PLoS ONE: tarmkræft Patienter med lav Overflod af KRAS mutation kan drage fordel af EGFR-antistof-Therapy

Abstrakt

epidermal vækstfaktor receptor monoklonalt antistof blev godkendt til behandling af metastatisk kolorektal cancer patienter bærer KRAS vildtype DNA. viste imidlertid seneste undersøgelser, at patienter med KRAS G13D mutation kan drage fordel af EGFR-antistof terapi. I denne undersøgelse har vi forsøgt at undersøge, om den overflod af KRAS mutation kan påvirke effekten af ​​EGFR-antistof terapi. Vi etablerede første en PNA-PCR-metode, som kan beregne procentdelen af ​​KRAS mutation i total DNA og bevist sin evne på 47 tyktarmskræft prøver bærer KRAS-mutationer. Derefter analyserede vi sammenhængen mellem den overflod af KRAS-mutationer og effekten af ​​EGFR antistofbehandling i yderligere 35 metastatisk kolorektal kræftpatienter. Vi beviste, at PNA-PCR-assay kunne beregne den overflod af KRAS mutation og procentdelen af ​​mutant-DNA i tumorceller varierede meget (10,8% ~98.3%) på de 47 patienter med tarmkræft. Effekten af ​​EGFR-antistof korreleret med den overflod af KRAS-mutationer: i KRAS mutation mindre end 30% gruppe, sygdomskontrolrate var 44,4% (4/9); den sygdomskontrolrate af 30~80% gruppe var 5,6% (1/18) og 80% gruppe var 12,5% (1/8) (P = 0,038). Sammenfattende viste vores undersøgelse, at PNA-PCR-metoden nemt kunne registrere den procentdel af KRAS mutation i tumorceller og kolorektal cancer patienter med lav overflod af KRAS mutation kan drage fordel af EGFR-antistof terapi

Henvisning:. Yu S, Xiao X, Lu J, Qian X, Liu B, Feng J (2013) tarmkræft Patienter med lav overflod af KRAS mutation kan drage fordel af EGFR-antistof-terapi. PLoS ONE 8 (7): e68022. doi: 10,1371 /journal.pone.0068022

Redaktør: Ramon Andrade de Mello, Faculty of Medicine, University of Porto, Portugal

modtaget: 1 februar, 2013; Accepteret: 24 maj 2013; Udgivet: 9 jul 2013

Copyright: © 2013 Yu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af Wu Jieping Medical Foundation (320.6700.09050), https://www.wjpmf.org/. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) monoklonalt antistof blev godkendt til behandling af metastatisk kolorektal kræftpatienter uden KRAS mutationer. KRAS mutationer er beskrevet at forekomme hos ca. 40% af colorektal cancer og de fleste af dem (90%) forekommer i codon 12 og 13 [1], [2]. Flere fase II og III kliniske forsøg har vist sig at være en mangel på reaktion på anti-EGFR-behandling i nærværelse af KRAS-mutationer [3], [4], [5]. Disse resultater førte Det Europæiske Lægemiddelagentur og Food and Drug Administration til at begrænse anti-EGFR behandling kun til patienter, der bærer vildtype-KRAS tumorer i 2009 [6].

Men viste de seneste undersøgelser, at KRAS G13D mutation og kodon 12 mutationer er faktisk ikke skabt lige forudsige kliniske resultater af anti-EGFR-behandling i metastatiske kolorektal cancer (mCRC) patienter [7], [8]. Patienter der bærer KRAS G13D mutation kan stadig nyde godt af cetuximab behandling [9]. I en multivariat analyse, patienter med G13D mutation tumorer behandlet med cetuximab havde længere samlet overlevelse (median, 7,6 måneder vs 5,7 måneder), og længere progressionsfri overlevelse (median, 4,0 måneder vs 1,9 måneder) end andre KRAS muterede tumorer [10]. Adskillige meta-analyse også fik lignende resultater [7], [11]. Bortset fra, at en samlet analyse af tre forsøg viste, at specifik mutation i KRAS codon 12 havde også forskellig indvirkning på behandlingseffekt i kolorektal kræftpatienter og tumor bærer en KRAS G12D mutation viste en stærk tendens til et mere gunstigt resultat sammenligne med andre codon 12 mutationer [12]. Alle disse undersøgelser viste os, at ikke alle KRAS muterede tumorer var resistente over for anti-EGFR-behandling. Som forsker fortsatte, var det ikke tilstrækkeligt til groft skelne patienter med KRAS mutation status.

Da tumor havde stor heterogenitet, forskellige tumorvæv kan også have varierende overflod af KRAS muteret tumorceller. Da hver screening metode havde sin påvisning følsomhed, når tumoren KRAS mutation andel reduceres i et vist omfang, denne tumor prøve kan anerkendes som KRAS vildtype. Efterhånden som flere og flere meget følsomme screeningsmetoder er etableret, vil flere tumor prøver klassificeres som KRAS muterede dem [13], [14]. Vi ved stadig ikke, om disse prøver vil være resistente over for EGFR-antistof-terapi. I denne undersøgelse har vi hypotese overflod af KRAS mutation kan også påvirke effektiviteten af ​​anti-EGFR behandling. Faktisk ligner med vores hypotese, i 2011, Zhou et al fandt, at høj overflod af EGFR-mutationer havde højere objektiv respons end lav tæthed i ikke-småcellet lungekræft behandlet med gefitinib [15].

I vores tidligere undersøgelse har vi etableret en PNA-PCR (peptidnukleinsyrer-PCR) -metoden, som kunne undertrykke amplifikation af KRAS vildtype DNA. I denne undersøgelse, vi først ændret denne PNA-PCR-metode til at sikre, at det kunne helt undertrykke forstærkning af KRAS vildtype DNA og bekræftede sin undertrykkelse evne på 47 tumorprøver bærer KRAS-mutationer. Så vi kvantificeres og beregnes andelen af ​​KRAS muteret DNA i tumorvæv og fandt, at andelen varierede meget. Endelig har vi sammenlignet forholdet mellem KRAS mutation overflod og effektiviteten af ​​cetuximab i yderligere 35 metastatisk kolorektal cancer patienter.

PNA-PCR-metoden blev etableret før i vores laboratorium [16], og i denne undersøgelse vi gjort mindre justeringer for at sikre, at det kunne kvantificere og beregne andelen af ​​KRAS muteret DNA. Denne metode kunne amplificere KRAS muterede DNA udelukkende og kunne kvantificere KRAS muterede DNA samtidig. På samme tid, kunne vi også kvantificere mængden af ​​total-DNA (både KRAS mutant og KRAS vildtype DNA) ved regelmæssig kvantitativ PCR (PCR uden PNA). Derefter kunne vi nemt beregne den procentdel af KRAS muterede DNA i total DNA.

Materialer og metoder Salg

cellelinjer og patienter Salg

coloncarcinom cellelinier SW480 og SW116 (indkøbt fra Biok KM, Kina) blev anvendt i denne undersøgelse. Cell line SW480 indeholder en homozygot KRAS codon 12 mutation (GGT → GTT) og SW116 havne vildtype-KRAS-genet. I alt 47 kolorektal kræftpatienters FFPE prøver, hvis KRAS status blev vist sig at være mutant enten KRAS codon 12 eller codon 13 blev opnået fra Drum Tower Hospital fra november 2008 til december 2010. Yderligere 35 kolorektal cancer patienter med KRAS mutation blev indsamlet fra Jiangsu Cancer Hospital fra 2006 til 2010. Forskellige fra patienter over, alle disse 35 patienter fik cetuximab behandling. Informeret skriftligt samtykke blev opnået fra alle patienter før behandling startes. Alle behandling beslutninger blev foretaget af de behandlende læger før designe af undersøgelsen. Undersøgelsen blev godkendt af institutionelle etiske komité af hospitaler (etiske komité af Drum Tower Hospital og etiske komité i Jiangsu Cancer Hospital), før denne undersøgelse blev gennemført.

DNA ekstraktion fra SW480, SW116 og FFPE væv

efter manuel macrodissection af FFPE væv, blev hæmatoxylin og eosin-farvede sektioner af FFPE væv gennemgået af tre erfarne patologer til at evaluere den overflod af tumorceller. Den detaljerede metode evaluering er beskrevet før [17]. Prøvens tumorcelle procentdel er gennemsnittet af værdierne opnået ved de tre patologer. Genomisk DNA blev isoleret fra FFPE prøver med SW116 og SW480 Recover All totale nukleinsyre isolation kit (katalog nr. AM1975, Ambion) ifølge producentens instruktioner. En negativ kontrol blev udført for at undersøge muligheden for forurening. DNA-koncentrationer blev bestemt ved UV (260 nm) spektrofotometer.

PNA-PCR Plus Pyrosequencing

PNA-PCR og pyrosekventering betingelser er blevet beskrevet tidligere med undtagelse af PCR Master Mix [16]. Kort beskrevet PCR Master Mix indeholdt slutkoncentrationer af reagenser som følger: 1 × SYBR Premix Ex Taq Mix (Takara, kode DRR041A), 0,15 pmol /L fremad og reverse primere, 0,5 pmol /L PNA og vis mængde DNA. PNA-sekvensen var 5′-CCTACGCCACCAGCTCC-3 ‘. Den fremadrettede primer sekvens var 5’-GCCTGCTGAAAATGACTGAATATAA-3 ‘og den reverse primer var 5′-biotin-CGTCAAGGCACTCTTGCCTAC-3’. Termocyklingen blev udført i en Mx3000P (Stratagene) realtids-PCR instruktion og cykling var som følger: 98 ° C i 30 s og derefter 40 cykler af 98 ° C i 10 s, 72 ° C i 10 s, 62 ° C i 20 s og 72 ° C i 20 s. Pyrosekventering blev udført i Pyrosekventering PSQ96 HS System (Biotage AB). Sekvensen af ​​pyrosekventering primeren var 5′-TGTGGTAGTTGGAGCT-3 ‘. Nukleotid dispensation ordre var cyklisk TACG fra 5 ’til 3′.

Patient Befolkning og Behandlingsregimer

Vi analyserede retrospektivt 35 patienter med histologisk bekræftet mCRC med KRAS mutation fra 2006 til 2010. Alle tumorer var kolorektale adenokarcinomer. Patienterne gav informeret skriftligt samtykke og blev behandlet med cetuximab eller ceruximab-baserede regimer. Cetuximab blev administreret som enkeltstof eller i kombination med kemoterapi-baserede regimer med den samme dosis indtil sygdomsprogression. Cetuximab blev administreret i en dosis på 250 mg /m

2 (initial dosis var 400 mg /m

2). Der var 28 patienter, som fik cetuximab alene. Der var 4 patienter, der fik 5-Fu behandling plus cetuximab behandling efter svigt af 5-Fu terapi. Yderligere 3 patienter fik irinotecan, 5-Fu og cetuximab behandling efter sygdom fremskridt irinotecan plus 5-Fu terapi.

Klinisk Evaluering og tumorrespons Kriterier

Den kliniske respons blev vurderet hver 2 måneder ved computertomografi (CT) scanning af brystet og maven og /eller magnetisk respons scanning (MR). Svaret evalueringskriterier i Solid Tumor (RECIST) version 1.0 blev vedtaget for klinisk vurdering. Ifølge RECIST version 1.0, blev komplet respons (CR) defineret som forsvinden af ​​alle target læsioner; partielt respons (PR) var mindst et fald på 30% i summen af ​​de længste diametre (SLD) af target-læsioner, der som reference baseline SLD; progressiv sygdom (PD) var mindst en stigning i SLD af target læsioner 20%, idet der som reference den mindste SLD registreret siden behandlingen startede; stabil sygdom (SD) var hverken tilstrækkelig fald i SLD at kvalificere sig til PR eller tilstrækkelig forøgelse SLD at kvalificere sig til PD. To onkologer og radiologer verificeret klinisk respons for alle patienter i en blindet måde.

Statistisk analyse

Patienter med CR, PR og SD blev defineret som patienter med sygdomsbekæmpelse og den syge kontrol sats blev beregnet som antallet af sygdomsbekæmpelse patient /antallet af alle patienter. Chi-square test blev udført for at sammenligne den sygdomsbekæmpelse på forskellige grupper i de 35 kolorektale patienter. Chi-square blev udført af SPSS 16,0. En p-værdi på 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Validering af PNA-PCR metode på cellelinier

Vi fandt, at når vi tilføjet 100 ng KRAS wild. -type DNA i PNA-PCR-assayet, kunne PNA undertrykke amplifikation af vildtype-DNA. Men denne undertrykkelse var ikke fuldstændig og stabil efter gentagne tests (fig. 1a). Men når vi tilføjet 100 ng KRAS vildtype-DNA og 0,01 ng KRAS muterede DNA i PNA-PCR-assay, kunne KRAS vildtype-DNA være fuldstændigt og stabilt undertrykkes og kun KRAS muterede DNA blev amplificeret efter bekræftelse af pyrosekventering (fig. 1B), hvilket indikerede, at selv den mutante DNA var sjældne sammenligne med vildtype, PNA assay stadig amplificere mutant DNA udelukkende og denne forstærkning kan medvirke til at undertrykke den vildtype-DNA-amplifikation fuldstændigt.

(A) der er vildtype PCR-produkter, når der tilføjes 100 ng KRAS vildtype DNA i PNA-PCR-analysen. (B) Der er kun KRAS muterede PCR-produkter, når der tilføjes 100 ng vildtype DNA og 0,01 ng KRAS muterede DNA.

For at sikre stabiliteten af ​​analysen, vi faldt mængden af vildtype-DNA til 10 ng tilsat i assayet og fundet, at PNA fuldstændigt og stabilt kunne undertrykke amplifikation af vildtype-DNA selv i fravær af KRAS muterede DNA (ingen PCR-produkter, bekræftelse ved gelelektroforese og pyrosekventering, data ikke vist ). Derfor, i det følgende eksperiment, vi kontrollerede DNA tilføjet i analysen ikke mere end 10 ng.

Validering af PNA-PCR metode på kræftpatienters tumorvæv

I alt 47 kolorektal kræftpatienter blev bekræftet at bære KRAS mutation af COLD-PCR /Sanger sekventering [17]. I alt var der 15 G12D, 13 G12V, 13 G13D, 2 G12S, 2G12A, 2G13R og 1G12C KRAS-mutationer (én patient bærer to typer af KRAS-mutationer). Procentdelen af ​​tumorcelle i FFPE prøver blev opført i tabel 1. Ikke mere end 10 ng DNA fra FFPE prøve blev tilsat til PNA-PCR-assay og PCR-produkter blev sekventeret ved Pyrosekventering. Som vi forventede, PNA-PCR assay forstærket KRAS muteret DNA udelukkende. Figur 2 viser, at ingen vildtype-DNA blev amplificeret i PNA-PCR-assay.

En tumor væv indeholder en GGT → GCT-mutationen. B Tumor væv indeholder en GGT → GAT-mutationen. C Tumor væv indeholder en GGC → GAC mutation.

Find og Beregn Procentdel af Mutant KRAS DNA

Før detektere den procentdel af mutant DNA af tumorvæv, vi analyserede standardkurven af ​​PNA-PCR-assayet og fundet regressionslinien var lineær (hældning = -3,25; r = 0,977) i området på 0,02 til 10 ng af KRAS muterede DNA (fig. 3), hvilket betyder dette assay kunne kvantificere KRAS muterede DNA.

Varierende mængder af KRAS muterede DNA blev plottet mod Ct-værdier (tærskel cyklus). Slope, r værdi og regressionslinje vises.

Ikke mere end 10 ng DNA fra FFPE væv (2 ul) blev sat til PNA-PCR assay og regelmæssig PCR assay (uden PNA) henholdsvis (alle reaktioner blev kørt tredobbelt). En prøve samlede DNA og KRAS muterede DNA kunne læses af standardkurve. DNA beløb i regelmæssig PCR-assay var totalt DNA som alle former for DNA kunne ligeledes amplificeret og DNA beløb i PNA-PCR assay blev KRAS mutant DNA som vildtype man ikke amplificerer i dette assay. Procentdelen af ​​KRAS muterede DNA blev beregnet som mængden af ​​KRAS muterede DNA /mængden af ​​totalt DNA. Procentdelen af ​​KRAS muterede DNA i tumorceller blev beregnet som en procentdel af KRAS muterede DNA i total DNA /procentdel af tumorceller i tumorvæv. Procentdelen af ​​muterede DNA i tumorceller varierede fra 10,8% til 98,3% (tabel 1). I alt var der 10 prøver indeholdende mutant DNA mindre end 30%, 27 prøver fra 30% til 80% og 10 prøver mere end 80%.

Procentdel af KRAS mutation i tumorceller og Korrelation til svar

Patientens karakteristika og procentdel af KRAS mutation i tumorceller er opført i tabel 2. Den partielt respons var 2,9% (1/35), stabil sygdom 14,3% (5/35) og progressiv sygdom 82,9% ( 29/35). Sammenhæng mellem procentdel af KRAS mutation i tumorceller og sygdomsbekæmpelse blev opført i tabel 3. I alt i KRAS mutation mindre end 30% gruppe sygdomskontrolrate var 44,4%; den sygdomskontrolrate af 30~80% gruppe var 5,6% og 80% gruppe var 12,5% (P = 0,038). Det var værd at bemærke, at i 80% gruppe patienten, som havde stabil sygdom indeholder en G13D mutation. I denne undersøgelse var responsraten 18,5% (5/27) for KRAS 12 codon mutationer og 12,5% (1/8) for KRAS G13D mutation (tabel 4). Vi har ikke observere, at patienter med KRAS G13D mutation havde bedre responsrate (tabel 4). Vejviser

Diskussion

Den foreliggende undersøgelse viste, at PNA-PCR metode kunne kvantificere og beregne KRAS mutation overflod af tumorceller. Så vidt vi ved, det første viste vi, at lav overflod af KRAS mutation ( 30%) også kunne have gavn af anti-EGFR behandling i metastatisk kolorektal cancer patienter. Da tidligere undersøgelser kun fokuseret på, om mutationen var positiv, vores undersøgelse afslørede en ny forskning koncept af EGFR-antistof terapi.

I denne undersøgelse var der 7 patienter behandlet med både cetuximab og kemoterapi. Men alle disse 7 patienter fik cetuximab efter svigt af oprindelige kemoterapi. Derfor er vi en tendens til at tro, at patienternes respons på behandlingen primært bidraget til cetuximab. Selv om der var undersøgelser viste, at patienter med KRAS G13D mutation viste en stærk tendens til et mere gunstigt resultat sammenligne med codon 12 mutationer, vi ikke overholdt dette i vores studie potentielt grund af det begrænsede antal patienter i denne undersøgelse.

Vores resultater viste, at procentdelen af ​​KRAS muterede DNA i tumorceller varierede fra 10,8% til 98,3%, og denne fordeling var kontinuerlig. Som vi forventede, patienter der bærer lav tæthed ( 30%) af KRAS-mutation havde højere sygdomsbekæmpelse sats til cetuximab end andre grupper (44,4% for 30% gruppe vs 5,6% for 30~80% gruppe og 12,5% for 80% gruppe, P = 0,038). Hvis vi udelukket sygdomsbekæmpelse patient, der bar en G13D mutation i . 80% gruppe, tendensen at lav overflod havde højere sygdomskontrolrate var mere indlysende

Selv om direkte Sanger sekventering blev betragtet som en klassisk metode til screening KRAS-mutationer, flere og flere høje følsomhed metoder såsom COLD-PCR, ARMS, mutant-beriget PCR, konkurrencedygtig forstærkning af differentielt smeltende amplikoner (CADMA) [18], [19], [20], [21] blev anvendt til skærm KRAS-mutationer. Disse metoder bistået os at finde flere KRAS muterede prøver. Men om disse prøver kunne drage fordel af anti-EGFR-behandling fortsat ukendt. Vores undersøgelse viste, at disse prøver med lav overflod af KRAS-mutationer kan drage fordel af EGFR-antistof terapi.

Hvorfor har tumor med lav overflod af KRAS mutation har en tendens til respons på EGFR-antistof terapi? Et potentielt forklaring var, at tumorceller havde stor heterogenitet. Når KRAS muterede tumorceller var mindretal, de fleste af KRAS-vildtypen tumorceller kunne også dræbt af EGFR antistofbehandling og i denne proces kræftpatienter kunne vise relativt lang tid af stabil sygdom eller endda delvis respons. Men som terapi fortsætter, bliver flere og flere KRAS vildtype tumor udslettet, den overflod af KRAS mutation bliver højere og patienter tendens til at have en progression sygdom og bliver resistente over for EGFR antistofbehandling.

Disse kunne også forklare, hvorfor EGFR antistof behandling er oprindeligt effektiv for de fleste KRAS wild-type kræftpatienter og derefter losts dens effektivitet som terapi fortsætter. En nylig artikel offentliggjort i

Natur Hej, fundet, at 60% af patienter, som udviklede resistens mod EGFR-antistof behandling viste erhvervelse af KRAS-mutationer [22]. Vi er tilbøjelige til at tro, at denne “sekundære” KRAS mutation rent faktisk eksisterer i primære tumorvæv. Da tumorceller indeholder denne mutation var for få, kunne vi ikke finde dem, før behandlingen. Men som terapi fortsatte, andelen af ​​tumorceller justeret under terapien tryk. I denne situation tabt anti-EGFR terapi dets effektivitet og de “sekundære” KRAS-mutationer kunne også let påvises.

Vigtigere, Misale et al fandt også, at KRAS mutante alleler kunne påvises i blodet hos anti- patienter EGFR behandling så tidligt som 10 måneder før radiografisk dokumentation for sygdomsprogression [22]. Med andre ord, selv KRAS mutante alleler findes, patienter kan stadig have en relativ lang tid (10 måneder) af stabil sygdom. Denne artikel resultat falder sammen med vores resultater og viser, at eksistensen af ​​KRAS-mutationer ikke betyder et komplet modstand.

Selvom nogle forskere havde betalt opmærksomhed til at skelne lav og høj overflod af EGFR mutation nylig [15], vores fordel var mere indlysende, som vores metode let og præcist kunne beregne den præcise procentdel af KRAS muterede alleler. Denne præcis beregning kunne afspejle procentdelen af ​​KRAS mutation mere objektivt og hjælpe andre laboratorium verificere vores konklusion lettere.

Sammenfattende vores undersøgelse viste, at PNA-PCR-metoden nemt kunne registrere den procentdel af KRAS mutation i tumorceller . Kolorektal cancer patienter med lav overflod af KRAS mutation kan have gavn af EGFR-antistof terapi og yderligere forskning er nødvendig på et større antal patienter.