PLoS ONE: Genetisk og immunhistokemisk ekspression af Integriner ITGAV, ITGA6, og ITGA3 som prognostiske faktor for tarmkræft: Modeller for Global og sygdomsfri Survival

Abstrakt

Målsætning

For at vurdere forholdet mellem udtryk profiler af 84 ekstracellulære matrix (ECM) gener og prognosen for patienter med colorectal cancer (CRC).

Metoder

Denne retrospektivt studie inkluderet 114 patienter med stadie i-IV CRC som gennemgik primær tumor resektion. Kvantitative real-time PCR og immunhistokemi assays blev udført ved anvendelse af primære tumorprøver. Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev også genereret til at identificere forskelle i den globale overlevelse (GS) og sygdomsfri overlevelse (DFS) for hypo- eller hyperekspression status for hver markør. Den log-rank test blev anvendt til at kontrollere, om forskellene var signifikante. Trinvis Cox regressionsmodeller blev også brugt til at identificere de risikofaktorer forbundet med GS og DFS i en multivariat tilstand og derefter blev brugt til at score risikoen for død i forbindelse med hver markør, enten selvstændigt eller i forening.

Resultater

i de univariate analyser, betydelige forskelle i GS i forhold til udtrykket profiler af ITGAV (p = 0,001), ITGA3 (p = 0,002), ITGA6 (p = 0,001), SPARC (p = 0,036), MMP9 (p = 0,034), og MMP16 (p = 0,038) blev observeret. For DFS, blev der observeret signifikante forskelle i forbindelse med ITGAV (p = 0,004) og ITGA3 (p = 0,001). Men kun de ITGAV og ITGA6 genmarkører for GS (hazard ratio (HR) = 3.209, 95% konfidensinterval (CI) = 1,412-7,293, p = 0,005 og HR = 3,105, 95% CI = 1,367-7,055, p = 0,007, henholdsvis), og ITGA3 for DFS (HR = 3,806, 95% CI = 1,573-9,209, p = 0,003), forblev i de sidste Cox regressionsmodeller. Et scoresystem blev udviklet for at vurdere risikoen for patientens død baseret på antallet af markører for komponenterne i den endelige GS model. Snesevis af 0, 1, eller 2 blev forbundet med følgende gennemsnitlige overlevelsesrater [CI]: 47,162 [44.613-49.711] 39,717 [35.471-43.964] 30.197 [24,030-36,327], henholdsvis

Konklusioner.

Multivariate matematiske modeller viste en sammenhæng mellem hyperekspression af ITGAV og ITGA6 integriner og GS, og også mellem ITGA3 integrin og DFS, hos patienter med kolorektale tumorer. En risiko scoringssystem baseret på detekteret hyperekspression af 0, 1, eller 2 markører (f.eks ITGAV og /eller ITGA6) viste sig også at præcist korrelerer med GS kurver genereret for den foreliggende kohorte

Henvisning:. Linhares MM, Affonso RJ Jr, Viana LdS, Silva SRM, Denadai MVA, de Toledo SRC, et al. (2015) Genetisk og immunhistokemisk ekspression af Integriner ITGAV, ITGA6, og ITGA3 som prognostiske faktor for tarmkræft: Modeller for Global og sygdomsfri overlevelse. PLoS ONE 10 (12): e0144333. doi: 10,1371 /journal.pone.0144333

Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, UNITED STATES

Modtaget: 26 august, 2015; Accepteret: 16 oktober 2015; Udgivet: 16. december 2015

Copyright: © 2015 Linhares et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: På grund af etiske restriktioner, er tilgængelige fra Research etiske komitéer i Federal University of São Paulo og Fundação Pio XII, Barretos, for forskere, der opfylder kriterierne for adgang til fortrolige data data

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af CAPES (Koordinering til Forbedring af højere niveau -eller uddannelses- Personale – brasilianske regering) og Fundação Pio XII, Barretos – Brasilien

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Forkortelser: CRC, kolorektal cancer; GS, Global Survival; DFS, sygdomsfri overlevelse; ECM, ekstracellulær matrix; ITGAV, Integrin Alpha V; ITGA3C, Integrin Alpha 3; ITGA6, Integrin Alpha 6; MMP1, Matrix metallopeptidase 1; MMP16, Matrix metallopeptidase 16; COL6A2, type VI Collagen gen; THBS1, thrombospondin 1; VCAM-1, vaskulært celleadhæsionsmolekyle 1; SPARC, SPARC-gen; EGFR, epidermal vækstfaktor receptor; VEGF, karendotelvækstfaktor

Introduktion

Globalt kolorektal carcinom (CRC) er en af ​​de mest almindelige maligne tumorer diagnosticeret og er den tredje mest almindelige dødsårsag ved neoplasma i Vesten. Forekomsten af ​​CRC er i øjeblikket større end 1.200.000 tilfælde /år, og det skønnes, at næsten 600.000 dødsfald er relateret til denne sygdom. [1] I løbet af de sidste tyve år en bedre forståelse af de risikofaktorer for udvikling af denne type neoplasma er blevet vundet, og dette er blevet ledsaget af forbedret forebyggende foranstaltninger og udvikling af nye lægemidler og kirurgiske teknikker. Som følge heraf har forbedret dødelighed relateret til CRC blevet observeret. [2,3]

CRC kan behandles, og i de fleste tilfælde, er helbredes, når det er påvist i sin vorden. [2] Men den gennemsnitlige globale fem års overlevelse for alle stadier er 55% i udviklede lande, og 40% i udviklingslandene. Desuden tumorer diagnosticeret i de indledende faser stadig udgør en risiko for systemisk recidiv. [2,3]

Til dato, histopatologiske evaluering er grundlaget for en diagnose, klassificering og sortering af CRC tumorer. Karakteren af ​​tumor penetration gennem tarmvæggen (T fase), tilstedeværelsen og antallet af lymfeknuder er involveret (N fase), og tilstedeværelsen af ​​fjernmetastaser (M etape) er de vigtigste prognostiske faktorer, og disse er også vigtige faktorer, når behandlingsstrategi. Andre faktorer, der kan bidrage til en dårlig prognose er tilstedeværelsen af ​​udifferentierede tumorer, mucinøse subtype tumorer, tilstedeværelsen af ​​intestinal obstruktion og /eller perforering på tidspunktet for diagnosen, og tilstedeværelsen af ​​lymphovascular invasion. [4] Fremskridt i vores forståelse af CRC biologi, kombineret med en bedre forståelse af risikoen for tilbagefald og studier af patientens overlevelseskurver, har forbedret nøjagtigheden af ​​patientens klassifikation. [4-7]

CRC spredes via direkte invasion, generelt gennem lymfeknuder kanaler eller hæmatogene ruter. Dog er de intra- og intercellulære signalveje, der er ansvarlige for spredning og overlevelse af neoplastiske celler ikke fuldt karakteriseret. [8-10] CRC synes at påvirke forskellige veje, der regulerer cellevækst. Tumor vækst og invasion påvirker også mekanismer angiogenese, epiteliale vækstfaktorer, apoptose, og remodellering af den ekstracellulære matrix (ECM). [11]

Nylige undersøgelser har vist, at en af ​​de mekanismer, der formidler tumorinvasion og metastatisk spredning involverer nedbrydning af ECM og basalmembranen, hvilket antyder, at interaktioner mellem værten og en tumor forbedrer betingelserne for formidling tumor. [12,13] The ECM består af et komplekst netværk af makromolekyler, der udskilles af celler og de indtager det intercellulære rum, som omfatter basalmembranen, blodet matrix, og den forbindende matrix. Disse makromolekyler omfatter forskellige typer kollagener, elastiske systemer molekyler, strukturelle glycoproteiner, glycosaminoglykaner og proteoglycaner. [14] Thrombospondin, vaskulær celleadhæsionsmolekyle, 6A2 kollagen, og metalloproteinaser har vist sig at være direkte involveret i at mediere celleproliferation, cellemigration, og nedbrydning af ECM. [15-17] Samlet set disse makromolekyler bidrager til modulation af ECM, der opstår under både fysiologiske og patologiske processer.

Undersøgelser af den kaskade af begivenheder, der er involveret i locoregional invasion og metastase af CRC forblive en stor videnskabelig udfordring. Resultaterne af forskellige undersøgelser har antydet, at isoleret set THBS1, VCAM-1, COL6A2, MMP1 og MMP16 gener og deres respektive molekyler af ekspression-thrombospondin, vaskulært celleadhæsionsmolekyle, 6A2 collagen og metalloproteinaser-er involveret i modulering af ECM under processen med CRC carcinogenese. [11,15,18] Litteraturen indeholder også en betydelig mængde bevismateriale med hensyn til genetiske ændringer, der er impliceret i den hurtige progression af CRC fra de indledende faser til sine fremskredne stadier. Det antages, at denne proces er indledt af unormale signalering, der aktiverer gener at påvirke celle udbredelse og metastase af kræft. [19,20]

identifikation af molekyler, der undergår strukturelle ændringer og deres forbindelse med kliniske og patologiske stadier kunne afklare de mekanismer, der er involveret i carcinogenese. Endvidere ved at anerkende de grupper af gener involveret, er der potentiale for disse gener til at tjene som markører for berørte patienter og prognose. I denne undersøgelse blev ECM gener i tumorvæv af patienter med colorectal adenocarcinom evalueres for at identificere potentielle sammenhænge med data TNM klassificering og overlevelse.

Formålet med denne undersøgelse er at identificere en mulig sammenhæng mellem ekspression af ECM gener i tumorvæv fra patienter med CRC og parametrene for global overlevelse (GS) og sygdomsfri overlevelse (DFS), samt at bygge en prædiktiv matematisk model af patientens overlevelse baseret på hypo- eller hyperekspression af disse gener.

Materialer og metoder

Patienter

Denne undersøgelse blev gennemgået og godkendt af de videnskabsetiske komitéer i Federal University of São Paulo (protokol Number # 2189/98) og Fundação Pio XII, Barretos (protokol Number # 178/2008), i overensstemmelse med brasilianske og internationale regler for forskning med menneskelige forsøgspersoner. Alle patienter underskrev en skriftligt informeret samtykke om tilladelse til brug af biologisk materiale med henblik på forskning.

Patienter af begge køn med synkron kolon og endetarmskræft og der var ældre end 18 år blev inkluderet i denne undersøgelse. Omvendt patienter, der fik neoadjuverende behandling (fx kemoterapi eller strålebehandling), patienter uden en primær CRC site, patienter med tidligere eller nuværende diagnose af en anden primær malignitet i hvilket som helst sted i den anden end ikke-melanom hudkræft krop, patienter med

in situ

cervixcancer, og patienter med en kendt historie af familiær CRC blev udelukket. CRC patienter havde tumorprøver opsamlet, og prøverne med de højeste stadier blev udvalgt til kryopræservering. Tilsvarende paraffinblokke var til rådighed for yderligere histopatologiske analyse. Kromosomal (CIN) og mikrosatellit instabilitet (MSI) status for disse prøver blev ikke vurderet.

genanalyse

To patologer fra Institut for Patologisk Anatomi uafhængigt revideret de anatomopathological data fra alle udvalgte tilfælde. I alt 114 CRC tilfælde undergik ekstraktion af total RNA og cDNA-syntese. Revers transkription blev udført under anvendelse af SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Ekspressionsniveauer blev derefter målt for hvert gen af ​​interesse og optimeret til samtidig anvendelse i PCR Array platform ved hjælp af real-time PCR. blev påvist i alt 84 ECM-gener ved anvendelse af ekstracellulære matrix og adhæsionsmolekyler PCR Array (PAH’er-013) (SABioscience, Qiagen, Valencia, CA, USA). Hver plade analyseret ekspressionen af ​​84 gener relateret til ECM, sammen med fem endogene kontroller (vicevært gener), herunder: en genomisk DNA-kontrol, tre kontroller for den reverse transkriptionsreaktion og tre positive kontroller for at teste effektiviteten af ​​PCR-reaktionen

Dataanalyse involverede ΔΔCt metoden ved hjælp af følgende program: https://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php. De gener relateret til multifunktionelle ECM makromolekyler, hver med sin egen særegenhed, blev analyseret for hyperekspression og hypoexpression (f.eks fold ændring eller odds ratio 2), i henhold til tidligere definerede variabler af interesse. Disse gener blev udvalgt til yderligere analyse af væv udtryk.

Konstruktion af væv microarray (TMA) blokerer

paraffinblokke blev snittet (4 um tykkelse) og farvet med hematoxylin-eosin. Alle sektioner blev revideret for at bekræfte en diagnose af CRC, og histopatologiske fund blev revurderet. Et kort blev fremstillet under anvendelse af et Excel-regneark, og det indeholdt de steder og identifikation af vævsprøver, der blev brugt til opførelsen af ​​hvert TMA blok. Kortet også styret yderligere læsninger af IHC reaktioner. TMA blokke blev fremstillet ifølge fabrikantens specifikationer (Beecher Instruments, Silver Spring, MD, USA) med følgende trin: mærkning af det valgte område i den respektive paraffinblokken; skabelse af et hulrum i modtagerblokken; ekstraktion af en cylindrisk væv fra donorblokken (der måler 1 mm i diameter og med det udvalgte respektive område af interesse); overførsel af den cylindriske væv fra donorblokken til det hule rum skabt i modtagerblokken; indsættelse af vævet i blokken i brøkdele af millimeter. Den resulterende samling af vævsprøver havde en matrix arrangement. For at vurdere kvaliteten af ​​hver blok til opbevaring, blev TMA blokkene hver klæbet på et dias ved hjælp af et klæbende tape-system (Instrumedics, Hackensack, NJ, USA). Prøver blev skåret (4 um tykkelse), og en lille rulle blev anvendt til at trykke på afsnittet på båndet. Båndet med den vedhæftede histologisk snit blev derefter anbragt på en harpiks-belagt objektglas (en del af klæbemiddelsystemet kittet) og presses med den samme rulle til bedre overholdelse. Objektglassene blev anbragt under UV-lys i 20 minutter og derefter blev posteriort udsat for en opløsningsmiddelopløsning (TPC) i yderligere 20 minutter. Efter objektglassene blev tørret og båndene blev fjernet, blev objektglassene indlejret i paraffin og sendes til opbevaring under ideelle afkølingsbetingelser.

Immunhistokemisk teknik

Dele af TMA blokke blev monteret på objektglas overtrukne med silan (3-aminopropyltriethoxysilan) og blev tørret i 30 minutter ved 37 ° C. Paraffin blev fjernet med xylen, og snit blev rehydratiseret gennem en række graduerede alkoholer. Endogen peroxidaseaktivitet blev blokeret ved inkubering af sektionerne i et methanolbad indeholdende 3% hydrogenperoxid i 20 minutter, efterfulgt af vaske i destilleret vand. Sektionerne blev oprindeligt indsendt til varme-induceret epitopgenfinding hjælp citrat (pH 9,0) i en udækket trykkoger (Eterna, Nigro, Araraquara, Brasilien). Kort fortalt blev objektglassene nedsænket i pufferopløsningen og trykkogeren blev lukket med sikkerhedsventilen åben. Når den mættede damp blev frigivet, blev sikkerhedsventilen sænket, indtil fuld overtryk var opnået. Efter 4 min af fuld overtryk, blev den lukkede trykkoger placeret under rindende vand til køling. Efter fjernelse af låget blev objektglassene vasket i destilleret rindende vand og endogen peroxidase-aktivitet blev blokeret under anvendelse af 10 volumener af 3% H

2O

2. Efter 3 vaske (10 min hver) blev objektglassene vasket i destilleret rindende vand og derefter i phosphatbufret saltvand (10 mM; pH 7,4) i 5 minutter hver. Objektglassene blev inkuberet med primært antistof natten over ved 8 ° C

Følgende primære antistoffer blev anskaffet fra Abcam (Cambridge, MA, USA): anti-SPARC-antistof, polyklonalt kanin-IgG-isotype (1:. 400; ab14174 ); anti-SPP1 antistof, monoklonalt muse isotype IgG2a (1: 400; ab69498), anti-fibronectin-antistof, muse IgG1-isotype (klon IST-9) (1: 400; ab6328), anti-integrin vs. primært antistof, muse IgG2a ( klon 10F6) (1: 400; ab93943), og anti-integrin versus antistof, isotype muse IgG1, klon 272-17E6 (1: 400; ab16821)

GS og DFS blev defineret som tiden fra. en indledende anatomopathological diagnose indtil patientens død og første gentagelse, henholdsvis.

Statistiske metoder

det statistiske Package for Social Sciences (v18.0) blev anvendt til analyse af data. Signifikansniveauet var 0,05 eller 5%. Kaplan-Meier overlevelse analyser blev udført for at identificere forskelle i GS og DFS for hver kategori af hypo- eller hyperekspression af hver markør. Den log-rank test blev anvendt til at kontrollere, om forskellene var signifikante. Trinvis Cox regressions modeller blev anvendt til at identificere de risikofaktorer forbundet med GS i en multivariat tilstand og derefter blev brugt til at score risikoen for forekomst af dødsfald for hver markør selvstændigt eller i samarbejde. Logistisk regression blev anvendt til at verificere associering mellem De risikoscorer for markører associeret med GS og TNM klassifikation. Brug af variabler, der var signifikant forbundet i den multivariate analyser for GS og DFS blev additive risikoscorer etableret. Disse scoringer blev tildelt for hver kategori af risiko (hyper- eller hypoexpression, afhængigt af markør), og disse lægges sammen til 1. Den resulterende ordinal variabel undergik Cox regression (for GS og DFS) for at kontrollere sammenhængen mellem scoren risiko skabt og de respektive afhængige variabler.

Resultater

univariate analyser af GS i forhold til ECM markører undersøgt

tabel 1 viser de kliniske karakteristika og parametrene for formidling tumor for 114 patienter ifølge den foreliggende kohorte. Væsentlige forskelle i GS blev identificeret i forhold til udtrykket profiler af ITGAV1, ITGA3, ITGA6, SPARC, MMP9 og MMP16, markører, der blev opdaget i tumorprøver undersøgte. For SPARC, blev hyperekspression forbundet med en højere grad af overlevelse. I modsætning hertil blev hyperekspression af de andre markører forbundet med lavere niveauer af GS. Figur 1 viser GS kurver, der blev opnået i henhold til status for hver signifikant associeret markør. Tabel 2 lister resultaterne af Kaplan-Meier overlevelse analyser i forhold til GS og udtryk for markørerne undersøgt. Vejviser

Multivariate analyser af GS i forhold til ECM markører undersøgt

De variabler signifikant forbundet med GS blev analyseret i en trinvis Cox regressionsmodel. Tabel 3 viser resultaterne af den multivariate analyse med GS anvendes som den afhængige variabel og de associerede markører, der anvendes som uafhængige variable.

Model 5 viser, at de variable ITGAV og ITGA6 signifikant var forbundet med GS. Desuden hyperekspression af disse markører var forbundet med en større risiko for død i den periode undersøgt (hazard ratio (HR) = 3209 ,; 95% konfidensinterval (CI) = 1,412-7,293, p = 0,005 og HR = 3,105, 95% CI = 1,367-7,055, p = 0,007, henholdsvis).

univariate analyser af DFS i forhold til ECM markører undersøgt

tabel 4 viser resultaterne for Kaplan-Meier overlevelse analyse udført for DFS i forhold til udtrykket af de undersøgte markører. Signifikante forskelle i DFS blev observeret i forhold til ekspression af ITGAV og ITGA3, med hyperekspression er forbundet med lavere niveauer af DFS (fig 2). Parametre for SPARC markør blev ikke beregnet, da der ikke var nogen tilbagefald begivenheder i hypoexpression gruppen.

Multivariate analyser af DFS i forhold til ECM markører undersøgte

Model 2 i tabel 5 viser, at kun ITGA3 var signifikant associeret med DFS. Hyperekspression af denne markør var forbundet med en højere risiko for recidiv i den periode undersøgt (HR = 3,806, 95% CI = 1,573-9,209, p = 0,003). Analyser af score for DFS blev ikke udført, da kun ét gen (ITGA3) opretholdt en signifikant sammenhæng.

Beregning af risiko score på grundlag af resultaterne af den multivariate model og en sammenligning af resultaterne

En risiko scoresystem blev oprettet på grundlag af resultaterne af den multivariate analyse af de væsentlige variable, at kontrollere, om tilstedeværelsen af ​​0, 1, eller 2 af de associerede markører påvirkede risikoen for død (tabel 6). For hver markør for risikoen for, at blev hyperexpressed blev en enhed føjet til score. Efter etablering denne skala blev resultaterne (ordenstal kategoriske variabler) sammenlignet med GS ved hjælp af log-rank test og Cox regressionsanalyse (figur 3, tabel 6). blev observeret Et mønster af association mellem antallet af hyperexpressing markører og GS (tabel 7), med en god forening observeret mellem tilstedeværelsen af ​​en eller to markører og evnen til at forudsige GS (tabel 7).

Beregning af sammenhængen mellem prognostisk score og TNM

pointsystemet, der blev udviklet baseret på påvisning af ingen, en eller begge af ITGAV og ITGA6 markører bliver hyperexpressed blev fundet at have den største effekt på GS. Vi ønskede at kontrollere en sammenhæng mellem dette pointsystem og TNM gennem logistisk regression. Tabel 8 viser de sager med hyperekspression af begge mærker, og de blev forbundet med en 33,5 gange højere chance tilhørsforhold til TIII + IV TNM kategori. Men eftersom der var ingen patienter, som var både fase TIII + TIV og at hyperexpressed enhver af markørerne analyseret, tilfælde med hyperekspression af 0 gener og de tilfælde med hyperekspression af 1-genet blev kombineret og blev sammenlignet med de tilfælde med hyperekspression af 2 gener (tabel 9).

Endelig, for at kontrollere, om TNM stadie kan tjene som en indikator for overlevelse blev en overlevelse analyse udført i forhold til TNM kategori (i + II vs. III + IV) (tabel 10, figur 4). Tabel 10 verificerer, at patienter med en fase III + IV tumor havde en 4,838 gange højere risiko for at dø (HR = 4,838).

Diskussion

kapacitet til en malign tumor for at migrere og spreder sig til andre væv og organer bestemmes af forskellige molekyler, herunder proteolytiske enzymer, adhæsionsmolekyler, cellereceptorer, cytokiner og vækstfaktorer. Dette indebærer et komplekst system af signaltransduktion til cellekernen via membranen og intracellulære molekyler receptorer, der sender feedback fra ECM, hvilket resulterer i aktiveringen og syntese af transkriptionsfaktorer for forskellige gener. [21] mere tyder, at genetiske ændringer er ansvarlige for den hurtige progression af forskellige typer af maligne tumorer fra de indledende faser af sygdommen til fremskredne stadier af sygdommen. Der er fremsat hypotese, at denne proces er indledt af molekyler, som unormalt signal at aktivere gener, der påvirker udbredelsen og metastase. Identifikationen af ​​sådanne molekyler og deres ændrede strukturer, samt deres tilknytning til kliniske stadier og patologi, kan afklare de mekanismer involveret i carcinogenese, og derfor bør de grupper af gener involveret i denne proces.

Ifølge Koivisto et al. (2000), kan ECM påvirke adfærden hos en neoplasme ved at øge tumorcelleproliferation, progression, og invasion. Disse interaktioner medieres af integriner, som har vist sig at spille en vigtig rolle i udviklingen af ​​tumorinvasion og metastase. Nedbrydning af ECM er også blevet rapporteret at forekomme via virkningen af ​​proteolytiske enzymer, der hovedsagelig produceres af tumorceller, men kan også aktiveres ved stromale fibroblaster. [22]

I den foreliggende undersøgelse blev interaktioner mellem patientens tumorceller og ECM kendetegnet baseret på identifikation af hypo- eller hyperexpressed gener, med den hypotese, at disse gener kan være vigtigt til forudsigelse prognose og patientoverlevelse . For at profilere genekspression blev Super Array Kit (PAH-031A-24, AMBRIEX) anvendes til at detektere ekspressionsniveauerne af ECM og celleadhæsionsmolekyler (n = 84), som er vigtige for celle-celle- og celle-matrix-interaktioner. Dette sæt gener omfattede proteiner fra ECM, der repræsenterer vigtige bestanddele af basalmembranen. Real-time PCR gav en hurtig, enkel og pålidelig metode til analyse af ekspression af en gruppe af proteiner involveret i processen for tumorprogression og formidling af colorektal adenocarcinom i dens forskellige faser af mellemstationer. I kombination med immunhistokemiske data blev identifikationen af ​​associationer mellem parametrene for tumor progression og udtrykket profil hypo- eller hyperexpressed gener forventes at give indsigt i tumor progression og formidling. Det andet mål med dette studie var at bygge en matematisk model eller et pointsystem, der giver mulighed for at identificere (selv i den præ-operative periode med analysen af ​​endoskopiske biopsier) af patienter med en dårlig prognose. Hvis pålidelige, vil denne model tillade differentierede terapier, der skal udvælges patienter baseret på en bedre eller dårligere prognose.

Integriner er celleoverflade heterodimere receptorer der er sammensat af a- og β transmembrane underenheder. Hver underenhed omfatter et stort ekstracellulært transmembrandomæne og et intracellulært domæne. [23] celleadhæsion interaktioner spiller en vigtig rolle under normale fysiologiske processer såsom fosterudvikling og vævsheling, og også under patologiske processer, såsom cancer. [24] Med hensyn til sidstnævnte Zhang et. al (2011) påviste, at integriner spiller en rolle i flere trin i carcinogenese, herunder formidling celle, celle invasion af tilstødende væv, og celleoverlevelse. De spiller også en regulerende rolle i celle overlevelse og apoptose, hvilket vil fremme væksten af ​​tumorvæv og processen med metastase. Tilsvarende har antineoplastisk terapeutisk potentiale blevet identificeret for forskellige integrinantagonister, såsom α5β1, avp3, og αVβ5, og disse er på forsøgsstadiet af undersøgelsen. [25] højere ekspression af disse integriner er forbundet med større migration og invasion af kræftceller, og er også forbundet med forøget resistens over for antineoplastiske lægemidler. I modsætning hertil kan lavere niveauer af ekspression af visse integriner, såsom α2β1 og α1β1, efter tumorceller favorisere celle diffusion. Ud over ændringer i udtryk, har ændringer i funktionen af ​​disse integriner vist sig at spille en afgørende rolle i udviklingen af ​​kræft. [19,26]

I den foreliggende undersøgelse viste univariate analyser en statistisk signifikant sammenhæng mellem hyperekspression af integriner, ITGAV, ITGA3, og ITGA6 og MMP9 og MMP11 gener. Desuden blev hypoexpression af SPARC gen associeret med en reduktion i GS af CRC cancerpatienter (tabel 2, figur 1-4). Men i den flerdimensionale model, kun hyperekspression af ITGAV og ITGA6 integriner blev forbundet med en større risiko for død i den periode undersøgt (HR = 3,209, 95% konfidensinterval = 1,412-7,293, p = 0,005 og HR = 3.105, 95% CI = 1,367-7,055, p = 0,007, henholdsvis) (tabel 3).

α5β1, α6β4, avp3, og αvβ6 integriner er blevet bredt undersøgt i maligne tumorer, og deres niveauer af ekspression har korreleret med progression af forskellige typer tumorer. [27-28] Andre undersøgelser har identificeret integrin udtryk som faktorer for udbredelsen og prognose af CRC patienter. For eksempel har hepatisk formidling vist sig at afhænge af interaktioner mellem αVβ6 integriner udtrykkes af tumorceller og fibronectin markør for hepatisk mikrovaskulatur. [29] Desuden levermetastaser er blevet forbundet med den β1 integrin [23], mens avancerede kliniske stadier og venøse og perineural invasion har været forbundet med hyperekspression over for av integriner. [19,20,30] For pulmonale metastaser udtrykker p1 og p2 integriner (f.eks α2β1, α4β1, a5p1, og αLbα2) [31], en dårligere prognose var forbundet med hyperekspression af avp3 og av integriner. [32,33]

I en tidligere publikation, vores gruppe identificeret en sammenhæng mellem hyperekspression af ITGAV gen i tumorer og tilstedeværelsen af ​​perineurale invasion i kolorektale tumorer. [19] Tilsvarende viste histokemiske analyser, som denne markør blev hyperexpressed i 100% af patienter med fjernmetastaser, og blev hyperexpressed i 36,7% af patienter uden fjernmetastaser. [19] Desuden viste den multivariate analyse, at tumorer med lymfeknude metastaser havde en 108 gange større chance for hyperexpressing ITGAV end tumorerne uden lymfeknude metastaser. [19]

Forøget ekspression af ITAG6 blev også påvist i nærvær af venøs invasion sammenlignet med fraværet af venøs invasion (p 0,04). [19] Disse resultater tyder på, at øget udtryk for denne integrin fremmer udbredelsen tumor. Tilsvarende i sammenligne scorer på histologiske analyser udført i den foreliggende undersøgelse, blev korrelationer mellem tumortype (mucinøs eller adenocarcinomer NOS) og ITGA5 og ITGA6 integriner observeret (p 0,001). En højere procentdel af mucinøs typen histologi prøver modtog også en score på 2 oftere end de adenocarcinom NOS prøverne.

a6 integrin regulerer forskellige cellefunktioner, herunder fremkaldelse af celle invasion, migration, tumorceller, og tumor progression. [34] På den anden side, O’Connor et al. (2000) rapporterede, at lavere niveauer af α6 ekspression korreleret med en forøget vandrende og invasive potentiale for colon cancerceller. [35] Vi hypotese, at de processer, der muliggør en tumor celle at undslippe celle- og væv indeslutning mekanismer, og at også letter dens vækst, udbredelse, og deraf følgende kolonisering af sekundære væv, skyldes aktiveringen (hypo- eller hyperekspression) af flere gener samtidigt, og disse virker ved at overvinde en værtens beskyttende barrierer. Således er formålet med den foreliggende undersøgelse var at udvikle en multivariat matematisk model af hypo- eller hyperekspression af gener relateret til neoplastisk udbredelse, for at give den mest nøjagtige udstrakte kortlægning af de processer, der forekommer samtidigt under tumorprogression, og at påvirker prognosen. Den endelige multivariate prognostisk model opnået bestod af ITGAV og ITGA6 integriner, som viste sig at korrelere med GS, derved antyder, at hyperekspression af disse gener udgør en selvstændig indsats for at begrænse overlevelsen af ​​kolorektale tumor patienter. Resultaterne af vores multivariat model også korrelerer med resultaterne af tidligere univariate undersøgelser, der har beskrevet en sammenhæng mellem ITGAV integrin og tilstedeværelsen af ​​fjernmetastaser, lymfeknudemetastaser, og perineurale invasion. [20] Desuden ekspression af ITAG6 integrin er blevet forbundet med en mucinøs histologisk type (som har en dårligere prognose) og med venøs invasion. [19] Baseret på disse resultater, vi hypotese, at disse to integriner handle på forskellige processer, og at de kan handle uafhængigt, eller kollektivt, for at fremme udbredelsen tumor og progression, og dermed kompromittere patientens prognose (f.eks GS).