Abstrakt
Spontan CD4
+ T-celle responser på tumor antigen NY-ESO-1 (ESO) ofte findes hos patienter med epitelial ovariecancer (EOC). Hvis disse reaktioner er af effektor- eller /og Treg typen, imidlertid forblevet uklar. Her har vi anvendt funktionelle tilgange sammen med nyligt udviklede MHC klasse II /ESO tetramerer at vurdere frekvensen, fænotype og funktion af ESO-specifikke celler i cirkulerende lymfocytter fra EOC patienter. Vi fandt, at cirkulerende ESO-specifikke CD4
+ T-celler i EOC patienter med spontane immunreaktioner mod antigenet er prevalently t
H1 type celler secernerer IFN-γ men ingen IL-17 eller IL-10 og er ikke undertrykkende . Vi har detekteret tetramer
+ celler
ex vivo
, med en gennemsnitlig frekvens på 1:25000 memory celler, der er betydeligt lavere end hos patienter immuniseret med en ESO-vaccine. ESO tetramer
+ celler var for det meste effektor memory celler i fremskredne stadier af differentiering og blev ikke påvist i cirkulerende CD25
+ Foxp3
+ treg. Således spontan CD4
+ T-celle responser på ESO i kræftpatienter er overvejende af T
H1 type og ikke treg. Deres relativt lav frekvens og avanceret differentiering fase, men kan begrænse deres effektivitet, som kan styrkes ved immunogene ESO vacciner
Henvisning:. Redjimi N, Duperrier-Amouriaux K, Raimbaud I, Luescher I, Dojcinovic D, classe JM et al. (2011) NY-ESO-1-Specifik Cirkulerende CD4
+ T-celler i æggestokkene kræftpatienter Er overvejende T
H1 type celler målbart i CD25
+ Foxp3
+ treg Rum. PLoS ONE 6 (7): e22845. doi: 10,1371 /journal.pone.0022845
Redaktør: George Kassiotis, MRC nationale institut for medicinsk forskning, England
Modtaget: Marts 25, 2011; Accepteret: 30 juni 2011; Udgivet: 29 Juli 2011
Copyright: © 2011 Redjimi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Fondation de France, Cancer Research Institute og Ludwig Institute for Cancer Research. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
CD4
+ T-celle-undergrupper spiller vigtige og potentielt modsatte roller i tumor immunosurveillance [1], [2]. Type I hjælper (T
H1) T-celler, udskiller signaturen cytokin IFN-γ, fremme udviklingen af CD8
+ cytolytiske effektorer (CTL), og mægle effektive anti-tumor responser. I modsætning hertil regulering /suppressor-T-celler (Treg), kendetegnet
ex vivo
efter høj ekspression af IL-2R α-kæde (CD25) og den slægt-specifikke transkriptionsfaktor Foxp3 og lav ekspression af IL -7R α-kæde (CD127), menes at inhibere antitumorresponser [3], [4], [5], [6], [7]. Treg, der undlader at udskille IFN-γ eller IL-2, er blevet rapporteret at være til stede i forhøjede mængder i cancerpatienter i sammenligning med sunde individer [8], [9]. Fordi antigenet specificitet Treg er stort set ukendt, er det uklart, om evnen hos Treg at inhibere antitumorresponser er relateret eller ikke tilstedeværelsen /udbredelsen blandt dem af tumor-antigen specifikke CD4
+ T-celler.
NY-ESO-1 (ESO), et tumorspecifikt antigen af canceren /testis gruppe udtrykkes ofte i humane tumorer af forskellige histologiske typer, herunder ovariecancer, men ikke i normale somatiske væv [10], [11 ], er en kandidat til udvikling af generiske anticancer vacciner [12]. ESO er yderst immunogene og fremkalder spontan humorale, CD4
+ og CD8
+ T-celle responser hos patienter, der bærer antigen-udtrykkende tumorer [11], [13], [14], [15]. Desuden kan ESO-specifikt antistof, CD4
+ og CD8
+ T-cellereaktioner induceres gennem immunisering med ESO-baserede vacciner [16]. Vi har tidligere identificerede immundominante regioner er anerkendt af ESO-specifikke CD4
+ og CD8
+ T-celler [16] og har genereret opløselig fluorescerende MHC klasse I og for nylig, MHC klasse II /ESO peptid tetramerer tillader direkte påvisning , fænotypebestemmelse og isolering af ESO-specifikke T-celler [17], [18]. Brug af MHC klasse II /ESO peptid tetramerer at vurdere specifikke CD4
+ T-celler hos patienter immuniseret med en rekombinant ESO indgivet protein med Montanide ™ ISA 51 og GpG 7909, har vi vist, at vaccinefremkaldt ESO-specifikke CD4
+ T-celler er prevalently T
H1 celler, opdages
ex vivo
blandt hukommelse (CD45RA
-) celler, omfatter både centrale hukommelse (CCR7
+) og effektor memory (CCR7
-) populationer og ikke omfatter en betydelig procentdel af treg [16], [17], [18]. Nylige undersøgelser har imidlertid antydet, at i modsætning til ESO-specifikke CD4
+ T-celler primet gennem vaccination kan ESO-specifikke CD4
+ T-celler hos patienter med spontan immunresponser indeholder betydelige andele af Treg [19 ] og at forhøjede andele af cirkulerende treg hos kræftpatienter kan forringe deres respons på ESO vacciner [20]. For at imødegå disse bekymringer i denne undersøgelse, har vi brugt funktionelle tilgange, sammen med MHC klasse II /ESO peptid tetramerer at vurdere ESO-specifikke celler blandt konventionelle og Treg CD4
+ T-celle-undergrupper i cirkulerende lymfocytter af epitelial kræft i æggestokkene (EOC) patienter med påviselige spontane immunreaktioner på ESO
Resultater
Vurdering af hukommelse konventionel CD25
-. og lovgivningsmæssige CD25
+ foxp3
+ CD4
+ T-celle-undergrupper i cirkulerende lymfocytter fra raske donorer og EOC patienter
Blandt hukommelse CD4
+ T-celler adskillige delmængder kan skelnes baseret på ekspressionen af CD25 og CD127. Ud fra følgende betragtninger konventionelle CD4
+ T-celler er CD25
-CD127
+, treg er CD25
+ CD127
– og Foxp3
+ (figur 1A). En tredje population, CD25
-CD127
-, indeholder nyligt aktiverede og IL-10-producerende CD4
+ T-celler [21]. Betragtninger CD25
-CD127
+ celler er de fleste af cirkulerende hukommelse CD4
+ T-celler, treg og CD25
-CD127
– populationer er til stede i meget lavere og stort set tilsvarende, der repræsenterer hver omkring 5%. Fordi tidligere rapporter har indikeret, at Treg befolkninger kan øges i cirkulerende lymfocytter fra kræftpatienter sammenlignet med raske individer, vi sammenlignede andelen af CD4
+ T-celle-undergrupper i cirkulerende lymfocytter i EOC patienter raske donorer. Vi undlod dog at afsløre eventuelle væsentlige forskelle i andelen af cirkulerende treg i patienter sammenlignet med raske donorer (Figur 1B). Tilsvarende er andelen af CD25
-CD127
– CD4
+ T celler var ikke signifikant forskellig mellem patienter og raske donorer. For yderligere at karakterisere CD4
+ T-celle-undergrupper i cirkulerende lymfocytter fra EOC patienter, vi isolerede dem
ex vivo
, ved flowcytometri celle sortering, stimuleret dem
in vitro
og vurderede kulturer 12 dage senere for deres evne til at udskille forskellige cytokiner. Som forventet i både raske donorer og patienter, CD25
– populationer indeholdt signifikant højere andele af secernerer IFN-γ sammenlignet med Treg (figur 2). CD127
+ populationer indeholdt højere andele af IFN-y-secernerende celler end CD127
– befolkninger. Interessant, sammenlignet med raske donorer, CD25
-CD127
– populationer fra kræftpatienter indeholdt højere andele af IFN-y-secernerende celler. I modsætning hertil er andelen af IL-17- eller IL-10-secernerende celler var ikke signifikant forskellig mellem raske donorer og patienter for nogen af populationerne.
A. CD4
+ T-celler blev farvet med anti-Foxp3, -CD25, -CD45RA og CD127-antistoffer og analyseret ved flowcytometri. Ekspression af CD25 og CD127 definerer 3 populationer af hukommelse (CD45RA
-) CD4
+ T-celler: konventionel CD25
-CD127
+ og CD25
-CD127
– og Treg CD25
+ CD127
– (venstre dot plot, tal svarer til den andel af hver delmængde blandt hukommelse CD4
+ T-celler). Histogrammer viser ekspressionen af foxp3 i det afgrænsede hukommelse CD4
+ T-celle-undergrupper. B. Andelen af konventionelle CD25
-CD127
+ og CD25
-CD127
– og Treg CD25
+ CD127
– delmængder, defineret i A, blandt hukommelse CD4
+ T-celler fra raske donorer (HD, n = 27) og patienter (P, n = 18).
Ex vivo
-sorterede hukommelse konventionelle, CD25
-CD127
+ og CD25
-CD127
– og Treg, CD25
+ CD127
-, befolkninger fra raske donorer (HD, n = 12) og patienter (P, n = 12) blev stimuleret
in vitro
og dag 12 kulturer blev vurderet for IFN-γ, IL-10 og IL-17 produktion, efter stimulering med PMA og ionomycin, i en 4-h intracellulær cytokinsekretion assay og analyseret ved flowcytometri. Dot grunde til en donor er vist i A og data for alle raske donorer og patienter er sammenfattet i B. Statistisk analyser blev udført ved hjælp af en standard to-tailed
t
-test.
ESO-specifikke cirkulerende CD4
+ T-celler fra EOC patienter med spontane immunreaktioner findes i CD25
-CD127
+ og CD25
-CD127
– populationer, men ikke i CD25
+ CD127
-FOXP3
+ Treg og udskiller IFN-γ men ikke IL-17 eller IL-10
Ifølge tidligere undersøgelser, omkring 40% af ovarietumorer ekspres ESO og ca. 30% af EOC patienter der bærer ESO-udtrykkende tumorer udvikle specifikke spontan antistof (Ab) respons [22]. Vi vurderede Ab reaktioner på ESO i en kohorte af 110 EOC patienter (tabel 1) i patienternes sera ved ELISA som beskrevet [14]. Vi har registreret signifikante Ab responser på ESO i 8 (7%) af patienterne (figur 3A) ved titere varierende mellem 1:500 og 1:50000 (figur 3B). Patienter med detekterbar ESO Ab præsenteret med høj bedømmelse (II, III) tumorer på stadium III eller IV og med serøs histologi (tabel 1). For 6 patienter, PBMC var tilgængelige til analyse. For at vurdere ESO-specifikke celler i defineret cirkulerende hukommelse CD4
+ T-celle-undergrupper af disse patienter, vi isolerede dem
ex vivo
ved flowcytometri celle sortering, og stimuleret dem med en pulje af lange overlappende peptider spanning ESO-sekvens, som beskrevet [16]. Tolv dage senere, vi stimulerede portioner af kulturerne med ESO-peptid pool og vurderet specifik cytokinproduktion ved intracellulær farvning. Vi har registreret betydelige andele af celler, der producerer IFN-γ som reaktion på ESO i kulturer fra cirkulerende CD25
-CD127
+ og CD25
-CD127
– CD4
+ T-celle-populationer, men ikke fra treg (figur 4A og 4B). I modsætning hertil fandt vi kun lav andel af celler secernerer IL-10 eller IL-17 som respons på ESO i nogen af populationerne. Tilsammen viser disse resultater viste, at størstedelen af cirkulerende ESO-specifikke CD4
+ T-celler i disse patienter var T
H1 typen IFN-γ-udskillende celler, CD25
-, både CD127
+ og CD127
-, og var ikke påvises i CD25
+ foxp3
+ treg
A.. Tilstedeværelsen af ESO-specifik Ab i patienters sera blev bedømt ved ELISA. Sera blev oprindeligt vurderet på en 1:100 fortynding på Resö-overtrukket eller på kontrol ubestrøget plader. Sera blev scoret som ESO Ab
+ hvis den optiske densitet (OD) værdier opnået på Resö-coatede plader var begge mindst 3 folder højere end dem, der opnås for den samme prøve på ubestrøget plader og højere end gennemsnittet + 6xSD af OD værdier opnået med sera fra raske individer på Resö-coatede plader (n = 53, middelværdi + 6xSD = 750, data ikke vist). B. Seriefortyndinger af ESO Ab
+ sera blev testet på Resö-coatede plader. Serum titer blev beregnet som serumfortynding giver 50% af maksimal OD
Memory konventionelle, CD25
-CD127
+ og CD25
-CD127
-., Og treg, CD25
+ CD127
– blev befolkninger sorteres
ex vivo
fra CD4
+ T-celler fra ESO ab
+ patienter og stimuleret
in vitro
med en pulje af lange overlappende peptider der spænder over den fulde længde ESO sekvens. A og B. Day 12 kulturer blev vurderet for IFN-γ, IL-10 og IL-17-produktion i en 4-h intracellulær cytokin-farvning-assay efter stimulering i fravær eller nærvær af ESO-peptid pool. Dot grunde til en patient er vist i A og data opnået for alle patienter er opsummeret i B. C og D. Dag 12 kulturer blev farvet med DR52b /ESO
119-143 (NA017, NA093 og NA097) eller DR4 /ESO
119-143 (NA304) tetramerer og anti-CD4 mAb og analyseret ved flowcytometri. Dot grunde til en patient er vist i C og data for alle patienter er opsummeret i D.
Vurdering af ESO-specifikke T-celler i CD4
+ delmængder hjælp MHC klasse II /ESO peptid tetramerer
En advarsel af den eksperimentelle indstilling bruges over var, at mens blev detekteret ESO-specifikke celler baseret på deres evne til specifikt at udskille IFN-γ som reaktion på ESO, treg udskilles lille IFN-γ endda på stimulering med PMA /ionomycin (figur 2). For at overvinde de begrænsninger, som påvisning af ESO-specifikke CD4
+ T-celler baseret på funktionelle assays, vi har for nylig udviklet opløselige fluorescerende MHC klasse II tetramerer, der inkorporerer en immundominant epitop fra ESO, svarende til peptid 119-143 [17 ], [18]. Vi har vist, at MHC klasse II /ESO
119-143 tetramerer plette ESO-specifikke CD4
+ T-celler i cirkulerende lymfocytter fra patienter immuniseret med et ESO rekombinant vaccine med høj effektivitet og specificitet, hvilket muliggør deres direkte visualisering blandt polyspecifikke CD4
+ T-cellekulturer. Fordi 4 patienter med spontane immunresponser på ESO udtrykte MHC klasse II-alleler, for hvilke de egnede tetramerer var til rådighed (DR52b og DR4) vurderede vi ESO-specifikke T-celler i disse kulturer efter tetramerfarvning (figur 4C og 4D). Vi har registreret en betydelig procentdel af ESO tetramer
+ celler i kulturer fra CD25
-CD127
+ befolkninger mod alle patienter samt i dem fra CD25
-CD127
– populationer (i 3 patienter med signifikant forøget frekvens i sammenligning med CD25
-CD127
+ fraktioner). I alle tilfælde, vi undladt at konstatere væsentlige andele af tetramerer
+ celler i Treg kulturer. Udover CD25
+ CD127
-FOXP3
+ Treg, undertrykkende CD4
+ T-celler er også blevet beskrevet i nogle undersøgelser blandt andre populationer [21]. At vurdere, om uanset deres fænotype, ESO-specifikke CD4
+ T-celler viste undertrykkende funktioner, vi isolerede dem fra kulturerne ved tetramer- eller IFN-γ-styrede cellesortering og vurderet dem funktionelt i en suppression assay som beskrevet [23], [24]. Som forventet, foxp3
+ Treg befolkninger samtidig vurderet som interne kontroller effektivt undertrykt væksten af responder celler. I modsætning hertil ESO-specifikke celler isoleret fra både CD25
-CD127
+ og CD25
-CD127
+ kulturer var Foxp3
-. Og blev ikke undertrykkende (figur 5)
ESO-specifikke celler blev isoleret fra peptid-stimulerede CD25
-CD127
+ og CD25
-CD127
– CD4
+ T-cellekulturer (figur 4) ved tetramer- guidet (NA017) eller IFN-γ-styrede (NA114) flowcytometri celle sortering og udvidet
in vitro
. De resulterende polyklonale kulturer indeholdt 80% ESO-specifikke celler. A. ESO-specifikke polyklonale kulturer samt polyklonale kulturer fra ESO
– fraktion og kontrol kulturer af
in vitro
-expanded konventionel hukommelse CD4
+ T-celler (M) og hukommelse treg ( MTreg), isoleret
ex vivo
fra sunde individer, blev farvet med foxp3-specifikke mAb og analyseret ved flowcytometri. Tal i dot plots svarer til gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) på foxp3 farvning. B. suppressive aktivitet af ESO-specifikke og styre polyklonale populationer blev bedømt ved co-dyrkning med CFSE-mærket konventionelle CD4
+ T-celler, ved en responder: suppressor-forhold på 01:01, i nærvær af bestrålede monocytter og PHA. Dot plots viser CFSE-fortynding profil i fravær af testpopulationen (venstre) og i nærvær af de angivne test- populationer. Tal i histogrammer svarer procentdelen af udelte celler. Resultater svarende til den beregnede% suppression er vist for alle testede populationer.
Ex vivo
vurdering af ESO-specifikke cirkulerende CD4
+ T-celler ved anvendelse MHC klasse II /ESO tetramerer
for at bekræfte fordelingen af ESO-specifikke celler i CD4
+ T-celle-undergrupper af patienter med spontane immunreaktioner og yderligere vurdere deres proportioner og fænotype, vi farves samlede cirkulerende CD4
+ T celler fra DR52b
+ patienter
ex vivo
med ESO tetramerer i kombination med mAb rettet mod markører, der karakteriserer distinkte differentiering stadier af CD4
+ T-celler. Som tidligere vist [17], ESO tetramer
+ celler ikke påvises i CD4
+ T-celler fra raske donorer. I modsætning hertil blev de klart påvist
ex vivo
i cirkulerende hukommelse CD4
+ T-celler fra patienterne (figur 6A). Tetramer
+ celler i cirkulerende CD4
+ T-celler fra patienterne var ensartet CD25
– og blev fundet blandt både CD127
+ og CD127
– populationer, men var ikke påvises blandt CD25
+ CD127
– treg (figur 6B). Således svarer til, hvad vi tidligere har observeret hos patienter immuniseret med en rekombinant ESO vaccine, direkte
ex vivo
farvning med ESO tetramerer bekræftede manglen på væsentlige andele af ESO-specifikke CD4
+ T-celler i cirkulerende treg af patienter med spontan immunologiske responser på antigenet. Hyppigheden af cirkulerende ESO tetramerer
+ -celler i de patienter med spontane responser, var i gennemsnit af 1:25000, fem folder lavere end den, der findes i vaccinerede patienter (figur 6A) [17]. Imidlertid ESO tetramer
+ -celler hos patienter med spontane responser indeholdt lavere andele af CD127
– celler sammenlignet med dem af vaccinerede patienter (figur 6B). Hertil kommer, i modsætning til sidstnævnte, som indeholdt, i de gennemsnitlige, nogenlunde sammenlignelige andele af CCR7
+ og CCR7
– celler, samt et stort flertal af CD27
+ celler, ESO tetramer
+ celler hos patienter med spontane reaktioner var for det meste CCR7
– og indeholdt øgede andele af CD27
– celler, i overensstemmelse med en mere differentieret fænotype (figur 6C). Endelig, for at udelukke, at valget af ESO Ab
+ patienter kan have valgt for patienter med lav eller fraværende ESO-specifikke treg, vi vurderede
ex vivo
CD4
+ T-celler fra ESO ab
– DR52b
+ patienter (n = 23). Vi undlod imidlertid at konstatere væsentlige niveauer af ESO tetramer
+ i disse patienter (data ikke vist).
CD4
+ T-celler fra DR52b
+ raske donorer (HD) og patienter blev farvet
ex vivo
med DR52b /ESO
119-143 tetramerer og mAb specifikt for CD45RA, CD25, CD127, CCR7 og CD27 og analyseret ved flowcytometri. A. Dot grunde til en HD og én EOC patient er vist. Tal i dot plots svarer til den procentdel af tetramer
+ celler blandt CD45RA
– hukommelse celler. Data for alle EOC patienter med spontane immunresponser på ESO (S) er vist i sammenligning med frekvensen (middelværdi ± SD) af ESO tetramer
+ -celler i post-vaccine prøver fra patienter, der har modtaget en rekombinant ESO vaccine (V) [17]. B. Dot plots viser ekspressionen af CD25 og CD127 i alt hukommelse celler og i tetramer
+ celler i en EOC patient. Data, der svarer til den andel af konventionelle, CD25
-CD127
+ og CD25
-CD127
– og Treg, CD25
+ CD127
-, populationer i tetramer
+ celler til alle EOC patienter (S) samlet og sammenlignet med den andel (middelværdi ± SD) af disse populationer i vaccinefremkaldt tetramer
+ -celler (V). C. Dot plots viser udtryk for CCR7 og CD27 i alt hukommelse celler og i tetramer
+ celler i en EOC patient. Data, der svarer til den andel af CCR7
+, CCR7
-CD27
+ og CCR7
-CD27
– populationer i tetramer
+ celler for alle EOC patienter (S) er sammenfattet og sammenlignet med den andel (middelværdi ± SD) af disse populationer i vaccinefremkaldt tetramer
+ -celler (V). Statistiske analyser blev udført ved hjælp af en standard to-tailed
t
-test.
Diskussion
Stærke immunreaktioner på kræft væv er potentielt i stand til at forebygge sygdomsprogression. Fordi disse reaktioner, ofte rettet ikke udelukkende mod tumorspecifikke antigener, men også mod differentiering eller andre selv-antigener, har potentiale til at anrette store skader normale væv, robuste immunregulatoriske netværk er på plads [25]. Især CD4
+ CD25
+ Foxp3
+ Treg, involveret i at opretholde vævshomeostase og selv-tolerance, menes at spille en vigtig rolle i at dæmpe anticancer immunitet. Tidligere undersøgelser har rapporteret øget andele af treg i cirkulationen af mindst en del af patienter med solide tumorer [8], [9] samt ophobning af CD25
+ Foxp3
+ Treg på tumor sites [8], [26], især på fremskredne stadier af sygdommen, og har etableret en sammenhæng mellem deres hyppighed og kliniske resultater [3]. På basis af disse resultater, metoder til at fjerne treg er konstrueret, og er allerede ved at blive vurderet i kliniske omgivelser, selv om de er forbundet med risiko for at udløse auto-reaktivitet [27], [28], [29].
i denne undersøgelse har vi rettet tilstedeværelsen og fordelingen af CD4
+ T-celler specifikke for tumorantigenet ESO, af kræft /testis gruppe [10], [30], [31], inden cirkulerende CD4
+ T-celle-undergrupper af EOC patienter. Vi brugte en kombination af funktionelle tilgange og MHC klasse II tetramerer inkorporerer en immunodominant peptid, ESO
119-143, at vi har for nylig udviklet [17], [18]. Vi fandt ingen signifikante forskelle i andelen af treg blandt cirkulerende lymfocytter af EOC patienter sammenlignet med raske donorer. Ligeledes fandt vi ingen signifikant stigning i andelen af den samlede cirkulerende CD4
+ CD25
-CD127
– T-celler, en population, der indeholder for nylig aktiverede CD4
+ T-celler og er blevet foreslået til at indeholde IL-10-secernerende Tr1-celler hos raske donorer [21], men ikke var blevet vurderet hos cancerpatienter forud for denne undersøgelse. Således, mens ændringer i cirkulerende treg rum faktisk kan forekomme i nogle kræftpatienter, fandt vi ingen større ændringer i vores gruppe af EOC patienter. Det er dog bemærkelsesværdigt, at patienterne vurderet i den foreliggende undersøgelse havde modtaget første linje kemoterapi, som midlertidigt sænke Treg [32], selv om de blev vurderet på forskellige tidspunkter, men i mindst en måned, efter afsluttet behandling. Imidlertid vurdering af immunstatus hos denne population, med hensyn til anti-tumor-responser, er mest relevant for udformningen af immun-baserede behandlinger.
Ved at vurdere ESO-specifikke responser i cirkulerende CD4
+ T-celle-undergrupper fra EOC patienter med spontane immunreaktioner, sorteret
ex vivo
og stimuleret
in vitro
med ESO-peptider, vi har registreret betydelige andele af celler, der producerer IFN-γ som reaktion på ESO, men ingen IL-10- eller IL-17-secernerende celler, hvilket indikerer, at størstedelen af ESO-specifikke CD4
+ T-celler T
H1 effektorer. Da denne undersøgelse specifikt T
H1 celler og Treg i EOC, begrænsede vi analysen til de mest relevante cytokiner, nemlig IFN-γ, IL-10 og på grund af den rapporterede forholdet mellem Treg og T
H17 celler , IL-17. Det vil dog være af interesse, i fremtidige undersøgelser, at tage fat på produktion af yderligere cytokiner såsom IL-4 eller IL-13, af ESO specifikke CD4
+ T-celler. I tråd med den konklusion, at ESO-specifikke CD4
+ T-celler isoleret fra kulturerne er effektorceller, de ikke udviser signifikante undertrykkende funktioner. Desuden har vi ikke registrere ESO-specifikke celler i cirkulerende treg af patienter med spontane immunreaktioner til antigenet ved farvning, med MHC klasse II /ESO tetramerer, af definerede konventionelle og Treg CD4
+ T-celle subpopulationer isoleret
ex vivo
ved flowcytometri cellesortering, såvel som ved direkte
ex vivo
farvning med tetramere. I strid med vores data, har tidligere undersøgelser rapporteret isoleringen af ESO-specifikke CD4
+ T-celler med undertrykkende funktioner fra cirkulerende lymfocytter hos patienter med fremskreden melanom [19], [33]. Således, mens vores data ikke udelukker eksistensen af ESO-specifikke treg, de indebærer, at sidstnævnte ikke er almindeligt forekommende i cirkulerende CD4
+ T-celler fra EOC-patienter. Det er også bemærkelsesværdigt, at i overensstemmelse med vores resultater, studier i musemodeller har undersøgt forekomsten af treg i antigen-specifikke T-celler med tetramere og undlod at afsløre tetramer-bindende treg [34], [35].
Brug MHC klasse II /ESO
119-143 tetramerer
ex vivo
, kunne vi direkte sammenligne ESO-specifikke CD4
+ T-celler spontant opstår i patienter, med dem, der fremkaldes gennem vaccination med en rekombinant ESO-protein (Resö) administreret med Montanide ™ og CpG [16]. Det er bemærkelsesværdigt, at indtil den seneste udvikling af MHC klasse II /peptid-tetramerer, har det været vanskeligt at vurdere antigen-specifikke CD4
+ T-celler
ex vivo
grund af deres generelt lave frekvens. Dette er faktisk den første rapport karakteriserer CD4
+ T-celler specifikke for et cancer /testis antigen hos cancerpatienter med spontane immunresponser
ex vivo.
Vi fandt, at hyppigheden af CD4
+ T-celler specifikt for ESO var signifikant lavere hos patienter med spontan immunreaktioner sammenlignet med den, der findes i vaccinerede patienter. Desuden fænotypen af naturligt opstår ESO tetramer
+ -celler var mere differentieret, i forhold til deres vaccinefremkaldt modstykker, indeholdende øgede andele af CCR7
– og CD27
– celler. Tidligere undersøgelser udforsker sammenhængen mellem kvaliteten af hukommelsen CD4
+ T-celle responser fremkaldt af patogener eller vacciner og deres fænotype, har foreslået, at en beskyttende hukommelse respons bør ikke kun omfatte effektorer (CCR7
-), men hukommelse celler på tidligere differentiering stadier, nemlig centrale hukommelse (CCR7
+) og midlertidig hukommelse (CCR7
-CD27
+) T-celler [36], [37]. Baseret på dette koncept, vores resultater antyder, at ESO-specifikke CD4
+ T-celler induceret ved immunisering af cancerpatienter med Resö vaccine er sandsynligvis ikke blot kvantitativt, men også kvalitativt bedre end dem, der opstår under spontane immunresponser, hvilket yderligere opfordrer til brug af ESO-baserede vacciner hos patienter, der bærer ESO-udtrykkende tumorer.
Sammen disse resultater understreger potentialet i MHC-klasse II /ESO tetramerer til entydig påvisning, kvantificering og fænotypning af ESO-specifikke CD4
+ T-celler, ikke kun efter vaccination, men også til vurdering af de immunresponser, der naturligt opstår i patienter, der bærer antigen-udtrykkende tumorer. Den yderligere anvendelse af denne tilgang til karakterisering af CD4
+ T-celler, der er specifikke for ESO og andre tumorantigener i kredsløbet og på tumor steder af kræftpatienter, både langs det naturlige forløb af sygdommen og under behandlingen, vil sandsynligvis bidrage væsentligt fremme vores forståelse af deres roller og bidrag i immunitet over for kræft.
Materialer og metoder
Patient og sund donorprøver og vurdering af ESO-specifik antistofrespons
Sera og perifere mononukleære blodceller (PBMC) blev indsamlet fra EOC patienter set på CLCC René Gauducheau og fra raske personer på skriftligt informeret samtykke og godkendelse fra Institutional Review Board (Comité de Protection des Personnes Ouest IV – Nantes). Antistof (AB) reaktioner på ESO blev vurderet ved ELISA, som beskrevet tidligere [14], [16], ved hjælp af rekombinant ESO protein (Resö) produceret i E. coli.
Ex vivo
fænotypisk vurdering af CD4
+ T-celle-undergrupper og flowcytometri cellesortering
CD4
+ T-celler blev beriget ved positiv selektion fra PBMC fra raske individer og EOC patienter ved magnetisk cellesortering (Miltenyi Biotec ), farvet med monoklonale antistoffer (mab) specifikke for CD4 (BD Biosciences), CD8 (BD Biosciences), CD45RA (BD Biosciences), CD25 (Beckman Coulter), CD127 (eBioscience) og foxp3 (eBioscience), som angivet, og analyseret ved flowcytometri under anvendelse af en LSRII (BD Biosciences). For
ex vivo
flowcytometri cellesortering, blev beriget CD4
+ T-celler farvet med anti-CD4, -CD8, -CD45RA, -CD25 og -CD127 mAb. Efter gating på CD4
+ CD8
-CD45RA
– lymfocytter, celler blev adskilt i hukommelsen CD25
-CD127
+, CD25
-CD127
– og CD25
+ CD127
-Treg populationer til høj renhed ( 97%). ved hjælp af en FACSAria (BD Biosciences)
In vitro
stimulation og funktionel vurdering af CD4
+ T-celle-undergrupper
i alt CD4
+ T-celler eller
ex vivo
sorterede hukommelse konventionelle og treg CD4
+ T-celle populationer blev stimuleret
in vitro
med enten en pool af lange overlappende peptider, der dækkede ESO-sekvens [16] eller med anti-CD2 /3/28-overtrukne mikroperler (Miltenyi Biotec) i nærværelse af bestrålede autologe APC og blev dyrket i nærvær af rekombinant human IL- 2 (Chiron). Dag 12 til 14 kulturer blev vurderet i et 4-h intracellulær cytokin-farvning under anvendelse af mAb specifik for IFN-γ (BD Biosciences), IL-10 (BD Biosciences) og IL-17 (eBioscience), efter stimulering med enten ESO-peptid pool eller PMA (100 ng /ml, Sigma Aldrich) og ionomycin (1 pg /ml, Sigma-Aldrich), som angivet, og analyseret ved flowcytometri (LSRII).
MHC klasse II /ESO-peptid tetramerfarvning
Fluorescerende HLA-DR52b /og HLA-DR4 /ESO
119-143 tetramerer blev genereret som beskrevet tidligere [17], [18]. ESO-stimulerede CD4
+ T-cellekulturer blev inkuberet med tetramerer ved en slutkoncentration på 3 pg /ml i 1 time ved 37 ° C og derefter farvet med CD4-specifikt mAb og analyseret ved flowcytometri (LSRII). For
ex vivo
tælling og fænotypebestemmelse af specifikke celler, total CD4
+ T-celler beriget fra PBMC ved magnetisk cellesortering lodes hvile natten over, inkuberes med tetramerer (3 ug /ml) i 2 timer ved 37 °
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.