PLoS ONE: Ændringer i Gener af EGFR signalvejen og deres forhold til EGFR tyrosinkinasehæmmer Følsomhed i Lung Cancer Cell Lines

Abstrakt

Baggrund

Deregulering af

EGFR

signalering er almindelig i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), og dette fund førte til udviklingen af ​​tyrosinkinaseinhibitorer (TKI’er), som er meget effektive i en delmængde af NSCLC. Mutationer af

EGFR

(m

EGFR

) og antal kopier gevinster (CNGs) af

EGFR

(g

EGFR

) og

HER2

(g

HER2

) er blevet rapporteret til at forudsige for TKI respons. Mutationer i

KRAS Hotel (m

KRAS

) er forbundet med primær resistens mod TKI’er.

Metode /Principal Fund

Vi undersøgte sammenhængen mellem mutationer CNGs og reaktion på TKI’er i et stort panel af NSCLC cellelinjer. Gener undersøgte var

EGFR

,

HER2

,

HER3 HER4

,

KRAS

,

BRAF

PIK3CA

. Mutationer blev påvist ved sekventering, mens CNGs blev bestemt ved kvantitativ PCR (qPCR), fluorescens in situ hybridisering (FISH) og array komparativ genomisk hybridisering (aCGH). IC50-værdierne for TKI’er gefitinib (Iressa) og erlotinib (Tarceva) blev bestemt ved MTS assay. For enhver af de syv gener testet, mutationer (39/77, 50,6%), kopi nummer gevinster (50/77, 64,9%) eller enten (65/77, 84,4%) var hyppige i NSCLC linjer. Mutationer af

EGFR Hotel (13%) og

KRAS

(24,7%) var hyppige, mens de var mindre hyppige i de andre gener. De tre teknikker til bestemmelse af CNG var godt korreleret, og qPCR data blev anvendt til yderligere analyser. CNGs var relativt hyppige for

EGFR

KRAS

i adenokarcinomer. Mens mutationer var stort set udelukker hinanden, CNGs var ikke.

EGFR

KRAS

mutant linjer ofte demonstreret mutant allel specifik ubalance dvs. mutant form, var som regel i stort overskud i forhold til vildtype formular. På molær basis, blev følsomhed over for gefitinib og erlotinib stærkt korreleret. Multivariat analyser førte til følgende resultater:

1. m

EGFR

og g

EGFR

og g

HER2

var uafhængige faktorer relateret til gefitinib følsomhed, i prioriteret rækkefølge.

2. m

KRAS

var forbundet med øget in vitro resistens over for gefitinib.

konklusioner /betydning

Vores in vitro undersøgelser bekræfter og udvider kliniske observationer og demonstrere den relative betydning af både

EGFR

mutationer og CNGs og

HER2

CNGs i følsomheden over for TKI’er

Henvisning:. Gandhi J, Zhang J, Xie Y, soh J, Shigematsu H, Zhang W, et al. (2009) Ændringer i Gener af EGFR signalvejen og deres forhold til EGFR tyrosinkinasehæmmer Følsomhed i lungekræft cellelinier. PLoS ONE 4 (2): e4576. doi: 10,1371 /journal.pone.0004576

Redaktør: Alfred Lewin, University of Florida, USA

Modtaget: September 16, 2008; Accepteret: 18. december 2008; Publiceret: 24 feb 2009

Copyright: © 2009 Gandhi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Funding var modtaget fra Specialized Program for Forskning Excellence i lungekræft (P50CA70907) og tidlig påvisning Research Network, National Cancer Institute, Bethesda, Maryland (U01CA084971). Midler fra både tilskud blev anvendt til støtte løn og til udførelsen af ​​analyser. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Dr. Gazdar er en betalt konsulent /underviser for AstraZeneca PLC. Dr. Garcia recieves Research Funding 10.000 fra AstraZeneca, Genentech og OSI; Honoraret 10.000 fra Roche. Dr. Minna modtager forskningsstøtte fra AstraZeneca PLC.

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til alle kræftdødsfald verdensplan [1]. På trods af de seneste fremskridt inden for diagnose og multimodalitet behandlinger for lungekræft, prognosen er stadig fattige med 5-års overlevelsesrater på kun 16% for alle faser [2].

Lungekræft er karakteriseret ved ophobning af multiple genetiske og epigenetiske ændringer herunder somatiske mutationer og genkopital gevinster eller begge, som resulterer i aktivering af onkogener eller inaktivering af tumorsuppressorgener [3]. Epidermal vækstfaktor receptor (

EGFR

) deregulering er blevet observeret i flere tumortyper, herunder ikke-småcellet lungekræft (NSCLCs) [4]. Hirsch et. al. identificeret hyppige

EGFR

protein overekspression (62%) i NSCLCs af planocellulære og adenocarcinom undertyper [5].

EGFR

overekspression er ofte forbundet med negativ prognose [6]. Den receptortyrosinkinase (RTK) super-familien af ​​celleoverfladereceptorer tjener som mediatorer af cellesignalering af ekstra-cellulære vækstfaktorer. Medlemmer af erbB familien af ​​RTK’er, herunder

EGFR (HER1 /ErbB1)

,

HER2 (ERBB2 /EGFR2)

,

HER3 (ErbB3 /EGFR3)

HER4 (ErbB4 /EGFR4)

har fået megen opmærksomhed på grund af deres stærke tilknytning til ondartet spredning.

RAS /MAPK og PI3K /AKT veje er store signalering netværk, der forbinder

EGFR

aktivering til celleproliferation og overlevelse [7]. Som beskrevet nedenfor

EGFR

signalvej gener er blevet rapporteret at være muteret i NSCLC. Afhængigt af den geografiske placering,

EGFR

KRAS

mutationer er blevet identificeret i ~ 10% -30% af NSCLCs [3], [8].

EGFR

mutationer er uafhængigt associeret med adenocarcinom histologi, østasiatiske etnicitet, aldrig ryge status og kvindelige køn. Mutationer af

KRAS

også målrette adenocarcinom histologi, men ellers adskiller sig fra

EGFR

mutationer fordi de er relativt sjældne i østasiater og forekommer hyppigere hos mænd og rygere [9]. Mindre almindeligt har somatiske mutationer også fundet i andre

EGFR

pathway gener, herunder

HER2

(ca. 2%) [10],

HER4

(ca. 2%) [ ,,,0],11],

BRAF

(ca. 2%) [12], og

PIK3CA

(-4%) [13], [14].

genkopital gevinster (CNGs) på grund af fokal forstærkning eller kromosomal polysomy, er en af ​​de andre store mekanismer onkogen aktivering [15]. Lockwood et al. identificerede flere komponenter i

EGFR

vej signalering ofte blev forstærket og over-udtrykt i NSCLC. Interessant, fandt de også, at

EGFR

pathway genamplifikation var hyppigere i adenocarcinom undertype af NSCLC.

På grund af den hyppige deregulering af

EGFR

pathway gener i NSCLC, EGFR blev en af ​​de første rationelt udvalgte molekyler til målrettet terapi. Mens de første målrettede strategier anvendes monoklonale antistoffer, som blokerer ligand-receptor-interaktion, har nyere tilgange anvendes lavmolekylære reversible tyrosinkinaseinhibitorer (TKI’er). Den tyrosinkinaseaktiviteten af ​​

EGFR

er nødvendig for de biokemiske reaktioner induceret af denne receptor [7], [16], [17]. To TKI’er, gefitinib (Iressa, AstraZeneca) og erlotinib (Tarceva, Genentech) er ofte blevet brugt i behandlingen af ​​fremskreden eller recidiverende NSCLC. Svarene blev noteret i delmængder, især østasiatiske etnicitet, kvindelige køn, aldrig ryge status og adenocarcinom histologi [18], [19], [20]. Efterfølgende

EGFR

mutationer blev identificeret i tyrosinkinasedomænet, og forudsagde for reaktion på TKI i samme delmængde af patienterne [21], [22], [23]. Ifølge en metaanalyse af 1170 patienter, mere end 70% af NSCLCs med

EGFR

mutationer reagerede på TKI’er, mens 10% af tumorer uden

EGFR

mutation reagerede [24]. yderligere undersøgelser imidlertid anført, at andre end faktorer

EGFR

mutationer kan spille en rolle i fastlæggelsen respons og overlevelse efter TKI-terapi.

EGFR

genkopitallet gevinst var forbundet med betydeligt forbedret TKI følsomhed og overlevelse i en stor umarkeret studie med passende kontroller [25]. Desuden andre medlemmer af

EGFR

familie dvs.

HER2

[26] og

EGFR3

[27] kan være vigtige faktorer involveret i TKI følsomhed. En yderligere kompleksitet er den kliniske observation, at somatiske mutationer af

KRAS

bibringe iboende modstand mod TKI’er [28].

For yderligere at forstå forholdet mellem TKI følsomhed og deregulering af

EGFR

pathway gener, vi undersøgte mutation og kopiere antal status på syv af disse gener (

EGFR

,

HER2

,

HER3

,

HER4

,

KRAS

,

BRAF

, og

PIK3CA

) i et stort panel af lungekræft-cellelinjer og korreleret data med in vitro-følsomhed over for TKI’er.

Materialer og metoder

tumorcellelinier

Vi studerede i alt 112 cellelinjer, der består af 77 NSCLC og 32 småcellet lungekræft (SCLC) og tre linjer fra små celle kræft på ekstrapulmonale sites (ekstrapulmonale små celle kræft, ExPuSC) [29]. Alle undtagen tre af disse cellelinjer blev etableret af forfatterne [30] på en af ​​to steder. Cellelinjer indledt ved NCI har præfikset NCI-H, mens linjer fastlagt på UT Southwestern har præfikset HCC. NCI-H3255 blev opnået fra Dr. Bruce Johnson (Lowe Center for Thoracic Oncology, Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA) [22]. PC-9 (oprindeligt fra Tokyo Medical University, Tokyo, Japan) blev opnået fra Dr. Bert Vogelstein (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD). Calu-3 blev erhvervet fra American Type Culture Center (Manassas, VA). Vi undersøgte også otte immortaliserede humane bronchieepithelceller cellelinier (HBECs, HBEC1KT, HBEC3KT, HBEC4KT, HBEC5KT, HBEC17KT, HBEC30KT, HBEC31KT og HBEC34KT), som blev indledt af os [31].

Det meste af tumor celle linjer blev holdt i RPMI1640 tilsat 5-10% kalvefosterserum (FBS). Et par cellelinier blev dyrket i ACL4 (for NSCLC linjer) og HITES (for SCLC linjer) suppleret med 5% FBS. Alle HBEC cellelinier blev opretholdt i keratinocyt-SFM (Invitrogen, Carlsbad, CA) med bovin hypofyse (BPE) og rekombinant epidermal vækstfaktor (EGF) [31]. Alle cellelinier blev inkuberet ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO

2.

Den genetiske fingeraftryk af hver cellelinje blev opnået (Powerplex 1.2-system, Promega, Madison, WI), og hver cellelinie havde en unik genetisk profil, som var identisk med profilerne opnået fra American Type Culture Collection.

DNA og RNA-ekstraktion

Genomisk DNA blev opnået fra cellelinje pellets ved standard phenol-chloroform (01:01) ekstraktion efterfulgt af ethanoludfældning [32] eller ved anvendelse DNeasy Tissue Kit (QIAGEN, Valencia, CA). Total RNA blev opnået fra cellelinjer under anvendelse RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). cDNA blev fremstillet som beskrevet tidligere [14].

Gene Sequencing

DNA sekventering og mutationsanalyse for

EGFR

(exon 18-21),

HER2

(exon 19 og 20),

KRAS

(codon 12, 13 og 61),

BRAF

(exon 11 og 15) og

PIK3CA

(exon 9 og 20) blev udført som rapporteret af os tidligere [10], [14], [32].

HER3

(exon 18-21) og

HER4

(exons18-23) mutation status blev analyseret ved PCR-amplifikation af genomisk DNA eller cDNA og direkte sekventering af PCR-produkter [10]. Mutationerne i disse gener blev bestemt ved anvendelse af PCR-primerne som anført (tabel S6). Alle PCR’er blev udført i 25 pi volumener indeholdende 100 ng DNA ved anvendelse HotStarTaq DNA polymerase (QIAGEN Inc., Valencia, CA). DNA blev amplificeret i 32 til 34 cykler ved 95 ° C i 30 sekunder, 62 ° C til 68 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 30 sekunder efterfulgt af 7 minutter ekstension ved 72 ° C. Alle PCR-produkter blev inkuberet ved anvendelse exonuklease I og reje-alkalisk phosphatase (Amersham Biosciences Co, Piscataway, NJ) og sekventeret direkte under anvendelse af Applied Biosystems PRISM dye terminator cycle-sekventering metode (Perkin-Elmer Co., Foster City, CA). Alle mutationer blev bekræftet af uafhængige sekventering i begge retninger.

Kopier nummer evaluering

Kopiér nummer gevinster kan bedømmes ved en række metoder. Ved kliniske prøver, er fluorescens in situ hybridisering (FISH) ofte anvendes, da det kan skelne mellem tumor og ikke-maligne celler. Laboratorieundersøgelser af tumorcellelinier (som er fri for ikke-maligne celler) ofte anvender kvantitativ PCR (qPCR). En alternativ metode er matrix komparativ genomisk hybridisering (aCGH). Fordi direkte sammenligninger af disse metoder sjældent har været rapporteret [33], vi udnyttet alle tre metoder.

Real-time qPCR

Gene kopiantal blev bestemt ved hjælp af real-time kvantitativ PCR ansætte de Chromo4 PCR System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). For at bestemme kopitallet af et målgen, vi anvendte kontrolpaneler gener lokaliseret på det samme kromosom som målgenet (tabel S6). De fremkomne nøgletal blev sammenlignet med tilsvarende nøgletal fra diploide celler (de gennemsnitlige værdier af de otte HBEC cellelinjer. TaqMan metode blev anvendt, bortset fra

PIK3CA

[14]. Primere og prober blev valgt af TaqMan Primer Express ™ 1.5 (Applied Biosystem, Foster City, CA). primere blev erhvervet fra Invitrogen og prober fra Biosearch Technologies (Novato, CA). sekvenserne af primere og prober er vist i tabel S6. Standardkurver blev konstrueret med seriefortyndinger af specifikke PCR-produkter. amplifikationsprodukter blandinger (25 pi) indeholdt prøve-DNA (20 ng), 10 × TaqMan-buffer (2,5 pi), 200 uM dNTP, 1,25 U Hotstar Taq ™ DNA-polymerase, 200 nM af hver primer og 100 nM probe. de termiske cyklusbetingelser omfattede 5 minutter ved 95 ° C og 40 cykler ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 30 s. Alle prøver blev analyseret tredobbelt. parameteren C

t er lig med den fraktionerede cyklusnummer hvor fluorescensen genereret ved spaltning af proben passerer en fast tærskelværdi over baseline. Målgenet kopital i ukendte prøver kvantificeres ved måling af C

t-værdier og ved anvendelse af en standardkurve for at bestemme kopitallet [34]. Genkopital blev beregnet ved anvendelse af følgende ligning: g = (S

T /S

C) /(N

T /N

C).

PIK3CA

kopi nummer blev vurderet som beskrevet af os tidligere [14].

Fliselægning sti aCGH

aCGH blev udført som beskrevet tidligere [14], [15]. Genomiske ubalancer blev identificeret under anvendelse aCGH-Glat [35] som tidligere beskrevet [36].

FISH assays

tofarvet FISH assays blev udført ifølge en standardprotokol [37], [38 ]. De probe sæt, EGFR /CEP7 og PathVysion og kontrol CEP7 blev opnået fra Abbott Molecular (Des Plaines, Illinois), HER3 /CEP12 blev opnået fra Qbiogene; BRAF probe blev genereret fra det bakterielle kunstige klon (BAC) klon anvendes til aCGH. De kopi numre på target gener (mærket i røde fluoroforer) og CEP prober (mærket i Spectrum Grøn) blev verificeret i mindst 100 interfaseceller og 20 metafasespredninger. Billeder blev taget til fange og fusionerede bruge CytoVision arbejdsstation (Applied Imaging, San Jose, CA).

Sub-kloning

Genomisk DNA blev isoleret fra mutant

EGFR

eller

KRAS

NSCLC cellelinjer og bruges som en skabelon til PCR-amplifikation af

EGFR

eller

KRAS

. Primerne og betingelserne i PCR-reaktioner var som beskrevet tidligere. PCR-produkter blev klonet i pCR2.1-TOPO vektor ved anvendelse TOPO TA kloning kittet (Invitrogen). Omkring 20 kloner (range15-25) blev udvalgt til sekventering ved hjælp af enten M13 frem primer eller tilsvarende

EGFR

eller

KRAS

primere. Resultaterne er udtrykt som procentdele af mutante alleler er til stede i det samlede antal klonede.

TKI følsomhed

MTS kolorimetrisk assay (Promega) blev udført i henhold til fabrikantens anvisninger. Dette assay er baseret på omdannelsen af ​​MTS til opløseligt formazan af endogene dehydrogenaseenzymer findes i metabolisk aktive celler. Celler blev udpladet ved 1 x 10

3-4 × 10

3 celler /brønd i vævskulturbehandlede plader med 96 brønde. Den følgende dag, TKI (gefitinib eller erlotinib) blev tilsat til hver plade i en fortyndingsrække hen over pladen, således at otte forskellige koncentrationer af lægemidlet blev testet. På dag 5 blev 20 pi MTS tilsat efterfulgt af 1 times inkubation ved 37 ° C og derefter absorbansen blev aflæst ved 490 nm på en pladelæser.

96-brønds plade data blev indført til en in-house Database over in vitro drug Følsomhed analyser (Divisa af Luc Girard, manuskript under udarbejdelse), hvor IC50 beregnes samt forskellige statistiske analyser. For at beregne IC50-værdierne, de data, der var baggrunden-korrigeret (kolonne 1 og 12 indeholdt typisk medier uden celler eller narkotika og tjente som baggrundsværdier), og monteret på DRC-modellen (R pakke “DRC” af Christian Ritz og Jens Streibig, https://www.bioassay.dk) til at generere en s-formet kurve, hvorfra den koncentration, som inhiberer 50% af cellerne (IC50) blev bestemt.

statistiske analyser

Fishers tosidet eksakte test blev bestemt under anvendelse af Prism 4 software (Graph Pad, San Diego, CA). P-værdier 0,05 blev anset for signifikante. Andre statistiske analyser diskuteres under passende kategorier i afsnittet Resultater.

Resultater

Mutationer (m) og CNGs (g) i lungekræft-cellelinjer

Vi undersøgte 32 SCLC og tre linjer fra små celle kræft fra ekstrapulmonale sites (ekstrapulmonale små celle kræft, ExPuSC), for somatiske mutationer og CNGs af

EGFR

pathway gener. Vi fandt i alt kun tre mutationer i 35 cellelinjer og alle tre var

PIK3CA

mutationer (tabel S1). CNGs for

EGFR

pathway gener blev sjældent stødt på i SCLC (tabel S2). Da somatiske mutationer og CNGs for

EGFR

pathway gener var sjældne i SCLC, vi begrænset vores yderligere undersøgelser for at NSCLC.

For enhver af de syv testede gener, mutationer (39/77, 50,6% ), kopi nummer gevinster (50/77, 64,9%) eller enten (65/77, 84,4%) var hyppige i NSCLC linjer. Disse resultater er diskuteret nærmere nedenfor.

Mutationer (m) af

EGFR

pathway gener i NSCLC

Vi undersøgte NSCLC linjer, for somatiske mutationer af

EGFR

pathway gener som anført i afsnittet Metoder. Vi fandt i alt 40 mutationer i 39 (50,6%) cellelinjer (Fig 1a, tabel S3). Disse mutationer bestod af 19

KRAS

(24,7%), 10

EGFR Hotel (13%), fem

BRAF Hotel (6,5%), fire

PIK3CA

(5,2%), en

HER2 Hotel (1,3%), en

HER4 Hotel (2,2%) og ingen for

HER3

. m

EGFR

, m

BRAF

og m

HER2

var til stede udelukkende i adenokarcinomer, mens m

KRAS

var hyppigere i adenocarcinom og store celle histologier. m

PIK3CA

var de eneste mutationer, der ikke er målrettet adenokarcinom histologi (fig. 1c).

Fig 1a. viser frekvensen af ​​mutationer og kopiere nummer gevinster på

EGFR

pathway gener (

EGFR

,

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

,

HER2

,

HER3

HER4

). Fyrre mutationer blev identificeret i 39 cellelinier. Mutationer og eksemplarnummer gevinster var hyppigere for

EGFR Hotel (13%, 40,3%) og

KRAS

(24,7%, 14,3%) end andet gen. CNGs for

HER2

(18,2%) var også almindelige. Vi identificerede kun én

HER2

en

HER4

somatisk mutation. Tallene over søjlerne angiver antallet af cellelinjer med mutationer (blå søjler) eller kopi nummer gevinster (røde søjler). Fig 1b. Figuren viser antallet af gener demonstrerer CNGs i mutante og vildtype cellelinier. Af de 77 celler undersøgte linjer, 39 (50,6%) havde en mutation i mindst en af ​​syv EGFR syntesevejsgener undersøgte. CNGs var hyppige i både muterede og vilde typen cellelinjer. Fig 1c. viser hyppigheden af ​​mutationer på basis af NSCLC subtype. Mutationer af

EGFR

BRAF

blev udelukkende findes i adenocarcinom subtype. Det indre

HER2

mutation var i en adenocarcinom i sammenligning med

HER4

somatisk mutation, som blev identificeret i en planocellulært ca. Fig 1d. viser hyppigheden af ​​kopi nummer gevinster (CNGs) (g 4 af qPCR) på grundlag af NSCLC undertype. CNGs for

BRAF

PIK3CA

blev set overvejende adenocarcinom og pladecellekræft hhv. CNGs for resten af ​​generne ikke favorisere nogen undertype.

Mutationer er gensidigt udelukkende

Vi undersøgt for enhver sammenslutning mellem somatiske mutationer i enkelte cellelinjer. For at teste hypotesen at

EGFR

pathway genmutationer er gensidigt udelukkende, vi bruges Monte Carlo-simuleringer til at beregne den empiriske p-værdi. Nulhypotesen er, at mutationer vil forekomme uafhængigt. Vi simulerede fælles distribution af mutationsbegivenheder blandt disse syv gener af de observerede marginale mutationsrater og den uafhængige antagelse. I hver simulering, bemærkede vi antallet af cellelinier med multiple mutationer. Vi gentog simuleringer 10.000 gange og opnåede den empiriske fordeling af antallet af cellelinier med multiple mutationer; derefter sammenlignet vi det observerede antal cellelinier med multiple mutationer med dette empirisk fordeling til beregning af p-værdi

Til denne undersøgelse den ensidige p-værdi er 0,0014.; derfor afvist vi nulhypotesen og konkluderede, at genmutationer er gensidigt eksklusive arrangementer for disse gener i NSCLC cellelinjer, med en enkelt undtagelse (tabel 1). Stor celle karcinom line NCI-H460 havde både

KRAS

PIK3CA

mutationer.

Sammenligning af metoder til bestemmelse af kopital gevinster

aCGH , FISH og qPCR blev anvendt til at teste gen kopiantal for NSCLC cellelinier. Der er ingen klar biologisk tærskelværdi for at definere de unormale kopi numre for NSCLC menneskelige cellelinier; Vi har valgt de tærskelværdier, som kunne opnå den bedste positive eller negative kategori enighed blandt de tre prøver. Konkret har vi beregnet de Kappa statistik [39] mellem aCGH og qPCR forsøg over to dimensionelle cut-off net som 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 og 5; og så gjorde det samme for FISH og qPCR. De afskæringsværdier, der opnåede den bedste enighed blandt tre prøver var som følger: 4 for qPCR, 3 for CGH og 4.5 for FISH; og vi bruges disse værdier til at definere tilstedeværelsen af ​​kopital gevinster i NSCLC-cellelinier. Ved hjælp af disse cut-off-værdier og alle tilgængelige data, der var meget signifikant konkordans (p 0,001) mellem de tre metoder, som vist i tabel 2.

EGFR

pathway gen CNGs

som qPCR data var fuldstændige for alle linjer (mens delmængder blev testet af de to andre metoder, som er mere besværlige og dyre), brugte vi qPCR data for alle yderligere analyser. Kopier nummer gevinster var hyppige ( 10%) for

EGFR

,

HER2

,

HER3

KRAS

(figur 1a, tabel S4) . Især gevinster for

EGFR

var mere end dobbelt så hyppigt (40%) end for nogen anden gen. Generelt med undtagelse af g

BRAF

(begrænset til adenocarcinom histologi), og g

PIK3CA

(stort set begrænset til pladecellehistologi), CNGs viste ikke nogen tilsyneladende histologi undertype bias ( fig. 1c).

Forholdet mellem mutationer og Copy nummer gevinster

i modsætning til mutationer, kopi nummer gevinster ikke var gensidigt udelukkende enten med andre CNGs eller med mutationer (fig. 2). Vi fandt CNGs for to eller flere gener i 32,5% (25/77) af cellelinier (Tabel S4). Men vi bemærkede en meget signifikant sammenhæng mellem mutationer af

EGFR

eller

KRAS

CNGs deres respektive gener (figur 3a, 3b).

Fig 2a. viser, at kopiere nummer gevinster og mutationer udelukker ikke hinanden. Som det fremgår af figuren CNGs for

EGFR

KRAS

er betydeligt hyppigere i

EGFR

KRAS

mutant cellelinjer (p 0,05 ). Der var kun én

HER2

HER4

mutant NSCLC cellelinje og dermed de er ikke medtaget i denne figur. Fig 2b. viser, at kopiere antal gevinster udelukker ikke hinanden og gevinster på ét gen kan forekomme i overværelse af gevinster for andre gener.

EGFR

og

KRAS

gener fortrinsvis har kopiantal gevinster (CNG) i cellelinier indeholdende de respektive mutationer (panel a og b). I mutante linjer, den mutante allel næsten altid er i overskud i forhold til vildtype-allelen (paneler C og D), et fænomen vi har kaldt MASI. I de fleste tilfælde Masi mutantallelen demonstrerer CNGs; dog MASI kan også være til stede i cellelinier med en diploid kopitallet af onkogenet, (erhvervet uniparental disomi) enten ensartet (NCI-H460) eller heterogen (NCI-H1975).

Mutant allelspecifik ubalance (MASI) for

EGFR

KRAS

gener

Som nævnt ovenfor CNGs af

EGFR

KRAS

var hyppigere i celle linjer der huser disse mutationer. Anvender sub-kloning metode beskrevet tidligere, undersøgte vi, om

EGFR

KRAS

gener fortrinsvis demonstreret mutant allelspecifikke CNGs i cellelinjer huser de respektive mutationer (Fig. 3). Dataene, tester hvorvidt mutante alleler amplificeres i genmutant cellelinjer er grupperet data med binære udfald. Hver cellelinje er en klynge og nulhypotesen er, at mutationen sats er 0,5. Da antallet af subkloner i hver celle linie varieret, brugte vi analysen tilgang til klynger binære resultat med forskellige klyngestørrelser [40]. I mutante linjer, den mutante allel var næsten altid i overskud sammenlignet med vildtype-allelen, et fænomen vi har kaldt MASI. Den p-værdi for

EGFR

mutant cellelinjer var 0,019 og for

KRAS

mutant cellelinje var 0,0003 angiver, at de muterede alleler var fortrinsvis dominerende i begge tilfælde. De fleste Masi tilfældene skyldtes øget kopital af den mutante allel. Men i de færreste tilfælde MASI blev også bemærket i celler med diploide eller i nærheden af ​​diploide kopi numre (erhvervet uniparental disomi). Således brugte vi udtrykket MASI i modsætning til mutant allelspecifikke gevinster.

Karakteristik af

EGFR

Mutant cellelinier

De klinisk-patologiske og molekylære data for 10 NSCLC celle linier, som huser

er EGFR

mutationer opsummeret i tabel 3. Alle indeholdt en af ​​de to store mutationer i kinasedomænet, enten deletioner af exon 19 (n = 7) eller L858R mutation i exon 21 (n = 3 ). Mutationer blev udelukkende set i adenocarcinom og aldrig rygere eller patienter med lav eksponering tobak (≤ 10 pack år). En

EGFR

mutant cellelinje blev udviklet i Japan og de resterende ni blev udviklet i Nordamerika. Af de ni udviklet i Nordamerika, kun én var fra et individ af asiatisk oprindelse. Desuden har vi identificeret, at

EGFR

mutationer var mere almindelige i forholdsvis yngre aldersgruppe ( 55 år).

Syv af disse cellelinjer var følsomme over for gefitinib. De tre resistente linjer havde en anden mutation: enten T790M modstand forbundet mutation i exon 20 (n = 2) eller en homozygot sletning af

PTEN

gen- og fravær af sin protein [41] (forfatteres upublicerede observationer ).

effekter af mutationer og kopiere antal gevinster på følsomhed over for TKI’er

for at vurdere effekten af ​​mutationer og kopiere nummer gevinster på følsomhed over for TKI’er, vi analyserede IC50-værdier på 45 NSCLC cellelinjer . Fordi TKI klinisk sensitivitet fortrinsvis rettet mod adenocarcinom histologi, vi medtaget 31 adenocarcinomer. Hele delmængde omfattede alle de

EGFR

,

HER2

HER4

mutant cellelinjer og 12

KRAS

3

BRAF

cellelinier. Fordi

PIK3CA

mutationer begunstiget ikke-adenocarcinom histologi kun én

PIK3CA

mutant cellelinje var inkluderet. Af hele delmængde 17 linjer var vildtype for alle testede gener (Tabel S5)

Vi fandt en fremragende overensstemmelse mellem de IC50 værdier mellem gefitinib og erlotinib. (P 0,0001) (fig 4, tabel S7). Fordi vores datasæt for gefitinib følsomhed var mere omfattende, vi valgte at udnytte gefitinib data for yderligere analyser

Fyrre fem cellelinjer blev testet for følsomhed over for begge lægemidler og konkordansen var fremragende (p 0,0001)..

fig. 5 illustrerer følsomhed mønstre af de testede cellelinier. In vitro koncentration på 1 uM anvendes i vævskultur korrelerer med plasmakoncentrationen af ​​gefitinib hos patienter behandlet med standarddosis af gefitinib dvs. 250 mg om dagen. Denne tærskel er blevet brugt af forskere i fortiden for at skelne følsomme ufølsomme og /eller resistente cellelinier [7]. På grundlag af den ovennævnte tærskel og formen af ​​kurven, vi delte vores cellelinjer i 3 kategorier: følsomme (≤1 uM), mellemprodukt ( 1 uM men ≤10 uM) og resistente ( 10 um ) som vist i figur fig. 5. IC50-værdierne følger en linje, der demonstrerede en skråning ændring punkt ved ca. 10 uM, og således demonstrerede en tilsyneladende bimodal fordeling (fig. 5). Som cellelinjer med værdier på under 1 pM blev betragtet som følsomme, vi vilkårligt kategoriseret værdier mellem 1 og 10 uM som værende mellemprodukt i følsomhed.

Fig 5. viser en log kurven for de gefitinib IC50-værdier for 45 NSCLC celle linjer. De klassificeres i tre kategorier på grundlag af gefitinibs IC50: Følsomme (IC50 1 uM), Intermediate (IC50 1 men 10 uM) og Resistent (IC50 10 uM). Af de ni følsomme cellelinjer, syv af dem harbor

EGFR

mutationer, man har CNGs for

EGFR

og man har CNG for

HER2

. Af de resterende

EGFR

mutant cellelinjer, to havde T790M mutation (en mellemliggende og en resistent), og en havde en homozygot sletning af

PTEN

(resistente).

KRAS

mutant og vilde typen cellelinjer var alle resistente over for gefitinib.

Der var ni cellelinjer i den følsomme gruppe, og de omfattede syv af de ti m

EGFR

linjer, en g

EGFR

cellelinje og en g

HER2

cellelinje. Den mellemliggende kategori bestod af kun to cellelinjer; en m

EGFR

cellelinie med en sekundær T790M mutation og en g

HER2

cellelinje. Den resistente cellelinje kategori var den største og omfattede to m

EGFR

cellelinjer, en, der har den sekundære T790M mutation og den anden har homozygote sletning af

PTEN

gen. De resterende resistente linjer omfattede alle af vildtype linjer og alle linjer har

KRAS

,

BRAF

,

HER2

,

HER4

PIK3CA

mutationer.

Brug univariate test, vi analyserede sammenhængen mellem gefitinib følsomhed og mutationsstatus eller CNGs af de forskellige

EGFR

pathway-gener og fundet en signifikant sammenhæng mellem gefitinib følsomhed med

EGFR

mutation (p = 0,002) og

EGFR

kopi nummer gevinster (p = 0,001). Vi testede den hypotese, at KRAS-mutationer giver iboende modstand mod TKI’er.