PLoS ONE: Påvisning af kolorektal cancer (CRC) af Urinary flygtige organiske forbindelser Analyse

Abstrakt

Kolorektal cancer (CRC) er en førende årsag til kræft dødsfald i Europa og USA. Der er ingen alment accepteret effektiv ikke-invasiv screening test for CRC. Guaiacum baseret fækal okkult blod (gFOB) afprøvning er stort set blevet afløst af fækale Immunochemical test (FIT), men følsomheden er stadig dårlig. Optagelsen af ​​befolkningen baseret FOBT test i Storbritannien er også lav på omkring 50%. Påvisningen af ​​flygtige organiske forbindelser (VOC) underskrift (er) for mange cancerceller undertyper får stadig større interesse ved hjælp af forskellige gasfase analytiske instrumenter. Et sådant eksempel er FAIMS (Field Asymmetrisk ionmobilitetsspektrometer). FAIMS kan identificere inflammatorisk tarmsygdom (IBD) patienter ved at analysere ændringer i VOC mønstre i både urin og fæces. Denne undersøgelse udvider dette koncept at afgøre, om CRC patienter kan identificeres gennem ikke-invasiv analyse af urin, hjælp FAIMS. 133 patienter blev rekrutteret; 83 CRC-patienter og 50 raske kontroller. Urin blev indsamlet i forbindelse med CRC diagnose og headspace analyse foretaget ved hjælp af en FAIMS instrument (Owlstone, Lonestar, UK). Dataene blev behandlet ved hjælp af Fisher Discriminant Analysis (FDA) efter feature extraction fra rå data. FAIMS analyser viste, at VOC-profiler af CRC patienter var stramt klyngemiljø og kunne skelnes fra raske kontrolpersoner. Følsomhed og specificitet for CRC påvisning med FAIMS var 88% og 60%. Denne undersøgelse tyder på, at der kan påvises VOC signaturer stammer fra urin hos patienter med CRC hjælp ion mobilitet spektroskopi teknologi (FAIMS) med potentiale som en ny screeningsværktøj

Henvisning:. Arasaradnam RP, McFarlane MJ, Ryan-Fisher C , Westenbrink E, Hodges P, Thomas MG, et al. (2014) Påvisning af kolorektal cancer (CRC) ved Urinary flygtige organiske forbindelser Analysis. PLoS ONE 9 (9): e108750. doi: 10,1371 /journal.pone.0108750

Redaktør: keping Xie, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, USA

Modtaget: Juni 13, 2014, Accepteret: August 25, 2014; Udgivet den 30. september, 2014

Copyright: © 2014 Arasaradnam et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inkluderet i papiret

Finansiering: Arbejdet blev støttet af Bardhan Forskning og Uddannelse Charity (BRET) velgørenhed, Warwickshire Privathospital velgørenhed, Eveson tillid – finansieret materialer.. BRET blev etableret af professor Bardhan men han havde ingen input til beslutningen finansiering foretaget af tilskuddet tildeling udvalget. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de førende årsager til kræft dødsfald i Europa og USA [1], [2]. I øjeblikket er der en mangel på effektive, non-invasive screening test for CRC. Aktuelle metoder udnytter guaiacum baseret fækal okkult blod (gFOB) afprøvning, men dette er nu stort set blevet erstattet af fækale Immunochemical Testing (FIT). Mens dette er en forbedring, FIT viser stadig forholdsvis lav følsomhed overfor CRC, 66-88%, afhængigt af de afskårne værdier for hæmoglobin (50-200 ng /ml), med en specificitet på 87-96% [3] – [ ,,,0],5]. Følsomheden for avanceret adenom er endnu lavere på 27-41%, med en specificitet på 91-97% [5]. Optagelsen af ​​screening udnytte gødningsprøver er også et spørgsmål, med ca. 50% af inviterede deltagere ikke at acceptere befolkning baseret FOBT screening i vores lokalområde.

Ikke-invasiv test af kræft, hjælp flygtige organiske forbindelser (VOC) og gasser, der udgår fra urin, ånde, afføring og blod, har modtaget stigende interesse og har været et voksende område med forskning i de senere år. Dette arbejde startede oprindeligt fra brugen af ​​hjørnetænder er at påvise kræft, hvilket viste en markant evne til at skelne kræftpatienter fra raske individer [6], [7], [8]. Imidlertid har nylig en række grupper angivet, at det er muligt at anvende gasfase analytiske instrumenter, der specifikt gaschromatografi og massespektrometri (GC-MS), selektiv ion flow massespektrometer (SIFT) og den elektroniske næse (e-næse ), for at opdage lunge-, bryst-, blære- og prostatacancer [9], [10], [11], [12]. For en detaljeret gennemgang på gasfase biomarkører i Gastroenterology, se Arasaradnam et al [13].

I direkte relation til kolorektal cancer (CRC), har nyere arbejde vist, at det er muligt at skelne kræft fra ikke- kræftpatienter, men kan også anvendes til diskrimination af lunge, bryst, prostata og colorektal cancer fra hinanden ved at analysere prøver af udåndingsluft [14]. Dette understøttes yderligere af seneste arbejde, der har også vist, at CRC kan skelnes fra kontroller med over 75% nøjagtighed ved hjælp af GC-MS, igen ansætte ånde analyse [15]. VOC til stede i urin, er også blevet vist at skelne CRC patienter fra kontrolgrupper og andre kræftformer (leukæmi og lymfom), med GC-MS [16]. Den elektroniske næse (Cyrano 320, Sensigent, USA) har også vist sig at skelne mellem CRC og raske kontroller, når VOC-profil i fæces analyseres (85% følsomhed og 87% specificitet). Derudover e-næse var i stand til at skelne mellem avancerede adenomer og raske kontrolpersoner med 62% sensitivitet og 86% specificitet [5]. Disse undersøgelser understøtter eksistensen af ​​formodede gasfase biomarkører indenfor biologisk output medier til påvisning af CRC og dermed kunne være grundlaget for en hurtig screening værktøj.

VOC kan eksistere i gasfasen og er til stede i udåndingsluften , sved, urin og fæces [17], [18]. Mekanismen til generering af VOC’er er genstand for aktuel forskning, men de forstyrres i mange fysiologiske og patologiske tilstande – påvirket af kost og sygdomstilstande. Det antages, at dannelsen af ​​VOC i tarmen er resultatet af tyktarmsbakterier undergår gæring af andre polysaccharider end stivelse – fiber forbruges af værten. Som sådan, de repræsenterer det komplekse samspil af colon celler, humane gut mikroflora og invaderende patogener [19], [20]. Undersøgelsen af ​​de resulterende produkter af gæring, som vi har kaldt »den fermentome” [17], [18], [21], [22] kan måles i urinen. Sidstnævnte formodes muligt på grund af den ændrede tarm permeabilitet gav i visse gut sygdomme [23]. Vi mener, at VOC repræsenterer en bio-signatur, der repræsenterer summen af ​​de multifaktorielle påvirkninger (genetik, miljømæssige faktorer, herunder kost og sygdomstilstande), som påvirker en person. Formålet med denne undersøgelse var at teste potentialet af FAIMS -. En roman meget følsom teknologi til at skelne mellem CRC og raske kontroller ved hjælp af kun urinprøver Salg

Materialer og metoder

2.1 Fag

Et hundrede og tredive tre personer blev rekrutteret fremadrettet for denne undersøgelse. Firs-tre af disse patienter havde histologisk bekræftet kolorektal cancer og halvtreds var raske personer, der havde en nylig normal koloskopi. Den gennemsnitlige alder CRC patienterne var 60 år (SD 17 år), 53 (64%) var mænd. Demografien af ​​de emner er vist i tabel 1.

2.2 Study Design

Det var en sag kontrol undersøgelse, hvor patienter blev rekrutteret fra ambulatorier på University Hospital Coventry Warwickshire, Storbritannien. Urin blev derefter opsamlet i standard universal Sterilin prøvebeholdere (Newport, UK) og straks nedfrosset til -80 ° C, til efterfølgende batch analyse.

2.3 Analyse

Prøver blev optøet ved stuetemperatur natten , alikvoteret i passende prøveflasker og analyseres ved hjælp af FAIMS eksperimentelle metoder, der er beskrevet nedenfor.

2.3.1 FAIMS.

For FAIMS analyse blev udnyttet en kommerciel instrument (Lonestar, Owlstone, UK, beskæftiger et ATLAS-prøvetagnings- og split flow boks). Dette system opnår adskillelse af kemiske komponenter på grundlag af forskelle i det elektriske felt afhængighed af ioniserede kemiske mobiliteter. FAIMS tillader gasmolekyler, der skal adskilles og analyseres ved atmosfærisk tryk og stuetemperatur, i modsætning til lignende traditionelle analytiske teknikker. Efter en prøve bliver ioniseret, er det sammensat af ioner af forskellige størrelser og typer. Disse er indført mellem to metalplader og et asymmetrisk højspænding bølgeform påtrykkes disse plader, underkaste de ioniserede molekyler til høje elektriske felter. Forskellen i bevægelse af disse molekyler inden denne høje elektriske felt kan måles, hvilket således resulterer i en adskillelse af den komplekse blanding.

En prøve af 5 ml urin alikvoteret i et 20 ml glasbeholder og anbragt i ATLAS sampler. Prøvetageren opvarmer prøven til (i vores tilfælde) 40 ± 0,1 ° C, når prøven når den korrekte temperatur (typisk 10 min), ren syntetisk luft ledes over prøven og ind i Lonestar FAIMS instrument. Strømningshastigheden over prøven er 500 ml /min og steg til 2 L /min af yderligere ren luft, før den ledes ind i instrumentet. Lonestar er sat op til at scanne mellem 0 og 90% dispersion felt (dispersionen feltet repræsenterer størrelsen af ​​det elektriske felt) i 51 trin og en kompensation spænding på mellem -6 V og +6 V i 512 trin. Erstatningen spænding anvendes til at fjerne effekten af ​​afdrift produceret af den høje elektriske felt, således kun molekyler, der har en specifik mobilitet exit pladerne på det tidspunkt. Figur 1 viser en typisk FAIMS ‘fane’ fremstillet af en CRC patients urinprøve afbildes på en logaritmisk skala.

Intensitet er i arbitrære enheder af ion tæller.

2,3.2 GC -MS. Salg

for GC-MS-analyse, særskilte portioner af 5 ml er taget fra hver prøve at køre gennem en Bruker Scion SQ GC-MS instrument. Hver alikvot blev omrørt og opvarmet til 60 ° C i 5 minutter, før indholdet af dens headspace ekstraheres under anvendelse af en Combi-PAL ITEX automatiserede forkoncentratoren system. De flygtige stoffer indeholdt i ITEX blev derefter frigivet ved opvarmning til 250 ° C, og injiceres i instrumentet gennem ved et fordelingsforhold på 1:20 med helium bærergas. Den Restek RXI-624Sil søjle (20 m længde, 0,18 mm ID, 1,0 um df) monteret på GC blev holdt ved en konstant 50 ° C i 1 minut, inden de blev forøget til 280 ° C ved en hastighed på 20 ° C /min, udskille de konstituerende VOC’er i form af molekylvægt og polaritet. Efter en indledende detektion til at producere et chromatogram, er VOC-molekylerne fragmenteres ved massespektrometret og påvist at producere tilsvarende massespektre. Disse er korreleret med GC chromatogramprofiler toppe, og kontrolleres mod en National Institute of Standards and Technology bibliotek (NIST 2013) af kemiske forbindelser. Dette blev perfrimed for at få yderligere indsigt i de specifikke kemiske grupper, der udgør den flygtige headspace af urinprøver i dem med CRC.

2.4 Statistiske metoder

Dataanalyse for FAIMS resultater er udført under anvendelse af Fisher diskriminantanalyse. Dette giver mulighed for enkel fortolkning af komplekse data til at bestemme, om der kan påvises forskelle i grupper. Dataene blev behandlet i Matlab (Mathworks Inc., USA, R2013b). Til analyse blev både de positive og negative ion tæller matricer af hver prøve sammenkædet i en enkelt 52.224 element vektor (eller 1D array). Disse blev derefter wavelet transformeret ved anvendelse af en Daubechies D4 wavelet, en teknik der almindeligvis anvendes i datakomprimering og har evnen til at udskille subtile signaler inden et datasæt. Datapunkter inden for de 52,224 elementer, der kan diskrimination derefter identificeret. Dette opnås ved at beregne inden klassen scatter (Σσ

i) og mellem klasse scatter [(σ

μ)

2 /(Σσ

i)

2] for hvert punkt inden for vektoren (dermed de samme datapunkter (eller variabel) fra alle de eksempler datasæt undersøges og inden klassen samt mellem klasse scatter beregnet på tværs af alle prøver), til at generere yderligere to 1D arrays, igen dannet af 52,224 datapunkter. Forskellige tærskler indstilles derefter til i klasse og mellem klasse scatter og de variabler, der er inden for disse tærskler anvendes derefter til databehandling af Fisher diskriminant analyse (FDA, en pre-klassificeret lineær teknik). For at teste gyldigheden af ​​FDA, blev fem prøver fra hver gruppe (CRC og kontroller) fjernes før FDA blev udført. Derefter, baseret på FDA resultaterne af rest, er en forudsigelse foretaget på gruppen af ​​de ukendte prøver. Denne forudsigelse er baseret på en KNN (k-nærmeste nabo) metode. Denne proces gentages ti gange for hvert par grænseværdier indtil optimale tærskler, og dermed sæt variabler, er identificeret. Denne variabel gruppe anvendes derefter i resten af ​​analyseprocessen at beregne sensitivitet og specificitet. For yderligere oplysninger om analyser, der er beskrevet i detaljer, se venligst Covington et al [23]

2,5 Etik

Videnskabelig og etisk godkendelse blev opnået fra lokale Research Udviklingsafdeling og Warwickshire etiske komité 09 /H1211 /38. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter, der deltog i undersøgelsen.

Resultater

De demografiske data for kræft og ikke-kræft gruppe er beskrevet i tabel 1. Ingen statistisk signifikant forskel mellem grupper blev imidlertid bemærket, som forventet var der hankøn overvægt. Nærmere oplysninger om tumoren mellemstationer for de 83 CRC patienter er vist i tabel 2.

Analysen af ​​FAIMS data for CRC-patienter og kontroller blev udført under anvendelse Fisher diskriminantanalyse, som beskrevet ovenfor, og resultater fra de identificerede variabler er vist i figur 2. Reklassifikation til CRC var korrekt i 74% af tilfældene (p 0,001). Følsomheden og specificiteten af ​​FAIMS analyse til påvisning af CRC var 88% og 60%.

CRC patienters urin blev også analyseret ved GC-MS, og resultaterne kan ses i tabel 3, sammen med en liste over tilsvarende kemikalier fra det nationale institut for standarder og (NIST) database Technology. Ingen unikke kemiske blev identificeret i dem med CRC sammenlignet med kontroller.

Diskussion

Denne undersøgelse er den første til at vores viden til at rapportere hjælpeprogrammet FAIMS analyser for CRC påvisning i urin og støtter tidligere arbejde med andre, der bruger elektronisk næse [5] og GCMS [16]. Dette er opnået ved at undersøge, hvordan gasser og dampe (VOC) stammer fra urinprøver er uensartede i dem med CRC sammenlignet med kontroller. Vores resultater støtter også tidligere arbejde, hvor VOC signatur forskelle blev noteret i CRC patienter inden for forskellige biologiske materialer (fæces, ånde og urin) [5], [15], [16]. Vores CRC kohorte havde en mandlig sex overvægt, som ville forventes for en population af CRC patienter, mens vores kontrolgruppe havde en lille kvindelig overvægt. Dette kunne hæve udsigten til sex skævhed i kohorten, dog mens mønstret for VOC og ved association, den fermentome, kunne teoretisk blive påvirket af køn og alder, data fra vores tidligere offentliggjorte undersøgelser af IBD, galdesyre malabsorption, bækken kræft og cøliaki har ikke vist nogen tilbøjelighed til alder og køn påvirker VOC signaler [23], [24], [25], [26], [27].

de Meij et al viste, at e -nose kunne skelne CRC fra raske kontrolpersoner med 85% sensitivitet og 87% specificitet, og kunne også skelne avancerede adenomer fra raske kontrolpersoner med 62% sensitivitet og 86% specificitet [5]. Vores undersøgelse har vist ved anvendelse af urinprøver snarere end fæces – med FAIMS demonstrerer en følsomhed på 88% og en specificitet på 60%. Dette har betydning, især i vores lokale befolkning, hvor optagelse af screening er dårlig på grund af kravet om at producere gødningsprøver

Ion mobilitet har en række fordele i forhold til både GCMS og e-næse:. For eksempel det er ved at foretage en fysisk måling af molekyler i stedet for en kemisk interaktion (som ville en traditionel e-næse) og for det andet, at følsomheden er meget højere dvs. dele pr milliard til dele pr billioner. Dette gør det en ideel platform for en fremtidig screeningsværktøj især da følsomheden er høj. Vores resultater ekspandere på tidligere forskning, der beskriver, hvordan både e-næse og FAIMS teknologier kan anvendes til at skelne virkninger af stråling i bækken kræft [25] og inflammatoriske tilstande, f.eks mellem Crohns sygdom og ulcerativ colitis [26], foruden galdesyre- malabsorption og cøliaki [23], [27].

Genetiske afføring markører har modtaget interesse som en potentiel ikke-invasiv target screening for CRC. Lidgard et al [28] foretaget en undersøgelse af automatiseret afføring DNA-analyse for β-actin, mutant

Kras

, afvigende methylerede

BMP3

NDRG4

, og fækal hæmoglobin. Dette viste en sensitivitet på 98% og 90% specificitet for CRC og 57-83% følsomhed for avancerede adenomer afhængigt af størrelsen. Vores undersøgelse viser sammenlignelige følsomhed resultater, men til en meget lavere proces omkostninger og med urin i stedet fækal prøveudtagning.

Den unikke kemiske fingeraftryk eller »bio-lugtstof fingeraftryk” produceret af forskellige sygdomstilstande, og raske individer , viser potentialet i denne teknologi til at screene for, og støtte, til diagnosticering af CRC. Det har også potentiale til at hjælpe til yderligere undersøgelse af personer med andre gastrointestinale sygdomme. Gasser og dampe menes at blive produceret ved fremgangsmåden ifølge colon gæring involverer et komplekst samspil mellem colonocyte celler, humane fækal flora, mucosal integritet og invaderende patogener [17], [18]. VOC udsendes fra kropsvæsker har således stort potentiale som formodede biomarkører til brug i vurderingen af ​​gastrointestinale sygdomme. Ændringer i mønstret af VOC menes at afspejle ændringer i mave miljø. Dette tyder på en mulig rolle for tarmmikroflora dysbiosis i patofysiologien af ​​CRC [29].

Konklusioner Salg

Denne undersøgelse har vist, at VOC signatur stede i urinen hos patienter med CRC, kan være skelnes fra raske kontrolpersoner hjælp FAIMS. Følsomheden og specificiteten af ​​FAIMS er 88% og 60% for CRC. Mens dette er lavere end guldstandarden af ​​koloskopi det er sammenligneligt med nuværende fækal afføring testning herunder guaiacum og immunohistokemiske metoder. Den britiske optagelse for screening er lav; 62%, 57% og 59% optagelse i det første, andet og tredje runder af det nationale screeningsprogram [30], og i øjeblikket omkring 50% i den lokale befolkning. En af grundene til dette er arten af ​​den biologiske prøve kræves. Tilbyder en alternativ og mindre indgribende løsning, såsom urin i stedet fæces, sandsynligvis vil være langt mere acceptabel for patienterne, og kan indarbejdes i screening veje for fremtiden.

Tak

Vi vil gerne takke WPH, BRET og Eveson Trust, der har givet midler til denne forskning.