522E-TK, i kombination med prodrug ganciclovir (GCV) blev fundet for første gang til at dræbe både androgen-uafhængig prostatacancer og knogle stromale cellelinier

in vitro

at hæmme prostata tumorvækst i en xenograft model. På grund af den heterogenitet af humane prostata tumorer, kan Ad-522E-TK anvendes som et supplement behandling med andre AR-målretning modaliteter for behandling af hormon refraktær og knogle metastatisk prostatakræft.

Materialer og metoder

cellelinjer og Cell kultur

menneskelige prostata cancer cellelinjer LNCaP, c4-2, C4-2B, PC3, DU145 og PC3M, og en menneskelig osteosarcomcellelinie MG63 der har været brugt i vores tidligere undersøgelser [6, 23, 24] blev opretholdt i T-medium og suppleret med 5% føtalt kalveserum (FBS). hFOB 1.19 human osteoblast og HS27A human knoglemarvsstroma cellelinier blev indkøbt fra ATCC (Manassas, VA, USA) og holdt i en 1: 1 blanding af Hams F12 Medium /Dulbeccos modificerede Eagles medium og RPMI 1640-medium, henholdsvis med 10% FBS. Adenovirus emballage 293 cellelinje (Microbix Biosystems Inc., Toronto, Ontario, Canada) blev opretholdt i Minimal Eagles Medium og suppleret med 10% FBS og 2 mM glutamin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Alle celledyrkningsmedier og reagenser blev indkøbt fra Invitrogen. Alle celler blev dyrket i en 37 ° C inkubator med 5% CO

2 og blev passeret efter at have nået 90% sammenflydning.

Menneskelig emne og Laser capture microdissection (LCM)

Forsøg med humane prøver blev gennemgået og godkendt af den institutionelle review board (IRB) ved Taipei Medical University (TMU-JIRB 20.131.253). En prostata væv microarray (TMA), der indeholder 49 væv kerner repræsenterer prøver fra 40 tilfælde af prostatakræft og 9 matchede normale tilstødende væv blev opnået fra Super Bio Chips (CA4, Seoul, Korea). Frosne humane prostata vævsprøver blev opnået fra TMU Blandede Biobank baseret på Taipei Medical University og tilknyttet hospitaler fra individer med skriftligt informeret samtykke. LCM blev anvendt til at isolere selektivt rene populationer af prostatacancerceller og ikke neoplastiske epitelceller samt stroma støder op til Gleason grad 3 og grad 4 kirtler og stroma støder op til ikke maligne kirtler fra frosne snit af prostatektomi prøvemateriale fra fire patienter . I korte træk blev otte-micron-tykke snit frosset væv farvet under anvendelse af Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit ifølge producentens anvisninger. Områder i den valgte celle populationer blev mikrodissekeres fra sektionerne og opsamles ved hjælp af ArcturusXT systemet og CapSure HS LCM Caps. Indstillingerne for laseren var som følger: spot diameter sat til 30 um, power 70 mW, og puls varighed 25 millisekunder. Totalt RNA fra hver prøve blev mikrodissekeret ekstraheret under anvendelse af PicoPure RNA Isolation Kit efter fremstillingen protokol. LCM instrument og alle reagenser i eksperimentet blev opnået fra Thermo Fisher Scientific Inc. (Madison, WI, USA).

Real-time RT-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra celler under anvendelse af High Pure RNA Isolation Kit (Roche, Indianapolis, IN, USA) ifølge producentens anvisninger. Den første streng gratis DNA blev syntetiseret under anvendelse tilfældige primere og Moloney murin leukæmivirus-revers transkriptase (Invitrogen) og underkastet realtids-PCR under anvendelse af LightCycler 480 med Lyset Cycler TaqMan Master kit kombineret med Universal ProbeLibrary probe (Roche) ifølge producentens instruktioner. Target gener blev amplificeret ved anvendelse af specifikke primere for Hon (frem: 5′-GTGCAGAGGAAACCGAAGAG-3 ‘og omvendt: 5′-TGTTTGCAGTGGTGGTTCTG-3’., Probe nr 77), og husholdning gen, HSPCB (fremad: 5’AGCCTACGTTGCTCACTATTACG-3 ‘og revers: 5′- GAAAGGCAAAAGTCTCCACCT-3’, probe nr 55).. Den relative genekspression af osteonectin i cellelinierne repræsenteres som 2

-ΔCT, med ACt bestemmes ved at subtrahere den gennemsnitlige husholdning gen HSPCB tærskelcyklus fra gennemsnittet målgenet værdi.

Plasmidkonstruktion

Alle promotorkonstruktioner blev dannet ved anvendelse af TOPO TA kloning systemet (Invitrogen) og efterfølgende fordøjet under anvendelse af passende restriktionssteder i polylinkeren for at tillade indsættelse i vektoren pGL3-basic (Promega, Madison, WI, USA) indeholdende den kodende region af ildflue-luciferasegenet. Alle promotorkonstruktioner havde den samme 5′-ende. Afstandsstykket mellem GGA-bokse 1 og 2 blev deleteret ved rekombinant PCR ved anvendelse af følgende primersæt: 522-N: (5’ACTAGTAGCAGCTTGTCTTGTC3 ‘), spdel-C: (5’CTTCTCCCCTGTCTCTGTCTT3 l), spdel-N: (5 »AAGACAGAGACAGGGGAGAAG3 ‘) kombineret med efterfølgende primere: Intron-C: (5’TACCTCAGTGGCAGGCAGGCAG3«), Exon-C: (5’CAGGCAGGCAGGCGGCAG «), og Hafner-C: (5’GCGCGCTCTCCGGGCAGTCTG3) til at konstruere Hon-522I, honorere 522E, og Hon-522H, hhv. Genomisk DNA blev isoleret fra DU145 celler til skabelonen. Alle konstruktioner, herunder PCR-genererede DNA-fragmenter blev bekræftet ved sekventering.

DNA-transfektion og Luciferaseassayreagens

Celler blev cotransficeret med forskellige osteonectin promotor luciferase reporter plasmider og pCMV-pgal (galactosidase) i en 5 : 1 molforhold ved hjælp af Lipofectamine 2000 transfektionsreagens (Invitrogen). Efter 48 timers inkubation blev celleekstrakter fremstillet for luciferase og β-gal aktivitet vurderinger ved hjælp af Luciferase Assay System og β-galactosidase Enzyme Assay System (Promega), henholdsvis ifølge producentens instruktioner. Relativ luciferaseaktivitet blev beregnet som de ildflueluciferase relative lysenheder (RLU) divideret med den tilsvarende værdi for β-gal-aktivitet til stede i hver prøve. Tre uafhængige forsøg blev udført i tre eksemplarer.

Design af adenovirusvektorer

Ad-522E-TK og Ad-522E-Luc adenovirusvektorer (type 5) var designet og masse-producerede efter den etablerede protokol [25]. Kort beskrevet plasmiderne p522E-TK og p522E-Luc indeholdende en Hon-522E-promotoren og herpes simplex virus TK-genet og luciferasegenet, henholdsvis blev konstrueret ved at indsætte ekspressionskassetten i E1A deleteret region af Ad5 adenovirale shuttle-vektor pΔ E1sp1B. En replikationsdefekte rekombinante Ad522E-TK adenovirus blev genereret i 293-celler ved co-transfektion af disse celler med både ekspressionen shuttle plasmid og et cirkulært Ad genom plasmid (pJM17) ved anvendelse af standard calciumphosphat-fældning metoden [26]; Ad-CMV-TK og Ad-CMV-Luc blev bygget på samme måde.

thymidinkinase aktivitet assay

TK aktivitet i Ad-522E-TK og Ad-CMV-TK-inficerede cellelinjer blev analyseret ved phosphorylering af [

3H] GCV [27]. Kort fortalt blev supernatantfraktionen af ​​rå celleekstrakter blandet med et tilsvarende volumen af ​​TK assaybuffer indeholdende 0,2 pCi [

3H] GCV (Moravek Biochemicals, CA, USA), 3 mM MgCb

2, 3 mM ATP, 10 ug /pi bovint serumalbumin og 50 mM natriumphosphatpuffer (pH 6,5). Reaktionsblandingen blev inkuberet ved 37 ° C i 90 minutter, overført til DE-81 skiver (Whatman, Hillsboro, OR, USA), lufttørret og vasket grundigt med 50% ethanol. Phosphoryleret [

3H] GCV bundet til skiverne blev bestemt med en scintillationstæller (Beckman Coulter Inc., Schaumburg, IL, USA). Tre uafhængige forsøg blev udført tredobbelt.

In vitro

cytotoksicitetsassays

Celler blev podet på 24-brønds plader ved en densitet på 2 x 10

4-celler per brønd. Efter 24 timer blev cellerne inficeret med Ad-522E-TK i området 0-100 infektionsmultiplicitet (MOI). Efter en 2 timer adsorption blev virusholdige medium udskiftet med frisk medium. Efter 24 timer blev cellerne inkuberet i nærværelse eller fravær af 10 pg /mL GCV i 5 dage efterfulgt af en krystalviolet-farvning; Efterfølgende blev den relative celletal bedømmes ved en optisk densitet (OD) på 590 nm efter farvning. Hvert forsøg blev udført tre gange.

Animal undersøgelse

Alle dyreforsøg blev godkendt af og overholdt reglerne i Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) i Taipei Medical University (overlakeres 2013-0047). Seks uger gamle mandlige atymiske, nøgne mus BALB /cAnN.Cg-Foxn1nu /CrlNarl mus blev opnået fra National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan). Dyrene blev holdt under standard patogenfrie betingelser og plejet efter de kriterier, der er skitseret i National Academy of Sciences Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Til analyse af Hon-522E promotor-aktivitet

in vivo

, 1 × 10

5 PC3M celler i 10 pi PBS blev injiceret i de ventrale prostata af mus. Ved 5 dage efter tumorcelleinjektion, tumorbærende eller ubehandlet mus modtog intravenøs administration af 1 × 10

9 pfu Ad-522E-Luc eller Ad-CMV-Luc gennem halevenen (n = 5). Mus organer og prostata tumorxenografter blev høstet for luciferaseaktiviteten assayet 2 dage efter viral injektion. Til vurdering af Ad-522E-TK kombineret med GCV-induceret hæmning af tumorvækst

in vivo

, 5 × 10

5 PC3M celler i 50 pi PBS blev injiceret subkutant i flankerne af musene. Når tumoren blev palpable (3-4 mm i diameter) blev dyrene tilfældigt inddelt i 4 forsøgsgrupper (n = 8 for hver gruppe): gruppe 1, PBS behandling; gruppe 2, kun GCV; gruppe 3, Ad-522E-TK kombineret med PBS; og gruppe 4, Ad-522E-TK kombineret med GCV. Ad-522E-TK (50 pi; 2 × 10

9 pfu) i PBS blev administreret gennem intratumoral injektion hver anden dag i 3 gange. GCV (100 pi) blev administreret dagligt via intraperitoneal injektion i en dosis på 40 mg /kg legemsvægt i 2 uger. Todimensionale tumor målinger blev udført to gange om ugen med passere, og tumorvolumenet blev beregnet ved anvendelse af den forenklede formel for en roterende ellipsoide (L × B

2 × 0,5236). Dyrene blev aflivet 5 uger efter behandling med CO

2 for eutanasi, og tumorer var begejstrede for histopatologisk undersøgelse.

Immunhistokemi (IHC)

IHC farvning blev udført ved hjælp af Novolink Polymer Detection System (Leica Microsystems, Newcastle Upon Tyne, UK) som tidligere beskrevet [28]. Ki-67-protein blev påvist i tumorxenotransplantater med muse antihuman Ki-67-monoklonalt antistof (1: 100; NCL-Ki67-MM1, Leica Biosystems). Apoptose blev vurderet ved anvendelse af Apo-BrdU-IHC In Situ DNA Fragmentation Assay Kit (BioVision, Inc., Milpitas, CA, USA) som beskrevet [28]. IHC farvning for osteonectin blev udført på prostata TMA anvendelse af et anti-humant-osteonectin monoklonalt antistof (1:50; NCL-O-nectin, Leica Biosystems). Hver TMA spot blev undersøgt af en patolog (J.L.C.) ved hjælp af Allred pointsystem [29]. Den numeriske værdi for samlede intensitet (intensitet score) er baseret på en 4-punkts-system: 0, 1, 2, og 3 (for ingen, let, medium eller mørk farvning). Den numeriske værdi for procent farves (andel score) er bestemt af en geometrisk division; ingen plet = 0; ≤1 /100 celler farves = 1; ≤1 /10 celler farvet = 2; ≤1 /3-celler farves = 3, ≤2 /3 celler farvet = 4; alle celler farves = 5. Tilsætning af de to værdier giver den samlede Allred score [30].

Statistisk analyse

Alle data præsenteres som den gennemsnitlige (standardafvigelse [SD]), medmindre andet specificeret. Analyse blev udført ved anvendelse af to-halet t-test. P 0,05 blev betragtet som signifikant.

Resultater

Angivelse af osteonectin i prostata cancer og stromale celler

Foreningen af ​​osteonectin udtryk med human cancer progression blev oprindeligt evalueret gennem real-time RT -PCR på androgen-responsive LNCaP og androgen-ufølsom PC3 prostata cancercellelinjer. I serien af ​​LNCaP afstamningsceller cellelinier, ekspressionen af ​​osteonectin korreleret med øget knogle metastatisk potentiale, hvor hormonrefraktær og knogle metastatisk C4-2B udtrykt et højere osteonectin end gjorde sin parentale androgen-afhængige LNCaP og androgen-uafhængige C4 -2 celler. Tilsvarende PC3M, den meget metastatisk derivat udtrykt 18 gange højere niveauer af osteonectin end deres parentale PC3-celler, som oprindeligt blev afledt af knoglemetastaser af prostatacancer (Fig 1A). Disse resultater viste en korrelation mellem forhøjet osteonectin udtryk og metastatisk CRPC progression. Som prostatakræft knoglemetastaser betragtes som et mikromiljø-drevet sygdom, de højere niveauer af osteonectin udtrykt af humane knogle stromaceller end det prostatacancerceller blev observeret ved anvendelse hFOB osteoblast og HS27A knoglemarvsceller afledt fibroblast cellelinjer (Fig 1A). For at vurdere differentiel ekspression af osteonectin mellem noncancerous og cancerøse prostata-epitelceller samt de normale og cancerassocierede stromale celler i samme individer, LCM dissekerede prøver fra primære prostatatumorer blev anvendt. Blandt par af de normale og maligne prostata væv, 3 af 4 patienters prøver viste en signifikant øget udtryk for osteonectin i cancerceller og kræft-tilstødende stromale celler i sammenligning med deres normale modpart; og den anden havde en mindsket ekspressionsmønster i tumorvæv (figur 1B).

Kvantitativ RT-PCR-analyse af osteonectin mRNA-ekspression i (A) en seriel af human prostatacancer og knogle stromale (hFOB og HS27A) cellelinier og i (B) LCM-isoleret prostata epitel og stromaceller fra matchede par af primær prostata tumor (T) og normal prostata (N) væv afledt fra 4 patienter (Pt s 1 ~ 4). Den relative genekspression af osteonectin var repræsenteret som 2

-ΔCT, med ACt bestemmes ved at subtrahere den gennemsnitlige husholdning gen HSPCB tærskelcyklus fra gennemsnittet målgenet værdi. Data er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter og vist som middelværdi ± SD. * P 0,05, ** p 0,001 versus normale celler. (C) Scatter plot af IHC-farvning score for osteonectin i prostata epitel og stroma i snit af human prostata væv microarray indeholdende primær prostata tumor (n = 40) og normale prostata prøver (n = 9). Repræsentative billeder af IHC farvning af osteonectin i parrede prostata tumor og normal prostata væv fra to individuelle patienter på en forstørrelse på 40 × og 100 × blev vist til højre. Pilen og pilespids angiver positiv farvning i stromale og epitelceller, henholdsvis.

For yderligere at validere sammenhængen mellem overekspression af osteonectin og prostata carcinogenese i kliniske prøver, blev udført på immunhistokemiske (IHC) analyse en prostata væv microarray indeholdende 40 primære prostatatumorer og 9 matchede normale prostata prøver. I hver kerne, blev immunoreaktivitet for osteonectin målt i afsnit med normal stroma, normalt epitel, tumor stroma, og tumor epitel. Selv om disse forskelle ikke var statistisk signifikant (P = 0,2654 og 0,4042), rækken af ​​samlede Allred score i de samlede prøver af tumor epitel og tumorstroma var højere i forhold til normalt epitel og normal stroma, (fig 1C). Forskellen var mere signifikant, når der kun matchede par af prostata tumor og normale prostata prøver blev analyseret (P = 0,085 og 0,2165 for epithelial-farvning og stromal-farvning, henholdsvis). Manglen på statistisk signifikans kan skyldes den lille stikprøve. Desuden kan detekteres kraftig farvning af osteonectin i prøven af ​​prostatacancer knoglemetastaser (S1 Fig). Retningen af ​​effekten foreslår autokrine og parakrine handlinger osteonectin ved tumor og tumor mikromiljø forårsager prostatakræft malignitet og metastase.

Identifikation af yderligere transkriptionelle regulerende elementer i den menneskelige osteonectin promotor omegn

GGA-box 1 i den menneskelige osteonectin (HON) promoter region er afgørende for maksimal transkriptionel aktivitet, hvorimod pyrimidin-rige spacer mellem GGA-rubrik 1 og 2 udøver en nedregulerende effekt [31]. Sammenligning af kvæg, mus og humane osteonectin exon 1 DNA-sekvenser afslørede en bemærkelsesværdig multipel gentagelse af sekvensen CCTG i alle arter, med en konsistent klynge af 7-8 baser opstrøms fra starten af ​​exon 1 [32]. Vi undersøgte derfor 2 Hon-promotor-reporterkonstruktioner, p522E-Luc og p522H-Luc, for at undersøge den rolle, som CCTG sekvens i HON promotorfunktion. Promotorfragmentet i p522H-Luc er identisk med den i pGL2-spdel, som har potentiale transkriptionsaktivitet i humane cellelinier [31]. p522E-Luc har en 5′-område af Hon promotorsekvenser ligner den i p522H-Luc, men 3′-enden omfatter bp + 62, hvori 4 CCTG enheder er inkluderet (Fig 2A). Transfektion af disse konstruktioner og PGL-3-TATA (der tjener som reference for promotoraktivitet) i humane knogle stromale cellelinier, herunder hFOB, HS27A, og osteosarkom MG63 viste en markant stigning i luciferaseaktivitet ved p522E-Luc sammenlignet med p522H- luc (fig 2B). Yderligere 3 ‘forlængelse af promotoren i bp 73 placeret ved intron 1 region (p522I-Luc) resulterede i nedsat luciferaseaktivitet, hvilket tydeligt viser, at regionen mellem bp +39 og +62 bp er ansvarlig for den yderligere opregulering af Hon promotor aktivitet i humane knogleceller, mens regionen mellem bp 63 og bp 73 indeholder et negativt element regulerende.

(a) Schema af forskellige osteonectin-promotor-drevne luciferase konstruktioner. Alle sekvenser er nummereret i forhold til +1 (transkriptionsinitieringsstedet). Partiel sekvens af osteonectin promotoren fra baser 40-62 indeholdende 4 CCGT-motiver (understreget). Et modificeret pGL3-konstruktion (pGL3-TATA) med en kunstig TATA-boks indsat opstrøms for luciferasereportergenet blev anvendt som kontrol af basalt niveau promotoraktivitet. (B, C) Sammenligning af luciferase reporter aktivitet af Hon-promotor-konstruktioner i menneskelige knogle stromale cellelinier og den menneskelige prostata cancer cellelinjer med

in vitro

transfektion, og i (D) mus organer ved

i vivo

genlevering. (B, C) Den relative luciferase aktivitet af forskellige konstruktioner blev divideret med den normaliserede aktivitet af tom vektor (pGL3-TATA) og udtrykt som fold-change i forhold til kontrol. * P ≤ 0,05 over p522H-Luc. (D) Luciferaseaktiviteter (i relative lysenheder [RLU] pr milligram protein) blev bestemt i de repræsentative organer 2 dage efter intravenøs injektion af 1 x 10

9 pfu Ad-522E-TK eller Ad-CMV-TK i voksne mus (n = 5).

Vi næste evalueret den transkriptionelle aktivitet af Hon-522E promotoren i forskellige prostatacancer-cellelinier afspejler forskellige stadier af prostatacancer progression. Transfektionen data viste, at Hon-522E promotoraktivitet blev påvist i alle testede cellelinier. Men sammenligning af luciferaseaktiviteten af ​​disse transficerede prostatacancercellelinjer og dem med endogen osteonectin RNA-ekspression (Fig 1A) afslørede, at Hon-522E promotoraktiviteten er relativt højere i AR-negativ, mere aggressiv, og metastatiske cellelinier, herunder DU145 , PC3 og PC3M celler i forhold til AR-udtrykkende LNCaP, c4-2 og C4-2B cellelinjer (fig 2C).

for at vurdere den potentielle anvendelighed af Hon-522E promotor i at udtrykke et transgen i en vævsspecifik måde

in vivo

, en adenovirusvektor indeholdende Hon-522E promotor eller den allestedsnærværende cytomegalovirus (CMV) promotor, der driver luciferasereportergenet (Ad-522E-Luc eller Ad-CMV-Luc) blev administreret intravenøst ​​til mandlige athymiske mus enten raske eller transporterer ortotopisk PC3M tumorer. Efter 2 dages viral administration, større organer, herunder lever, lunge, nyre, milt, tarm, hjerte, hjerne, colon, testikler, prostata, og muskler, og PC3M tumorxenografter blev høstet til måling af luciferase-ekspression (Fig 2D) . Vi observerede, at i de normale organer, Ad-522E-Luc medieret luciferase transgen ekspression i lever, milt og lunge var signifikant lavere end for Ad-CMV-Luc, med reduktion satser på 16%, 41%, og 1%, hhv. I overensstemmelse med en tidligere undersøgelse afslørende forøget ekspression af osteonectin mRNA i pankreatiske duktale epitelceller [33], luciferaseaktivitet transduceres af Ad-522E-Luc i bugspytkirtlen var 34 gange højere end den induceret af Ad-CMV-Luc. Mens luciferaseaktiviteten blev knap nok detekteret i normal mus prostata, uanset Ad-vektor administration blev ekstremt høj luciferaseekspression af Ad-522E-Luc observeret i PC3M prostata-xenotransplantater, med ekspression 5 gange større end af Ad-CMV-Luc. Disse resultater antyder, at Hon-522E promotoren er egnet med hensyn til effektiv og selektiv transgenekspression for transkriptionel målretning af AR-negative og metastatisk prostatacancer celler.

Evaluering af

in vitro

cytotoksicitet rekombinant Ad-522E-TK i prostatacancer og knogle stromaceller

for at vurdere mulighederne for Hon promotor-styret co-targeting genterapi for prostatakræft, vi designede en replikering adenoviral vektor, Ad-522E- TK, bærer Hon-522E-promotor-drevet herpes simplex virus TK genet. Effektiviteten af ​​TK genafgivelse i prostatacancer og knogle stromale cellelinier blev bestemt under anvendelse af TK enzymatisk aktivitet assay efter udsættelse disse celler til Ad-522E-TK og normaliseret til ekstern styring Ad-CMV-TK for viral infektivitet. De cellelinjer testet, herunder prostatakræft og knogle stromale cellelinier, afslørede vellykket TK-genet transduktion af Ad-522E-TK med en mindst to gange stærkere aktivitet i AR-negative prostatacancerceller DU145, PC3 og PC3M samt knogle stromaceller MG63 og HS27A i sammenligning med AR-positive LNCaP afstamning cellelinjer (fig 3A), som var magen til resultatet af luciferase reporter aktivitet ved p522E-Luc (fig 2C). Mere påfaldende, Ad-522E-TK-inficerede PC3M celler udviste en højere snarere end lavere i TK-aktivitet end celler inficeret med Ad-CMV-TK; dette resultat var i overensstemmelse med den af ​​Ad-522E-Luc transgen aktivitet i PC3M xenotransplantattumorer (Fig 2D). Efter yderligere prodrug ganciclovir (GCV) behandling, Ad-522E-TK markant og dosisafhængigt faldt væksten af ​​PC3M celler med en højere effektivitet end Ad-CMV-Luc; Ad-522E-TK eller GCV alene udøvede nogen cytotoksiske virkninger på PC3M celler (Fig 3B). Desuden infektion af MG63 og HS27A med Ad-522E-TK inducerede også betydelig celledød, når det kombineres med GCV (figur 3C). Disse resultater viste evnen hos Ad-522E-TK til at målrette både prostatakræft og knogle stromaceller.

(A). Sammenligning af TK transgen ekspression i human prostata cancer celle celler og knogler stromale cellelinier af Ad-522E-TK og Ad-CMA-TK.