PLoS ONE: Molekylær Grundlag for Viral Selektiv Replication i cancerceller: Aktivering af CDK2 af Adenovirus-induceret Cyclin E

Abstrakt

adenovirus (Ads) med sletning af

E1b55K

fortrinsvis replikere i kræft celler og er blevet anvendt i cancerterapier. Vi har tidligere vist, at Ad E1B55K protein er involveret i induktion af cyclin E for Ad-replikation, men dette E1B55K funktion kræves ikke i cancerceller, hvor deregulering af cyclin E observeres hyppigt. I denne undersøgelse undersøgte vi interaktionen af ​​cyclin E og CDK2 i Ad-inficerede celler. Ad infektion steget betydeligt den store form for cyklin E (cyklin EL), fremmes cyklin E /CDK2 kompleksdannelse og øget CDK2 fosforylering på T160 site. Aktiveret CDK2 forårsaget pRb-phosphorylering på S612 site. Undertrykkelse af CDK2 aktivitet med den kemiske inhibitor roscovitin eller med specifikke små interfererende RNA faldt betydeligt pRb fosforylering, med samtidig undertrykkelse af viral replikation. Vores resultater antyder, at Ad-induceret cyclin E aktiverer CDK2 der retter sig mod transskriptionsrepressor pRb til at generere et cellulært miljø for viral produktiv replikation. Denne undersøgelse afslører en ny molekylær basis for onkolytisk replikation af

E1b

-deleted Annoncer og vil støtte i udviklingen af ​​nye strategier til Ad onkolytiske virotherapies

Henvisning:. Cheng PH, Rao XM, McMasters KM, Zhou HS (2013) Molecular Basis for Viral Selektiv Replication i cancerceller: Aktivering af CDK2 af Adenovirus-induceret cyclin E. PLoS ONE 8 (2): e57340. doi: 10,1371 /journal.pone.0057340

Redaktør: Yi Li, Wuhan Bioengineering Institute, Kina

Modtaget: Oktober 3, 2012; Accepteret: 21 januar 2013; Udgivet: 20 Februar 2013

Copyright: © 2013 Cheng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NIH Grant R01 CA129975 (til HSZ https://www.nih.gov/). PHC er delvist støttet af K. C. Huang Scholarship fra University of Louisville (https://louisville.edu/medschool/pharmacology). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Humane adenovirus (ADS) er dobbelt-strenget lineære DNA-virus, der er i stand til at inficere og formere sig i en lang række forskellige celletyper

in vitro

in vivo

, herunder post-mitotiske celler. Efter infektion, virale tidlige proteiner interagerer med cellulære faktorer for at skabe gunstige miljøer for viral [1] replikation. Ad

E1

region indeholder to sæt af gener,

E1a

og

E1b

, der er dedikeret til cellecyklus kontrol, apoptotisk hæmning, og cellulær og viral genregulering [ ,,,0],2]. Annoncer med

E1

modifikationer, der fortrinsvis replikerer i cancerceller er blevet anvendt til cancer genterapi.

Den virale

E1a

genet udtrykkes umiddelbart efter infektion. Den primære rolle

E1 a-

genprodukter er at regulere ekspressionen af ​​flere cellulære og virale gener [1]. I stedet for direkte binding til specifikke DNA-sekvenser i transkriptionel regulering elementer, E1A-proteinerne interagerer med flere vigtige regulatorer af celleproliferation [3], [4]. De velkendte cellulære faktorer til som E1A proteiner binder er produkter af den retinoblastoma (

Rb

) genet og dets strukturelt beslægtede gener,

p107

p130

[5] [6]. Ved sekvestrering retinoblastomproteinet (pRb), E1A aktiverer transskriptionelle regulator E2F-proteiner. Undersøgelser har antydet, at pRb /E2F-komplekset aktivt undertrykker transkription fra målgener og medierer G

1 arrest udløst af p19 (ARF), p53, p16INK4a, TGF-beta, eller celle-kontakt [7] – [9]. Senest Pelka

et al.

(2011) viste, at E1A direkte kan binde til E2F /DP-komplekser ved at interagere med DP-1, hvilket resulterer i aktivering af E2F-responsiv genekspression uafhængigt at binde til pRb [10] . Flere grupper har vist, at ekspression af

E1a

gen udløser akkumulering af p53-protein og p53-afhængig apoptose [11], [12], enten ved at aktivere p53 transkription eller forebyggelse p53 i at blive nedbrudt af proteasomet [11] – [14]

Ad E1B55K er blevet vist i nogle undersøgelser at modvirke den E1A-induceret stabilisering af p53 [11], [15].. E1B55K protein kan inhibere funktionerne af p53 gennem mindst tre forskellige mekanismer. E1B55K sigende binder aminoterminalen af ​​p53 [16], og denne binding kan undertrykke p53 transkriptionel aktivering, som foreslået i transskription assays [17] og med transient transfektion undersøgelser [18]. E1B55K kan også forstyrre p53-funktion ved at samarbejde med viralt E4orf6-protein til at forårsage proteolytisk nedbrydning af p53 protein [19] – [21]. En nylig undersøgelse har vist, at E1B55K alene fungerer som en E3 SUMO1-p53 ligase, der interagerer med promyelocytleukæmi nukleare organer til at inaktivere p53 og stimulere dets nukleare eksport [22]. Derved E1B55K blokerer ekspressionen af ​​p53-regulerede gener og følgelig modvirker p53-afhængig apoptose induceret af E1A, tillader effektiv viral replikation [16], [17].

Ad

dl

1520 (ONYX-015) indeholder en 827-bp deletion og en punktmutation generere en præmatur stopkodon i E1B55K kodende sekvens, forhindrer ekspression fra genet [23]. Det blev oprindeligt foreslået, at

E1b55K

-deleted Annoncer kunne replikere kun i p53-mangelfulde tumorceller, som E1B55K-medieret nedbrydning af p53 protein ikke var forpligtet i disse cancerceller [24], [25].

E1b55K

-deleted onkolytiske annoncer er blevet testet i humane kliniske forsøg og bliver markedsført til behandling af cancer i Kina efter godkendt af Kinas State Food and Drug Administration (SFDA) [26]. Imidlertid blev den oprindelige hypotese udfordret af flere undersøgelser viser, at

E1b55K

-deleted Annoncer er i stand til at replikere i celler uanset deres p53 status [27] – [30]. Yderligere undersøgelser har vist, at akkumuleringen af ​​p53-protein, efter infektion med annoncer transporterer muterede

E1b55K Salg gener, der er i stand til at undertrykke p53, kan hverken effektivt inducere apoptose eller transskriptionelt aktiverer ekspression af p53-responsive gener i Ad-inficerede celler [31], [32]. Således er disse resultater antyder, at det er usandsynligt at være den vigtigste forudsætning for viral replikation blokering af p53-aktivitet med E1B55K protein. Mekanismen (r) af

E1b55K

-deleted virusreplikation i kræftceller stadig ikke er etableret, selv om vektorerne allerede er blevet anvendt i klinikken til human behandling af kræft [26].

vi har tidligere vist, at Ad E1B55K er involveret i induktionen af ​​cellecyklus-relaterede gener, herunder cyclin E og Cdc25A [33]. Ad E1B55K medierer den store form af cyclin E-protein (cyclin EL) induktion i Ad-inficerede celler [34]. Cyclin E og den store formular cyclin EL genereres fra alternativ splejsning. Oversættelsen af ​​cyclin EL initieres ved en ATG codon beliggende i exon 2 og cyclin E er fra ATG-kodonen i exon 3 [35]. Den E1B55K funktion er nødvendig for cyklin EL induktion i normale celler, men er ikke påkrævet i kræftceller med deregulerede cyclin E. Undlade at effektivt fremkalde cyklin EL udtryk i de normale celler, replikation af

E1b55K

-deleted onkolytiske annoncer er begrænset. Men

E1b55K

-deleted onkolytiske Annoncer effektivt kan fremkalde cyklin EL i cancerceller og udføre tilstrækkelig onkolytisk replikation. Vi foreslog, at cyclin E-deregulering i kræftceller kan være en vigtig molekylær basis for selektiv onkolytisk replikation af

E1b55K

-deleted Ads [34].

cyclin E regulerer cellecyklusprogression, DNA-replikation [36], [37], og centrosom dobbeltarbejde [38], [39]. Ekspression af cyclin E er strengt kontrolleret i normale celler. Niveauet af cyklin E stiger på sene G

1 fase, toppe på G

1 /S fasen for at fremme posten S-fasen, og aftager derefter [35], [40]. Deregulering af cyclin E er ofte påvist i mange typer af cancere, som cyclin E-genamplifikation [41], overekspression af cyclin E mRNA eller proteinniveauer [42], [43], nedsat cyclin E omsætning [44], og tilstedeværelsen af mere aktive former af cyclin E [45] – [47]. Konstitutiv overekspression af cyclin E blev vist at inducere kromosom ustabilitet og forringe normal cellecyklusprogression [48], [49]. Hypotesen om, at unormal cyklin E udtryk kan udløse tumorer er også blevet støttet af transgene dyreforsøg [50] – [52].

En funktion af cyklin E er at binde og aktivere cyklin-afhængige kinase 2 (CDK2) [53]. Cyclin E /CDK2 kompleks derefter phosphorylerer substrater såsom pRb og fører til transkriptionel aktivering af downstream gener. Undersøgelser viser også, at cyclin E har CDK2-uafhængige funktioner [54], [55].

In vivo

dyreforsøg indikerer varians mellem fænotyper af cyclin E-null (cyclin E1

– /- E2

– /-) mus og CDK2 null (CDK2

– /-) mus . Mus mangler CDK2 er levedygtige, med normal udvikling, bortset fra defekt kønsceller udvikling [56], [57]; endnu knockout af cyclin E1 og E2 generne i mus forårsager embryonale dødelighed på grund af mangel på endoreplication af trofoblast kæmpeceller og megakaryocytter [58]. Matsumoto

et al.

(2004) identificeret en centrosomal lokalisering signal (CLS) domæne cyklin E [59]. Dette CLS domæne tillader cyklin E til at målrette centrosom og fremme S post fase i en CDK2-uafhængig måde. Derudover Geng

et al.

(2007) viste, at en cyclin E kinase-deficient mutant (KD-E) er i stand til delvist at genoprette minikromosom vedligeholdelse protein (MCM) lastning og S-fase indgang i cyclin E nul-celler [54]. , Cyclin E har således CDK2-afhængige og uafhængige funktioner i S-fase post og DNA-replikation. Et vigtigt spørgsmål er, om Ad-induceret cyklin E kan aktivere CDK2 og om cyklin E-CDK2-interaktion kan spille en afgørende rolle i Ad replikation. Dette spørgsmål er særlig vigtigt i udviklingen af ​​onkolytiske virotherapy strategier.

Vi rapporterer her, at Ad-induceret cyclin E binder med og aktiverer CDK2, der er målrettet transkription repressor pRb, som igen kan regulere ekspression af cellulære og virale gener . Resultaterne tyder på, at interaktionen mellem Ad-induceret cyclin E og CDK2 er at generere et passende miljø for Ad produktiv replikation.

Materialer og metoder

cellelinjer og dyrkningsbetingelser

HEK 293 (ATCC nr. CRL-1573), human lunge fibroblast WI-38 (ATCC nr. CCL-75), og human lunge cancer A549 (ATCC nr. CCL-185) cellelinier blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Rockville, MD). WI-38 celler blev dyrket i minimalt essentielt medium (MEM) Alpha GlutaMAX med 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer og 1,0 mM natriumpyruvat. HEK 293 og A549-celler blev dyrket i minimalt essentielt medium Alpha. Alle medier blev suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og penicillin /streptomycin (100 U /ml). Celler blev dyrket i en CO 5%

2 inkubator ved 37 ° C. Alle cellekulturreagenser blev opnået fra Gibco BRL (Bethesda, MD).

Adenovirusvektorer

vildtypeadenovirus type 5 (Adwt, ATCC nr. VR-5) blev anvendt som en replikering -competent kontrol. AdCMV /GFP, en Ad-vektor med E1 deletion bærer et grønt fluorescerende protein (GFP), blev anvendt som en replikationsdefekt kontrol. Adhz63, en onkolytisk annonce vektor med udeladelsen af ​​

E1b55K

region, blev bygget af vores laboratorium [60].

Viral infektion og titrering

Celler blev podet i 6- brønde ved en densitet på 2,5 x 10

5 (celler /brønd) og dyrkes under de angivne forhold. Efterfølgende blev celler mock-inficeret eller inficeret med AdGFP, Adwt eller Adhz63 ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 5. cytopatisk effekt (CPE) blev observeret ved designet tidspunkter og fotograferet med et omvendt mikroskop (Olympus CKX41). Total inficerede celler og kultursupernatanter blev opsamlet ved 48 timer efter infektion (p.i.) og lyseres for at frigive viruspartikler med tre cykler af nedfrysning og optøning. De virale titre blev bestemt ved infektiøse enhed fremgangsmåde som tidligere beskrevet [61], [62]. Kort fortalt blev HEK 293 celler udsået i plader med 96 brønde ved en densitet på 10

3 (celler /brønd) og derefter inficeret med 5-fold serielt fortyndede virus. CPE blev registreret, og scoret efter inkubation i 7 dage. Den procentvise reduktion i virustiter beregnes ved formlen, reduktion% = [(titer af kontrolgruppe – titer af forsøgsgruppe) /titer af kontrolgruppen]. × 100%

Viral DNA-syntese assay

Efter virusinfektion, celler blev opsamlet på forskellige tidspunkter. Det virale DNA-syntese blev bestemt med Southern blot; 1 ug isolerede genomiske DNA blev fordøjet med restriktionsenzymet

Pst

I og analyseret med 1% agarose gel, der efterfølgende blev transblottet til en Hybond-N + membran (YA3609; Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL) . Proben blev fremstillet ved at fordøje 0,5 ug pBHGE3 [63] med

Pst

jeg og mærket ved at følge protokollen af ​​Amersham AlkPhos Direct Mærkning og Detection Systems (RPN 3690, GE Healthcare, Piscataway, NJ). Blottet blev præhybridiseret i 3 timer ved 63 ° C. Hybridiserings- og stringens vaske blev udført ved 55 ° C efterfulgt af den kemiluminescerende detektion ifølge producentens protokol.

Western blot-analyse

Inficerede celler blev høstet ved angivne tidspunkter og lyseret med CDK2 lyseringsbuffer (20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl

2, 0,5% Nonidet P-40, 0,1% Brij 35, 5 mM natrium glycerophosphat, 1 mM natriumvanadat, 1 mM dithiothreitol). Western blot analyser blev udført som tidligere [64] beskrevne. Kort fortalt 80 ug cellelysater blev elektroforese gennem 12% SDS-polyacrylamidgeler og overført til en Immobilon-P membran (Millipore, Billerica, MA). De primære antistoffer anvendt i denne undersøgelse, var kanin-anti-cyclin E (M-20), CDK4 (C-22), muse-anti-cyclin D1 (DCS-6), PCNA (PC10), p21 (F-5), pRb (IF8) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), mus-anti-CDK2, p27 (BD Biosciences, San Jose, CA), pCDK2 T160 (cellesignalering, Danvers, MA), kanin-anti-phosphoryleret pRb (phospho-pRb ) S612, og actin (Sigma, St. Louis, MO), anti-phospho-pRb S795 (New England Biolabs, Beverly, MA), og anti-phospho-pRb T821 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Actin blev anvendt som en intern kontrol. Membranerne blev derefter inkuberet med anti-muse-immunglobulin G (IgG) eller anti-kanin IgG peroxidase-linked artsspecifikke helt antistof (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Kemiluminescerende detektion blev udført med ECL-reagenser i henhold til leverandørens anbefalinger (GE Healthcare). Det scannede båndintensitet blev kvantificeret ved Gel-Pro Analyzer 4.0 software (Media Cybernetics, Bethesda, MD) ifølge producentens vejledning. Densitometrisk værdi for hvert bånd blev udtrykt som integreret optisk densitet (I.O.D.), og resultaterne blev normaliseret med actin. De endelige værdier repræsenterer midlerne til relativ procentvise udvikling fra mindst tre uafhængige forsøg, sammenlignet med mock gruppe ± standardafvigelse .. Statistisk forskel blev vurderet med t-test. En p-værdi på. 0,05 blev betragtet som signifikant

Immunopræcipitation

A549-celler blev podet i 150 mm skåle ved en celletæthed på 5 × 10

6 (celler /skål) og derefter mock-inficeret eller inficeret med AdGFP, Adwt eller Adhz63 ved en MOI på 5. ved 48 timer pi, blev celler opsamlet og lyseret med CDK2 lysisbuffer ifølge fremgangsmåden beskrevet i tidligere publikationer [34] metode, [65]. Cellelysater (500 ug) blev immunfældet med cyclin E (HE111), det monoklonale muse-antistof (Santa Cruz), eller anti-CDK2-antistof (BD Transduction Laboratories) ved 4 ° C i 4 timer, efterfulgt af tilsætning af protein A Sepharose CL- 4B (82.506, Sigma) og inkubation natten over. Immunkomplekser blev analyseret ved Western blot med anti-cyclin E og CDK2 antistoffer.

Små interfererende RNA (siRNA) transfektion

siRNA oligonukleotider blev syntetiseret ved Eurogentec (Fremont, CA). Tre forskellige siRNA-duplexer var designet til at målrette CDK2 på nukleotider 399-419 (# 1), 619-639 (# 2), og 691-711 (# 3) i henhold til Genbank tiltrædelse NM001798.2 (National Center for Biotechnology Information GenBank) . En negativ kontrol siRNA duplex indeholder to strenge af 19 komplementære RNA-baser med 3’dTdT udhæng blev opnået fra Eurogentec (SR-CL000-005). Celler blev podet i en 6-brønds plade med en tæthed på 10

5 (celler /brønd) og derefter transficeret med 200 nM CDK2 siRNA-duplexer eller en ikke-specifik kontrol siRNA duplex med Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge fabrikantens protokol. Celler blev høstet ved 48 timer efter transfektion. Firs ug cellelysater blev analyseret ved Western blot med CDK2, pCDK2 T160, pRb, phosphoryleret pRb (p-pRb), cyclin E, capsidproteiner, og actin-antistoffer.

Alle ovennævnte eksperimenter, medmindre specifikt er angivet, blev gentaget mindst tre gange.

Resultater

cyclin E /CDK2 kompleks dannet i celler inficeret med adenovirus

Vi har tidligere etableret forbindelsen mellem cyklin E og replikation af adenovirus [33], [34]. Dataene vist i figur 1 rekapitulere, at Ad E1B55K deltager i induktionen af ​​den store form af cyclin E-protein (cyclin EL), som bidrager til effektiv virusreplikation. Cyclin E og cyclin EL genereres fra alternativ splejsning med forskellige start ATG codoner i exon 2 og 3 [35]. N-terminalen af ​​virus-induceret cyclin EL er 15 aminosyrer længere end for cyclin E-protein. Cyclin E-protein udtrykkes konstitutivt i A549 humane lungecancer-celler [34]. Vildtype Ad5 (Adwt), med det intakte

E1b55K

region, inducerede signifikant cyclin EL ekspression i begge WI-38 humane lunge-fibroblastceller og A549 humane lungecancer-celler (Fig. 1A, bane 2 og 5 ), og forårsagede effektiv cytopatisk virkning (CPE) (fig. 1B, panel b og e). Ad vektor Adhz63 med

E1b55K

-deletion [60] også inducerede signifikant cyclin EL i A549-celler (fig. 1A, bane 6) og forårsagede effektiv CPE af cellerne (fig. 1B, panel c). Imidlertid vektoren inducerede ikke cyclin EL overekspression i WI-38 celler (Fig. 1A, bane 3) og deres CPE (fig. 1B, panel f). At sammenligne replikationen af ​​Adwt og Adhz63 i A549 og WI-38 celler, blev titerne af disse to vira bestemt. Den Adhz63 replikation var stærkt undertrykt i WI-38 celler, viser kun 10% af relativ replikation i sammenligning med Adwt (Fig. 1C). Når vi sammenlignet Adhz63 replikation med den for Adwt i A549-celler, i overensstemmelse med de CPE resultater blev observeret 80% relativ replikation af Adhz63. Således Adhz63 replikation er mere undertrykte i WI-38 celler end i A549-celler. Resultatet er i overensstemmelse med vores tidligere observation, at cyclin EL induktion i kræftceller er forbundet med selektiv replikering af

E1b55K

-deleted Annoncer i cancerceller [34].

WI-38 eller A549 celler blev inficeret med AdGFP, Adwt eller Adhz63 ved en MOI på 5. (A) celler blev opsamlet ved 48 timer og derefter analyseret ved Western-blot. Cellelysater blev immunoblottedes for cyclin E og actin. Actin blev anvendt som en loading kontrol. (B) CPE blev fotograferet ved 72 timer efter infektion (p.i.). AI mikroskopi blev oprindeligt ved en forstørrelse på x100. (C) Virale titere blev bestemt ved 72 timer p.i. med infektionen enhed metoden. Værdien angiver middelværdien af ​​tre uafhængige forsøg, vist som den gennemsnitlige ændring i procent i forhold til Adwt kontrolgruppen ± S.D. * P. 0,05 sammenlignet med Adwt gruppen, Students

t

-test

cyclin E kan fremme posten S fasen og deltage i DNA-replikation via CDK2-afhængige [53] og CDK2-uafhængige pathways [59]. For at undersøge, om cyclin E-funktion i Ad replikation er CDK2 afhængige eller uafhængige, vi først søgte at undersøge den fysiske kontakt mellem CDK2 og cyklin EL i celler ramt af annoncer. Lungekræft A549 celler mock-inficeret eller inficeret med AdGFP, Adwt eller Adhz63. For at forstå, hvordan

E1b

-deleted Annoncer selektivt replikere i kræftceller, vi fokuseret på A549 lungekræft celler, hvor både Adwt og

E1b

-deleted Adhz63 effektivt kan fremkalde cyklin EL og replikerer. Ved 48 timer efter infektion (p.i.) blev celler opsamlet og lyseret. Vi brugte første anti-cyclin E-antistof til immunpræcipitere cyklin E-proteinet og analyseret de immunkomplekser med Western blot. Dataene viser, at cyclin E-protein udfældet fra celler mock-behandlede eller behandlet med replikationsdefekt AdGFP (negative kontroller) udviste ikke signifikant sammenhæng med CDK2 protein (Fig. 2A, bane 1 og 2). Men immunkomplekser fra Adwt- og Adhz63-inficerede A549-celler indeholdt både cyclin E og cyclin EL med en stigning på CDK2 binding (fig. 2A, bane 3 og 4). For at verificere dette cyklin E /CDK2 bonding, vi også brugt anti-CDK2 antistof til trække ned protein kompleks og derefter undersøgt niveauet af cyclin E proteiner i cyklin E-CDK2-kompleks. Den immunopræcipiterede CDK2 protein blev forøget i Adwt og Adhz63-inficerede celler med en samtidig udfældning af cyclin EL (fig. 2B, bane 3 og 4), især for Adwt-inficerede celler (bane 3). Resultaterne viser, at replikationskompetent Adwt og Adhz63 inducerer cyclin EL ekspression og øge dannelsen af ​​cyclin EL /CDK2 kompleks i A549 cancerceller, hvilket indikerer, at cyclin EL induceret i Ad-inficerede celler kraftigt associerer med CDK2.

(A) A549-cellelysater blev immunfældet med anti-cyclin E-antistof (1:50 fortynding). Immunkomplekser blev analyseret ved Western blot med cyclin E og CDK2 antistoffer. (B) De cellelysater blev immunfældet med anti-CDK2-antistof og immunoblottedes for CDK2, cyklin E og cyklin EL.

Adenovirus-induceret cyclin EL øger CDK2 fosforylering

CDK2 aktiveres ved phosphorylering på T160 websted, og dette phosphorylering forøger dets elektroforetiske mobilitet, hvilket resulterer i hurtigere-migrerende bånd [66]. Vi undersøgte, om cyclin EL induktion og øget samspil mellem cyklin EL og CDK2 i A549 celler efter Adwt og Adhz63 infektion kan fremme CDK2 fosforylering på det pågældende T160 site. Analyse af cellelysaterne med Western blot viste, at cyclin EL induktion førte til en stigning af den hurtigere migrerende CDK2, i overensstemmelse med phosphoryleret-CDK2 protein (pCDK2) T160 (den aktive form af CDK2), især ved 48 timer p.i. (Fig. 3A, bane 7 og 8). Vi kontrolleret hurtigere migrerende form af CDK2 med phospho-CDK2 (T160) antistof (# 2561, Cell signalering). Densitometrisk analyse af disse bånd viste, at Adwt infektion forårsaget en 1,3 til 2,7 gange forøgelse (P = 0,03) i niveauet af pCDK2 T160 og Adhz63 infektion forårsaget en 1,5 til 1,9 gange forøgelse (P = 0,0026) sammenlignet med mock-kontrol gruppe ved 48 timer pi (Fig. 3B, bane 3 og 4). Resultatet i figur 3B er i overensstemmelse med den i figur 3A (bane 7 og 8).

A549-celler blev fingeret inficeret eller inficeret med AdGFP, Adwt eller Adhz63 ved en MOI på 5. Cellerne blev opsamlet ved 24 h eller 48 h pi og derefter analyseret ved Western-blot. Cellelysater blev immunoblottedes for (A) cyclin E og CDK2; (B) pCDK2 T160; og (C) cyklin D, CDK4 og PCNA. Actin blev anvendt som en loading kontrol. Det scannede band intensitet blev kvantificeret og værdierne repræsenterer hjælp af de relative procenttal ændre sammenlignet med den mock gruppe ± standardafvigelse fra tre uafhængige tredobbeltforsøg. * P. 0,05 sammenlignet med mock-kontrolgruppen, t-test

Udover cyklin E, cyklin D er også involveret i overgangen af ​​G

1-S-fasen . Således har vi også undersøgt niveauet af cyclin D. Interessant nok blev niveauet af cyclin D faldt efter virusinfektion. Densitometrisk analyse af de bands demonstreret, at Adwt og Adhz63 infektion på 24 timer faldt cyklin D protein til niveauerne af 11% (P = 0,0000025) og 71% (P = 0,001) i mock-infektion, (fig. 3C, spor 3 og 4). Niveauerne af cyklin D i celler inficeret med Adwt eller Adhz63 var faldet yderligere efter 48 h til 3% (P = 0,00000043) og 8% (P = 0,00002), (fig. 3C, bane 7 og 8). I mellemtiden har niveauet af CDK4 og den prolifererende cellekerneantigen (PCNA) ikke signifikant i nogen af ​​grupperne. CDK4 reguleres og aktiveres af cyclin D at behandle G

1-S overgangen [67], [68]; PCNA, vides at regulere DNA-replikation og DNA-reparation, er forbundet med flere cyclin /CDK-komplekser i cellecyklusfremadskriden [69], [70]. Resultaterne viser, at annoncer faldt cyklin D produktion og påvirkede ikke niveauerne af CDK4. Således Ad infektion specifikt induceret cyclin EL der aktiveret CDK2 via fosforylering på sin T160 site, hvilket tyder på en kritisk rolle for cyklin EL og CDK2 i Ad replikation.

Adenovira stigning pRb fosforylering

cyclin E- aktiveret phosphoryleret CDK2 (pCDK2) vides at styre G

1-S overgang ved phosphorylering af de nedstrøms substrater. I betragtning af at pRb er en af ​​de velkendte mål for pCDK2 undersøgte vi, om forhøjelsen af ​​aktiveret pCDK2 ændrer phosphorylering af pRb ved S612, som er en CDK2-foretrukket phosphorylering rest [71], [72]. Vi fandt, at niveauet af phospho-pRb S612 blev forøget til 314% (P = 0,016) og 240% (P = 0,03) i celler inficeret med Adwt og Adhz63 henholdsvis selvom proteinniveauet af ikke-phosphoryleret pRb er faldet en smule ( fig. 4A, bane 3 og 4). Vi kunne ikke finde nogen væsentlige ændringer af p-pRb T821, en anden CDK2-foretrukne fosforylering rest [71], [73], og den CDK4-foretrukne p-pRb S795 [74] (fig. 4A). Resultaterne tyder valget af S612 stedet i pRb af Ad-aktiverede CDK2 for protein fosforylering.

A549 celler blev mock-inficeret eller inficeret med AdGFP, Adwt eller Adhz63 og indsamlet på 24 timer eller 48 timer pi efterfulgt af Western blot analyse. Cellelysater blev immunoblottedes for (A) pRb, phospho-pRb (p-pRb) ved S612, T821 og S795 eller (B) p21 og p27. Actin blev anvendt som en loading kontrol. * P 0,05 sammenlignet med mock-kontrolgruppen, t-test

Adenovira undertrykke CDK-inhibitorer

Vi observerede også, at protein niveauer af både p21 og p27 er faldet. i A549-celler inficeret med Adwt og Adhz63, især for p21 (fig 4B). p21 og p27 er de velkendte CDK-inhibitorer, som har en negativ regulerer aktiviteten af ​​cyclin E /CDK2-komplekser til at forhindre cellecyklusfremadskriden [75]. Densitometrisk analyse af disse bånd viste, at niveauet af p21-protein faldt til niveauerne af 8% (P = 0,0000002) og 44% (P = 0,00066) af mock kontrol i A549-celler efter infektion med Adwt og Adhz63 ved 24 timer, henholdsvis (fig. 4B, spor 3 og 4). P21-niveauet blev yderligere undertrykt i A549-celler ved 48 timer efter infektion med Adwt (2%, P = 0,00000034) og Adhz63 (6%, P = 0,0000007) (fig. 4B, bane 7 og 8). Ad infektion faldt også P27 proteinniveauer til 36% (Adwt, P = 0,0015) og 49% (Adhz63, P = 0,00043) ved 24 timer; 16% (Adwt, P = 0,00012) og 37% (Adhz63, P = 0,0092) ved 48 timer i A549-celler (fig. 4B). Resultaterne antydede, at annoncer aktivere CDK2 ved at inducere cyklin EL og undertrykke p21 og p27.

Afbrydelse af cyklin EL og CDK2 interaktion reducerer adenovirusreplikation

For yderligere at undersøge den rolle CDK2 i viral replikation brugte vi CDK2 kemisk inhibitor roscovitin (Ros, CYC202) at afbryde cyklin EL og CDK2 interaktion. Ros er en purin-derivat, der hæmmer aktiviteten af ​​CDK2 ved binding til dets aktive sted [76]. Ros reducerer phosphorylering på CDK2 [77] og blokerer androstendion-inducerede stigning af aktiv phosphoryleret CDK2 [78]. Hvis aktivering af CDK2 er nødvendig for viral replikation, bør blokerende CDK2-aktivitet reducere den. Figur 5A, udgør en af ​​de fire gentagne forsøg, viser, at med øget Ros, CPE forårsaget af Adwt og Adhz63 infektion var delvist inhiberet. Figur 5B viser, at behandling med 5 uM Ros førte til en reduktion i Adwt titer (P = 0,0002) og 71% reduktion i Adhz63 titer (P = 0,034) 50% i forhold til den vehikel-kontrolgruppen behandlet med dimethylsulfoxid (DMSO , defineret som 0 uM Ros). Behandling med 10 pM Ros ført til flere fald på virustitere: 81% reduktion i Adwt (P = 0,00001) og 87% reduktion i Adhz63 (P = 0,012). De undertrykte virale udbytter er i overensstemmelse med CPE fænomen i figur 5A.

(A) Celler blev behandlet med 0 pM (køretøj-kontrol gruppe behandlet med DMSO), 5 pM, eller 10 uM roscovitin, og mock- inficeret eller inficeret med AdGFP, Adwt eller Adhz63 ved en MOI på 5. Alle mikroskopi er oprindeligt ved en forstørrelse på x100 taget ved 48 h pi (B) Virale titere blev bestemt ved 48 timer p.i. med infektionen enhed metoden. Værdierne repræsenterer middelværdier ± S.D. uafhængig firdobbelt. * P 0,05 sammenlignet med 0 uM roscovitin, Students

t

-test

Vi undersøgte derefter niveauerne af viralt DNA og proteiner produceret i celler ramt af Ros behandling.. Det virale DNA-syntese blev bestemt ved Southern blot probet med Ad-genomet. Den lineære Adwt DNA er 36KB med alt 28

Pst

restriktionssteder. Den største fragment er 4333 bp og den mindste fragment er kun 12 bp. Størrelserne af de repræsentative DNA-fragmenter blev markeret på figur 6. Det virale DNA-syntese af Adwt og Adhz63 ved 24 timer p.i. blev stærkt inhiberet i nærvær af 10 uM Ros (fig. 6A, bane 6 og 12). Konsekvent blev de virale capsidproteiner signifikant hæmmet i nærvær af 10 uM Ros (fig. 6B, bane 4 og 6). Hæmning af CDK2 aktivitet med Ros reducerede fosforylering af pRb på S612 stedet i AdGFP, Adwt og Adhz63-behandlede celler (Fig. 6C). Interessant, Ros behandling markant undertrykt induktion af cyclin EL proteinet forårsaget af Adwt og Adhz63 infektion (fig. 6C, bane 4 og 6). Sammenfattende viser disse data, at inhibering af CDK2 med Ros undertrykt pRb phosphorylering hæmmede viral replikation.

(A) A549-celler blev opsamlet ved 0 timer og 24 timer p.i. Viral DNA-syntese blev bestemt ved Southern-blot. Ved 24 timer p.i. blev cellerne høstet og cellelysater blev immunoblottedes for (B) adenovirus type 5 capsidproteiner, (C) cyclin EL, p-pRb S612, og actin. Actin blev anvendt som en loading kontrol. * P. 0,05 sammenlignet med 0 uM roscovitin-behandlede gruppe, t-test

siRNA hæmme CDK2 undertrykker adenovirusreplikation ved at forhindre pRb fosforylering

Da den kemiske inhibitor Ros kan også påvirke andre CDK og kinaser [79], vi anvendte også RNA-interferens til specifikt at lukke munden CDK2 udtryk.