PLoS ONE: Den Apoptotisk Effekt af HIF-1α Hæmning Kombineret med glucose plus Insulin behandling på mavekræft under hypoxiske Conditions

Abstrakt

mavekræft vokser under en hypoksisk miljø. HIF-1α vides at spille en vigtig rolle i kontrollen af ​​produktionen af ​​reaktive oxygenspecies (ROS) i mitochondrierne under hypoxiske betingelser. Vi har tidligere etableret HIF-1a Knockdown (kd) celler og kontrol (SC) celler i 58As9 gastrisk cancercellelinie. I denne undersøgelse viste vi, at KD-celler, men ikke SC celler, induceret apoptose under betingelser med hypoksi (1% O

2) på grund af overdreven produktion af ROS. En kvantitativ RT-PCR-analyse viste, at udtrykkene for ti gener, der er involveret i de kontrolmekanismer ROS (herunder Warburg effekten, mitophagy, elektron transportkæden [ETC] modifikation og ROS scavenging), blev reguleret af HIF-1α. Desuden fremme af glukoseoptagelse ved glucose plus insulin (GI) behandling forbedret den apoptotiske virkning, som blev ledsaget af yderligere ROS-produktion i hypoxiske KD celler. En Western blot-analyse viste, at membranøs ekspression af GLUT1 i KD-celler var forhøjet med glucose og /eller insulin behandlinger, hvilket viser, at GI-induceret glukoseoptagelse medieres af øgede translokation af GLUT1 på cellemembranen. Endelig blev anti-tumor effekt af HIF-1α knockdown (KD) plus GI evalueret ved anvendelse af en tumor xenograft model, hvor naturligt eksisterer et hypoksisk miljø. Som følge heraf GI behandling inhiberede kraftigt væksten af ​​KD tumorer hvorved celle apoptose var stærkt induceret i sammenligning med kontrolgruppen behandling. I modsætning hertil blev væksten af ​​tumorer, der udtrykker SC HIF-1α ikke påvirket af GI behandling. Taget sammen antyder resultaterne, at HIF-1α inhibering plus GI kan være en ideel terapi, fordi apoptose som følge af ødelæggelse af ROS homeostase specifikt induceres i gastrisk cancer, der vokser under et hypoksisk miljø, men ikke i normale væv under aerobe betingelser

Henvisning:. Tanaka T, Kitajima Y, Miyake S, Yanagihara K, Hara H, Nishijima-Matsunobu A, et al. (2015) Den Apoptotisk Effekt af HIF-1α Hæmning Kombineret med glucose plus Insulin behandling på mavekræft under hypoxiske betingelser. PLoS ONE 10 (9): e0137257. doi: 10,1371 /journal.pone.0137257

Redaktør: Ester Hammond, University of Oxford, England

Modtaget: April 30, 2015; Accepteret: August 13, 2015; Udgivet: 4 September, 2015

Copyright: © 2015 Tanaka et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

hypoxisk miljø er betydelig i solide kræftsvulster, hvor accelererer deres maligne adfærd [1-4]. Ligesom andre solide tumorer, er gastrisk karcinom kendt for at inddrage store dele af hypoxi inden tumoren [5-7]. Hypoxiske betingelser fremkalde flere biologiske begivenheder såsom angiogenese, lokal invasion, metastatisk spredning, radio- eller kemoresistens og ændret energiomsætning i mange carcinomer, der fører til en dårlig prognose hos patienter [2-4].

transskription faktor hypoxi-inducerbare faktor 1 (HIF-1) er den primære mediator af den cellulære tilpasning til hypoxi [8-10]. HIF-1 er et heterodimert protein bestående af en konstitutivt udtrykte β-underenhed (HIF-1β) og en hypoxi-inducerbar α (HIF-1α) underenhed [8-10]. HIF-1α underenheden nedbrydes gennem ubiquitinproteasomvejen under normoxi. I modsætning hertil under hypoxi, er HIF-1α stabiliseret og dimeriserer med HIF-1β interaktion med CBP /p300, som derefter binder til hypoxi responselementet (HRE) på promotorregionen af ​​hundredvis af målgener [11-16]. Disse tidligere rapporter har ført til anerkendelse af HIF-1α som en central regulator i patogenesen af ​​fast kræft

Reaktive ilt arter (ROS), såsom superoxid anion (O

2

. – ), hydrogenperoxid (H

2O

2), og hydroxylradikal (HO •), består af radikale og ikke-radikale oxygenarter dannet ved delvis reduktion af oxygen. Intracellulær ROS skabes primært i mitochondrierne ved oxidativ phosphorylering (OXPHOS), en proces, der udføres af elektrontransportkæden (ETC) [17]. Når ROS overvælde det cellulære antioxidant forsvarssystem, oxidativ stress opstår. Overdreven oxidativt stress forårsager ROS-medieret skade af nucleinsyrer, proteiner og lipider og fører til celledød [17, 18].

HIF-1α er blevet rapporteret til at styre ROS produktion under hypoxiske forhold gennem flere mekanismer herunder omlægning af energimetabolisme fra OXPHOS til glycolyse, som er benævnt Warburg effekten [19-23], induktion af mitokondriel selektiv autofagi (betegnet mitophagy) [24, 25], ETC modifikation af en underenhed switch i cytochrom c oxidase (COX) [26] og ROS skyllevæsker [27]. I den metaboliske vej af Warburg virkning, HIF-1α først aktiverer transkriptionen af ​​

GLUT1

at øge glucoseoptagelse i celler. Glucose metaboliseres derefter til pyruvat af handlinger glycolytiske enzym medlemmer, som er kendt mål for HIF-1α [28, 29]. Under aerobe betingelser er pyruvat omdannes til acetyl-CoA (AcCoA) ved pyruvat dehydrogenase (PDH) for indrejse i tricarboxylsyre (TCA) cyklus. Omvendt i cancerceller udsat for hypoxi, er pyruvat shuntes bort fra mitokondrier, hvorved HIF-1α opregulerer ekspressionen af ​​PDK1 at inhibere PDH-aktivitet. Derefter IdhA alternativt konverterer pyruvat til lactat og MCT4 transporterer lactat ud af cellen. Disse gener er også reguleret af HIF-1α [16, 30, 31]. Hypoxi inducerer mitophagy at forhindre overdreven ROS produktion, som de beskadigede mitokondrier elimineres via lysosomale fordøjelse [24, 25]. Nyere undersøgelser har vist, at HIF-1α aktiverer transskriptioner af generne, der koder BNIP3 og BNIP3L, afgørende faktorer i mitophagy proces [32]. En anden undersøgelse rapporterede, at HIF-1α regulerer COX4 subunit skift ved at aktivere transkription af ETC-relaterede gener COX4-2 og LON, en mitokondrie protease, der er nødvendig for COX4-1 nedbrydning under hypoxi [26]. Den COX4 subunit switch blev rapporteret som et vigtigt skridt i ROS homeostase, på grund af sin rolle i at optimere effektiviteten af ​​respiration under hypoxi [26]. ROS scavenger MnSOD er ​​kendt for at konvertere superoxidradikaler til hydrogenperoxid. En tidligere undersøgelse har rapporteret, at MnSOD er ​​opreguleret under hypoxi, selv om denne opregulering medieres af HIF-1α er endnu ikke blevet vist [27]. For nylig, en anden rapport demonstrerede den interessante fund, at de embryonale fibroblaster (MEF’er) af hypoxisk HIF-1α-null mus døde på grund af overskydende ROS produktion, mens MEF’er blev reddet ved behandling med antioxidanten N acetyl-L-cystein (NAC) [ ,,,0],33]. Tilsammen disse rapporter indikerer, at HIF-1α spiller en central rolle i organiseringen af ​​mitokondrie ROS produktion i levende celler under hypoxi.

I denne undersøgelse, vi havde til formål at etablere en terapeutisk model viser, at hypoxi-induceret apoptose via overproduktion af ROS kan indføres til HIF-1α deficiente gastriske cancerceller. Vi oprindeligt afgjort, om hypoxi inducerer celledød ved den overdrevne ROS produktion i HIF-1α knockdown (KD) celler. Derefter vi rettet den hypotese, at indførelsen af ​​høje glucose niveauer ved behandlingen af ​​KD celler med insulin kan forstærke den apoptotiske effekt. Endelig giver en tumor xenograft model, foreslog vi, at HIF-1α inhibering kombineret med glucose plus insulin (GI) behandling kan være en potentiel behandling for mavekræft.

Materialer og metoder Salg

Cellekultur betingelser og reagenser

mavekræft cellelinje 58As9 blev venligst stillet til rådighed af Dr. K. Yanagihara (National cancer center Hospital East, Chiba, Japan) på december i 2009. 58As9 cellelinje blev oprindeligt etableret fra scirrhous gastrisk karcinom-afledt cellelinje HSC-58 [34]. Denne cellelinje blev derefter yderligere bekræftet den 24. februar

th, 2015 af JCRB Cell Bank (Osaka, Japan). En anden mavekræft cellelinje, MKN74 blev købt fra Cell Bank, Riken Bio Resource Center (Tsukuba, Japan). I den foreliggende undersøgelse, brugte vi stabile HIF-1α Knockdown celler KD og 74-KD, som blev oprettet ved transfektion af siRNA-plasmidet huser RNAi sekvenser i de 58As9 og MKN74 celler som tidligere [7, 35] beskrevet. Sekvenserne af siRNA rettet mod HIF-1α og kontrol scrambled siRNA blev udformet som følger: HIF-1α siRNA for KD eller 74-KD (5′-CCA CAT TCA CGT ATA TGA T-3 ‘) og scramble siRNA for SC eller 74- SC (5’-TCT TAA TCG CGT ATA AGG C-3 ‘). Cellerne blev dyrket i RPMI-1640 medium (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS) og 100 ug /ml kanamycin (Meiji, Tokyo, Japan ) og inkuberet ved 37 ° C i en fugtig atmosfære. Cellerne blev dyrket under enten normoxiske forhold (20% O

2 og 5% CO

2 i luft) eller hypoxiske betingelser (1% O

2, 5% CO

2 og 94% N

2) i et hypoxisk kammer (ASTEC, Fukuoka, Japan) og derefter behandlet med NAC (Sigma-Aldrich) og insulin (Wako, Osaka, Japan) ved en endelig koncentration på 5 mM og 500 ng /ml. Koncentrationen af ​​den høje glucose-medium blev fremstillet ved tilsætning af 45% D – (+) – Glucose opløsning (Sigma-Aldrich), og den endelige koncentration blev bestemt til at være 10 g /l, hvilket er 5 gange højere end i normale RPMI-1640 medium.

cellelevedygtighed assay

cellelevedygtighed under normoxi eller hypoksi blev bedømt ved trypanblåt udelukkelse assays. Til vurdering af lægemiddelbehandling effekter, herunder NAC, høj glucose og /eller insulin på cellelevedygtigheden, 1 x 10

5-celler podedes på 6 cm dyrkningsskåle. Cellerne blev behandlet med forskellige lægemidler i de angivne koncentrationer og dyrkes under normoxi eller hypoksi i 24 timer til 96 timer. Ved slutningen af ​​inkubationen blev de flydende og adhærente celler opsamlet og pelleteret ved centrifugering (3000 rpm, 5 min). Cellerne blev resuspenderet i 90 pi af komplet medium, blandet med 10 pi 0,4% trypan blå opløsning og talt ved anvendelse af et hæmocytometer under et mikroskop. Celledød blev bestemt som forholdet mellem antallet af døde celler /det samlede celleantal. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt og uafhængigt gentages mindst tre gange.

Western blot-analyse

Helcellelysater fra dyrkede celler og xenograft-tumorer i mus blev fremstillet under anvendelse lysepuffer bestående af 150 mmol /l NaCl, 50 mmol /L Tris-HCI (pH 7,6), 0,5% Triton X-100, og en proteasehæmmer cocktail mix (Roche, Mannheim, Tyskland). Cellelysater fra cytosoliske fraktion og celle membranfraktion blev fremstillet under anvendelse af en cytochrom c Releasing Apoptose Assay Kit og et plasmamembranprotein Extraction Kit (BioVision Inc., Milpitas, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Western blot-analyse blev udført som tidligere beskrevet [7]. Alikvoter indeholdende 30 ug protein blev elektroforetisk adskilt i 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) og overført til en Amersham Hybond-ECL-membran (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) i en overførselsbuffer. Efter blokering med 5% hud mælk i 30 minutter blev membranen inkuberet med primære antistoffer natten over ved 4 ° C. De følgende primære antistoffer blev anvendt: anti-HIF-1α (1: 1000 fortynding, Abcam, Cambridge, UK), anti-spaltet caspase 3 (1: 1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti-cytochrom c (1 : 500 fortynding, BioVision), anti-GLUT1 (1: 100.000 fortynding Abcam), og anti-β-actin (1: 10.000 fortynding; Sigma-Aldrich, Inc.). Efter inkubering med de tilsvarende sekundære antistoffer, blev de signaler udviklet ved anvendelse af et Amersham ECL Plus Western Blotting Detection System (GE Healthcare).

Påvisning af intracellulær ROS ved flowcytometri Salg

Intracellulær ROS værdier blev evalueret ved anvendelse af en Total ROS Detection Kit (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY, USA) ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt, KD, SC, blev celler dyrket under betingelser med enten normoxi eller hypoksi med eller uden medicinsk behandling (dvs. NAC, høj glucose og /eller insulin) i 24 timer, 48 timer og 72 timer. 74-KD og 74-SC blev også dyrket under betingelser med enten normoxi eller hypoksi i 24, 48 og 72 timer uden nogen lægemiddelbehandling. Cellerne blev vasket og resuspenderet i ROS sporing løsning. ROS fluorescens blev detekteret ved FACS Calibur flow cytometer (Becton-Dickinson, San Jose, CA) og analyseret af Cell Quest-software program. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt. Den gennemsnitlige fluorescens af ROS-produktion blev bestemt automatisk og præsenteret som GEO betyde.

Total RNA-ekstraktion og kvantitativ RT-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra cellelinier under anvendelse af et Isogen RNA-ekstraktion kit ( Nippon Gene, Osaka, Japan). Et ug RNA blev omdannet til cDNA under anvendelse af en ReverTra Ace (Toyobo) revers transkriptionsreaktion kit. CDNA’et blev anvendt som en skabelon for PCR. A real-time kvantitativ RT-PCR (RT-qPCR) blev udført ved hjælp af Light Cycler instrumentsystem (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland) ved anvendelse af en lys-Cycler-FastStart DNA Master SYBR Green I kittet (Roche). De ti gener, der blev analyseret ved RT-qPCR var som følger: glukose transportør 1 (

GLUT1

), aldolase C (

ALDOC

), pyruvat dehydrogenase kinase 1 (

PDK1

), lactatdehydrogenase A (

IdhA

) og monocarboxylat transportør 4 (

MCT4

), Bcl-2 /adenovirus EIB 19-kDa interagerende protein 3 (

BNIP3

), BINP3 ligesom (

BNIP3L

), mitokondrie mangan superoxiddismutase (

MnSOD

), et mitokondrie protease

LON

og cytochrom oxidase subunit 4-2 (

Cox4 – 2

). Primerne blev designet i henhold til de rapporterede cDNA-sekvenser (GenBank, Bethesda, MD) (tabel 1). Efter udførelsen af ​​en denatureringstrin ved 95 ° C i 3 min, blev PCR-amplifikation udført med 50 cyklusser af 15 sekunders denaturering ved 95 ° C, 5 s annealing ved 60 ° C og 10 sekunders forlængelse ved 72 ° C. De kvantitative værdier blev normaliseret til β-actin (

ACTB

) ekspression (tabel 1). Alle eksperimenter blev udført tredobbelt og uafhængigt gentages mindst tre gange.

Glucoseoptagelse assay

glucoseoptagelse i dyrkede celler blev bestemt under anvendelse af en 2-deoxyglucose (2DG) Optagelse Måling Kit (COSMO BIO Co. Ltd., Tokyo, Japan). Kort beskrevet blev cellerne dyrket under et serum-udsultet tilstand i 6 timer, efterfulgt af yderligere dyrkning i 18 timer i regelmæssig medium suppleret med 10% FBS. Cellerne blev inkuberet i 24 timer under normoxi eller hypoksi. Derefter blev cellerne behandlet med eller uden 500 ng /ml insulin til 18 min. Endelig blev cellerne behandlet med 2DG i 20 minutter og udsat for måling af 2DG-optagelse i overensstemmelse med producentens anvisninger. Alle forsøg blev udført i tre eksemplarer og middelværdierne blev beregnet.

Dyreforsøg

De dyr protokoller blev godkendt af Institutional Animal Care og Brug udvalg i Saga University (protokol 24-008-0 ) og var i overensstemmelse med de ANKOMMER retningslinjer for anvendelse af dyr til forskning. Kvindelige 4 uger gamle athymiske BALB /cA Jcl mus (nu /nu) blev opnået fra Nihon Crea Co. (Osaka, Japan). Dyr blev holdt under specifikke patogen-fri betingelser. De fik sterilt mad og autoklaveret vand med en 12-timers lys-mørke cyklus. Mus blev akklimatiseret til miljøet i 7 dage før forsøgene. KD eller SC-celler (3 x 10

6) injiceret subkutant i ryggen af ​​musene (n = 9 for hver cellelinie). Ti dage efter den subkutane inokulation, xenotransplantaterne af begge celler blev palpable. Ni mus med KD eller SC xenografter blev derefter inddelt i tre grupper til behandling af glucose (8 g /kg /dag, Sigma), glucose plus insulin (GI) (1 enhed pr 3 g glucose /dag, Wako) eller phosphatpufret saltvand (PBS) som kontrol behandling. Hvert af disse lægemidler blev administreret intraperitonealt i tre mus (seks tumorer alt) hver 24 h fra dag 1 til dag 11. I denne periode blev tumorerne målt i 2 vinkelrette dimensioner med en passer hver fjerde dag. Tumoren størrelse (

T

) blev evalueret som det maksimale cut-området og bestemmes af følgende formel:

T

= π /4 ×

en

×

b

, hvor

en

er den kortere akse (mm) og

b

er den længere akse (mm). Musene blev aflivet 12 dage efter, at lægemiddelbehandlinger og tumorer blev høstet for den efterfølgende eksperiment.

kløvet caspase 3 immunhistokemi og vurderingen af ​​apoptose

in vivo

frosne tumorer blev indlejret med Tissue-Tek oktober Forbindelse. Disse blokke blev skåret i 4-um-tykke snit. For antigen hentning blev objektglassene opvarmes i Tris-EDTA-buffer (pH 9,0) i en mikrobølgeovn (500 watt) i 5 minutter. Snittene blev derefter inkuberet med anti-spaltet caspase 3 (1: 200, Cell Signaling Technology) i 2 timer ved stuetemperatur, og DAKO Envision + System (Dako Cytomation, Glostrup, Danmark) blev anvendt som det sekundære antistof. Signalerne blev visualiseret med diaminobenzidintetrahydrochlorid (0,02%). Til vurdering af apoptose, kløvet caspase 3-positive celler med brune farvede kerner blev talt i fem områder ved 400x forstørrelse og middelværdien blev beregnet. Den immunhistokemiske udtryk for kløvet caspase 3 blev blindt gennemgået og vurderet af en certificeret patolog (Dr. AN).

Statistisk analyse

Data blev analyseret ved en ANOVA hjælp af Prism 5 softwarepakke ( GraphPad Software, La Jolla, CA). Til sammenligning mellem to grupper, blev forskellene i middelværdierne evalueret af Students

t-

test og Mann-Whitney

U

test. Til sammenligning mellem tre eller flere grupper, blev Bonferroni post-hoc test udført for en envejs ANOVA. En værdi på p 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle data er udtrykt som middel ± SEM.

Resultater

HIF-1α knockdown induceret apoptotisk celledød under hypoxi i 58As9 gastrisk kræftceller

HIF-1α udtryk var vurderet i stabil HIF-1α knockdown (kd) celler og SC (som kontrol-cellelinie) celler. En Western blot-analyse viste, at HIF-1α ekspression blev fuldstændig slået ned i KD-celler efter 8 timer under hypoxi sammenlignet med SC-celler (Fig 1A). Cellen dødeligheden blev estimeret efter 24 timer til 96 timer under normoxi og hypoxi. Dødeligheden var højere i KD celler end i SC celler under normoxi for 24 til 96 timer, men forskellene var ikke statistisk signifikant (figur 1B). I modsætning hertil blev cellen dødeligheden i KD celler stærkt forøget under hypoxi og væsentligt højere end hos SC celler på 72 og 96 timer (Fig 1C). Western blot analyse viste, at spaltet caspase 3 samt cytosolisk cytochrom c blev forhøjet i KD-celler, men ikke i SC celler under hypoxi i 8 timer (Fig 1D og 1E). Hypoxi-induceret celledød blev også bekræftet i andre HIF-1α Knockdown gastriske cancerceller 74-KD (S1 Fig). Disse resultater indikerede, at hypoksi kraftigt induceret apoptose i HIF-1α knockdown cellelinie KD.

(A) Western blot-analyse af HIF-1α ekspression blev udført i SC eller KD celler under normoxi (20% O

2) og hypoxi (1% O

2). Den interne markør β-actin (β-act) blev ligeligt udtrykt i alle celler. (B), (C) Cellen dødeligheden blev vurderet ved anvendelse SC celler eller KD celler under normoxi (B) og hypoxi (C) i 0 timer til 96 timer. De dødeligheden blev sammenlignet mellem SC celler og KD celler. n.s .: ikke signifikant, *: p 0,05, **: p 0,01, ***: p 0,001. (D), (E) en Western blot analyse af (D) spaltet caspase 3 og (E) cytosol cytochrom c i SC eller KD celler under normoxi og hypoxi i 8 timer.

latrintømning ROS vendt den apoptotiske fænotype observeret i HIF-1α knockdown celler

den intracellulære ROS niveau blev beregnet og sammenlignet mellem KD og SC-celler. ROS niveau steg på en tidsafhængig måde i KD celler under hypoxi, mens niveauet svagt var forhøjet i SC-celler (fig 2A). ROS niveau i KD-celler var signifikant højere under hypoksi i 24 til 72 timer end i SC-celler (fig 2A). De ROS niveauer blev også vurderet i 74-SC celler og 74-KD-celler (S2 Fig). De ROS niveauer adskilte sig ikke mellem de 74-SC og 74-KD celler under normoxi (S2A Fig). Men under hypoxi, ROS niveauer signifikant højere i de 74-KD-celler end i de 74-SC-celler ved 48 til 72 timer (S2B Fig). NAC, en antioxidant, faldt betydeligt ROS niveau i KD-celler under hypoxi i 48 til 72 timer (Fig 2B). For at vurdere, om ROS produktion inducerer hypoxi-induceret celledød i KD celler, blev cellen dødeligheden med eller uden NAC evalueret i KD celler under normoxi og hypoxi. NAC behandling påvirkede ikke hastigheden af ​​celledød i KD cellerne under normoxi (fig 2C). I modsætning hertil NAC behandling reducerede signifikant celledød i KD celler under hypoxi i 48 til 96 timer (Fig 2D).

(A) De ROS-niveauer blev estimeret ved anvendelse af KD og SC-celler under hypoxi til 0 h til 72 h. (B) Den ROS niveau blev analyseret i hypoxiske KD-celler med eller uden 5 mM NAC behandling i 0 til 72 timer. (C) Cellen dødeligheden blev vurderet i KD-celler med eller uden NAC under normoxi (C) og hypoxi (D) til 0 timer til 96 timer. KD-NAC (-): NAC-ubehandlede KD celler, KD-NAC (+): NAC-behandlede KD-celler. *: P 0,05, ***: p. 0,001

HIF-1α knockdown reducerede hypoxiske induktion af forskellige gener involveret i kontrollen af ​​ROS produktion

For at undersøge hypoxi-induceret ROS ophobning i HIF-1α knockdown celler, mRNA ekspressionen af ​​ti gener, der er involveret i ROS kontrolmekanisme (

GLUT1

,

ALDOC

,

PDK1

,

IdhA

,

MCT4

,

BNIP3

,

BNIP3L

,

LON

,

COX4-2

og

MnSOD

) blev analyseret under anvendelse af et RT-qPCR. Den hypoxiske induktion af genekspressionen blev vurderet af gange induktion (FI). Den finansielle formidlere i de ti gener var signifikant lavere i KD celler end i SC celler (Fig 3). Endvidere, når begrænset til hypoxiske betingelser, ekspressionsniveauerne af alle ti gener var signifikant lavere i KD celler end SC-celler. Disse resultater viste, at HIF-1α knockdown markant nedsat den hypoxi-induceret ekspression af de ti gener. På den anden side, under normoxi, ekspressionen af ​​PDK1 og BNIP3L var signifikant lavere i KD-celler end i SC-celler. Omvendt ekspressionsniveauerne af LON og COX4-2 var signifikant højere i KD cellerne i forhold til de SC celler.

mRNA udtryk for GLUT1, ALDOC, PDK1, IdhA, MCT4, BNIP3, BNIP3L, LON , COX4-2 og MnSOD blev kvantitativt vurderet i henhold normoxi (sorte søjler) og hypoxi (hvide søjler) i 24 timer. Ekspressionsniveauerne er vist i grafen. Den gange induktion (FI) blev estimeret som udtryk forholdet hypoxi /normoxi og præsenteres på bunden af ​​graferne. Ekspressionsniveauerne af ti gener i KD-celler blev sammenlignet med ekspressionsniveauer i SC-celler under både normoxi og hypoxi. ns: ikke signifikant, *: p 0,05, **: p 0,01, ***: p. 0,001

Glukose og insulin behandlinger forbedret apoptotisk celledød i KD celler under hypoxi

Derefter undersøgte vi, om fremme af glukoseoptagelse påvirker hypoxi-induceret apoptose i KD-celler. Cellelevedygtigheden blev vurderet i KD og SC-celler efter behandlinger med kontrol (PBS), høj glucose, insulin eller høj glucose plus insulin (GI). Hypoxi-induceret celledød blev anslået af FI. Cellen dødeligheden under hypoxi blev sammenlignet mellem kontrolgruppen behandling og de andre behandlinger i begge cellelinier (Fig 4). I SC celler, blev der ikke observeret signifikante forskelle i FI og celledød sats under hypoxi blandt nogen af ​​de behandlinger (Fig 4A). I KD celler blev FI steg betydeligt med iltsvind i alle behandlinger. Især GI behandling gav det højeste FI blandt alle behandlinger (fig 4B). Cellen dødeligheden under hypoksi var signifikant højere i GI-behandlede celler end i kontrolgruppen-behandlede celler (fig 4B). For at undersøge om de behandlinger påvirkede ROS produktion blev ROS niveau analyseres i de KD celler. I forhold til normoksiske betingelser blev ROS niveau væsentligt forhøjet i KD celler under hypoxiske betingelser (figur 4C). Under hypoxi blev ROS niveau i KD-celler steg betydeligt med høj glucose, insulin og GI behandling i forhold til kontrol behandling. Det højeste ROS niveau positivt observeret i GI-behandlede KD celler (Fig 4C).

FI af cellen dødeligheden blev bestemt som død forholdet mellem hypoxi /normoxi. Cellen dødeligheden i PBS-behandlede (kontrol), høj glucose og /eller insulinbehandlede SC-celler (A) og KD-celler (B) er plottet. FI værdi præsenteres på bunden. Cellen dødeligheden under hypoxiske betingelser i kontrolgruppen behandling blev sammenlignet med den i høj glucose, insulin og GI behandling. (C) Den intracellulære ROS niveau i kontrol-behandlede, høj glucose og /eller insulinbehandlede KD celler er plottet på grafen. ROS-niveauer i KD celler behandlet med kontrolbehandlingen blev sammenlignet mellem normoxi (sorte søjler) og hypoxi (hvide bjælker). Den ROS niveau i de hypoxiske KD celler med kontrol behandling blev yderligere sammenlignet med med høj glukose, insulin og GI behandling. ns: ikke signifikant, *: p 0,05, **: p 0,01, ***: p. 0,001

Vurdering af glukoseoptagelse efter insulinbehandling

glucoseoptagelse evne blev analyseret i en 2DG inkorporering undersøgelse. I SC og KD celler under normoxi blev 2DG inkorporering signifikant forhøjede ved 2DG behandling i forhold til ubehandlede celler. Den 2DG inkorporering blev yderligere forøget med den supplerende insulinbehandling i begge celler (Fig 5A). I forhold til normoxi, hypoxi stærkere stimulerede 2DG-optagelse i SC-celler, med eller uden insulin (Fig 5B). Lignende resultater blev observeret i KD cellerne under hypoxi (Fig 5B). Men under hypoxi, blev mindre 2DG inkorporeret i KD-celler end i SC-celler, med eller uden yderligere insulinbehandling (Fig 5B). For at vurdere den mekanisme af insulinafhængig glucoseoptagelse blev membranøs ekspression af GLUT1 analyseret i KD celler under normoxi og hypoxi. Under normoxi blev membranøs GLUT1 ekspression forhøjet med høj glucose og /eller insulin behandling i forhold til, at med ingen behandling (Fig 5C). I forhold til den observeret under normoxi, under hypoxi, blev membranøs GLUT1 udtryk forhøjet i alle behandlinger. Endvidere blev ekspressionen forøget med høj glucose og /eller insulinbehandling, sammenlignet med ingen behandling (Fig 5C). Især blev den membranøs GLUT1 udtryk stærkest forøget med høj glucose og insulin (GI) behandling i de hypoxiske KD-celler (Fig 5C). På den anden side er ekspressionen af ​​en anden GLUT familie, GLUT3 blev svagt observeret i KD-celler, og dette fund blev ikke ændret blandt disse forskellige behandlinger (data ikke vist). I denne undersøgelse blev GLUT2 og GLUT4 ikke udtrykkes i KD celler.

(A), (B) Den 2DG-optagelse niveau i SC-celler eller KD celler med eller uden insulinbehandling blev evalueret under normoxi (A) og hypoxi (B). (C) Den Western blot analyse af membranøs GLUT1 (54 kDa) udtryk i KD celler med kontrol, høj glucose og /eller insulin behandlinger under både normoxi og hypoxi som angivet. ***: P. 0,001

HIF-1α knockdown plus GI behandling stærkt undertrykte væksten af ​​tumorxenoplantater i nøgne mus

Endelig har vi bestemt den

in vivo

virkning af GI behandling på KD og SC tumorxenoplantater. Fig 6A viser den eksperimentelle design af xenotransplantat musemodel. Ti dage efter den subkutane inokulation af SC eller KD-celler, blev xenotransplantater dyrket på ryggen af ​​nøgne mus. På dette tidspunkt, en Western blot-analyse bekræftede HIF-1α ekspression i SC tumorer, men ikke i KD tumorer (Fig 6B). Derefter tre lægemidler bestående af PBS, glucose eller GI, intraperitonealt injiceret i nøgne mus der bærer et sc eller KD tumor (dagligt fra dag 1 til dag 11). De repræsentative billeder af tumorbærende mus, som blev behandlet med PBS (SC-PBS og KD-PBS), glucose (SC-Glucose og KD-glucose) eller GI (SC-GI og KD-GI) er vist i Fig 6C . KD-Glukose og KD-GI tumorer viste sig at være mindre end de andre tumorer. Fig 6D viste vækstkurven af ​​de 6 tumorer. Størrelserne af KD-Glukose og KD-GI tumorer var betydeligt mindre end den KD-PBS tumor på dag 12. KD-GI tumor var den mindste. På den anden side, i SC mus, var der ingen signifikant forskel i størrelse af SC-PBS, SC-Glucose og SC-GI tumorer (Fig 6D). En immunhistokemisk analyse af spaltet caspase 3 blev udført for at vurdere apoptose induceret af glucose eller GI behandling. Den positive udtryk for kløvet caspase3 blev hyppigt observeret i KD-Glukose og KD-GI tumorer (Fig 6E). Men alle de KD tumorer udviste en vis grad af spaltet caspase 3 (fig 6F). I modsætning hertil var der ingen signifikant forskel i ekspression af den spaltede caspase 3 blandt SC-PBS, SC-Glucose og SC-GI tumorer. I KD tumorer, den positive ekspression af spaltet caspase3 var signifikant højere i KD-PBS tumor end i SC-PBS tumor. Endvidere ekspressionen af ​​spaltede caspase3 var signifikant højere i KD-glucose eller KD-GI tumorer end i KD-PBS tumor. Den højeste udtryk blev observeret i KD-GI tumor.

(A) Den eksperimentelle tidsplan for glukose (G) eller glucose plus insulin (GI) behandling på tumorxenoplantater. Den indledende intraperitoneal (i.p.) injektion med kontrol PBS eller glucose, GI er angivet med den tomme trekant. De i.p. injektioner er angivet med pile. Tumorerne høstet på dag 12 er angivet med det netformede trekant. (B) Western blot-analyse af HIF-1α i xenotransplantater af sc-celler (SC tumor) og KD celler (KD tumor). (C) Repræsentative billeder af SC eller KD tumorer behandlet med PBS, glucose eller GI. De behandlede tumorer blev betegnet som SC-PBS, SC-Glucose, SC-GI, KD-PBS, KD-Glucose og KD-GI. (D) størrelsen af ​​de 6 tumorer på dag 1 til dag 12 blev plottet på grafen som angivet.